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生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
携带人 N FBD 1基因 shRNA重组
逆转录病毒载体的构建及鉴定
程莉　袁成福　黄秀凝　卜友泉　易发平　刘革力　汪长东　宋方洲
(重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心 ,重庆 400016)
　　摘 　要 : 　建立逆转录病毒介导的 N FBD1基因 RNA干扰表达体系 ,并观察其在宫颈癌 SiHa细胞中对 N FBD1表达的影
响。将人 N FBD1基因 RNA干扰双链 DNA片段重组到 pSUPER Retro质粒中 ,构建携带人 NFBD1基因 RNA干扰的逆转录病
毒载体 pSUPER2shRNA2NFBD1,经 PT67细胞包装后 ,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株 SiHa细胞 ,并用嘌呤霉素筛选
产生稳定的细胞克隆 ,用实时荧光定量 PCR和 W esternblotting检测细胞中 N FBD1 mRNA和蛋白表达的变化。重组逆转录病
毒质粒经测序鉴定正确 ;逆转录病毒感染 SiHa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆 ;实时荧光定量 PCR和 W esternblot2
ting检测人 N FBD1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。携带人 N FBD1基因 RNA干扰双链 DNA片段的
逆转录病毒感染 SiHa细胞后能明显抑制 N FBD1 mRNA和蛋白表达 ,为进一步研究 N FBD1在宫颈癌中的作用奠定了基础。
关键词 : 　逆转录病毒载体 　shRNA　N FBD1基因 　宫颈癌
Construction and Identif ication of Recombinant Retrovirus
Vector Expressing shRNA Targeting Human N FBD1 Gene
Cheng L i　Yuan Chengfu　Huang Xiuning　Bu Youquan　Yi Fap ing　L iu Geli　W ang Changdong　Song Fangzhou
(M olecularM edicine & Cancer Research Center, Chongqing M edical University, Chongqing 400016)
　　Abs trac t: 　 It was to construct a retrovirus2mediated exp ression system containing double strands DNA for RNA interference on nu2
clear factor with BRCT domains p rotein 1 (NFBD1) , and study its influence on the exp ression of NFBD1 in SiHa cells. A recombinant
retrovirus vector pSUPER2shRNA2NFBD1 was generated by cloning a double strands DNA for RNA interference on human N FBD1 into
pSUPER Retro vector. SiHa cells were infected with virus supernant from the PT67 clones, and stable SiHa cell clones were generated
after screening with puromycin. N FBD1 mRNA and p rotein of stable infected SiHa cells were exam ined by Real time PCR and W estern
blotting. The pSUPER2shRNA2NFBD1 recombinant retrovirus vector had been constructed correctly after sequencing. Stable infected
SiHa cell clones were generated after screening with puromycin, and N FBD1 mRNA and p rotein of infected cells decreased significant2
ly. The pSUPER2shRNA2NFBD1 retrovirus vector showed effective inhibition on the exp ression of NFBD1 at mRNA and p rotein levels,
which would establish a favourable foundation for further study on the function of NFBD1 in cervical cancer.
Key wo rds: 　Retrovirus vector　shRNA　N FBD1 gene　Cervical cancer
收稿日期 : 2009205204
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 ( 30872758 ) ,教育部博士点基金资助项目 ( 20070631011 ) ,重庆市科委自然科学基金资助项目
(2007BB5302)
作者简介 :程莉 (19862) ,女 ,重庆人 ,硕士研究生 ,主要研究方向 :肿瘤分子生物 ; E2mail: yuancf46@163. com
通讯作者 :宋方洲 ,教授 , E2mail: fzsongcq@ yahoo. cn　　NFBD1 ( nuclear factor with BRCT domains p ro2tein 1) ,也称 MDC1 (mediator of DNA damage check2point p rotein 1) ,最早是由日本 Kazusa DNA研究所在超长 cDNA库大规模测序中发现 ,其编号为 KI2AA0170 (因此 ,该基因早期也命名为 KIAA0170) ,得 到的 cDNA长度为 6 940 bp [ 1 ]。进一步研究发现该基因定位于染色体 6p21. 31,由 14个外显子和 13个内含子组成。其蛋白由 2 089个氨基酸组成 ,分子量高达 227 kD;分子中包含 N端的 FHA ( forkheadassociated)结构域、C端的 BRCT ( breast cancer sus2
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
cep tibility gene 1 carboxyl term inus)结构域和中间的
PST(p roline / serine / threonine)结构域 [ 2 ]。
目前国际上对 NFBD1的功能研究处于刚刚起
始阶段 ,现有的研究结果表明 NFBD1是一个参与
DNA损伤后细胞应答通路的重要分子 [ 3 ] ,它在 DNA
损伤后发生磷酸化 ,并和参与 DNA损伤后的修复和
DNA损伤检测点信号途径中的多个蛋白相互作用 ,
从而介导 DNA损伤修复或细胞凋亡 [ 4 ]。然而 DNA
损伤应答是机体早期抵抗肿瘤发生的重要防线 [ 5 ] ,
鉴于 NFBD1在 DNA损伤应答中的重要作用 ,有学
者猜测 NFBD1可能在肿瘤发生中也具有重要作用。
建立逆转录病毒介导的 N FBD1 基因 RNA 干扰体
系 ,并观察其在宫颈癌 SiHa细胞中对 N FBD1基因
表达的抑制作用 ,为进一步研究 N FBD1在宫颈癌中
的作用奠定基础。
1　材料与方法
111　材料
PT67细胞购自 Clontech公司 ;限制性内切酶
类、T4 DNA连接酶及荧光定量 PCR试剂盒购自大
连宝生物公司 ; L ipofectam ine2000转染试剂及 Trizol
购自美国 Invitrogen公司 ;质粒提取试剂盒购自 O2
mega公司 ; puromycin购自 Sigma公司 ; NFBD1一抗
购自 Abcam公司 ; HRP标记的 IgG二抗购自北京鼎
国生物技术公司。感受态 E. coli DH5α、pSUPER
Retro载体及 SiHa细胞由本研究室保存。
112　shRNA靶序列的设计及合成
根据 shRNA设计原则及 N FBD1 (登录号 : NM _
014641) mRNA序列 ,使用 Dharmacon公司在线设计
工具针对 N FBD1基因编码区设计特异性序列共 2
对 4条。分别命名为 NFBD1干扰 1、NFBD1干扰 2、
另设计一条阴性对照序列。经过 BLASTN比对分析
与人类其他基因编码序列无同源性。按如下结构设
计 : B am H Ⅰ + Sense + Loop + Antisense +终止信号
+ H indⅢ。中间径环结构为 9个核苷酸 ,其序列 :
TTCAAGAGA。将所选择的片段呈反向互补加到茎
环序列的两端 ,在正义链和反义链的 5′端分别加上
限制酶 B am H I和 H indⅢ酶切位点 , 3′端酶切位点之
前加入 polⅢ启动子终止信号 TTTTTT。具体序列见
表 1。序列经上海生工生物工程技术有限公司
合成。
表 1　shRNA干扰序列
shRNA 序列
NFBD1干扰 1 5′2gatccGAAGACAACTATGGTGATTTTCAAGAGAAATCACCATAGTTGTCTTCTTTTTTGGAAa23′
3′2gCTTCTGTTGATACCACTAAAAGTTCTCTTTAGTGGTATCAACAGAAGAAAAAACCTTttcga25′
NFBD1干扰 2 5′2gatccGAAACAGGACAGAGAACAATTCAAGAGA TTGTTCTCTGTCCTGTTTCTTTTTTGGAAa23′3′2gCTTTGTCCTGTCTCTTGTTAAGTTCTCTAACAAGAGACAGGACAAAGAAAAAACCTTttcga25′
阴性对照 5′2gatccTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTGGAAa23′3′2gAAGAGGCTTGCACAGTGCAAAGTTCTCTTGCACTGTGCAAGCCTCTTAAAAAACCTTttcga25′
　注 :序列两端的小写字母表示酶切位点 ;斜体字母表示茎环结构序列
113　重组逆转录病毒质粒的构建
取合成的单链正义和反义 shRNA模板分别溶
解 ,取等量正义和反义模板寡核苷酸及 1 ×DNA退
火缓冲液 ,混匀后 95℃加热 2 m in,缓慢冷却至室
温 ,形成 5′端和 3′端分别为 B am HⅠ和 H indⅢ粘性
末端的双链 DNA。取 pSUPER Retro空质粒 (图 1,
表 2)用 B glⅡ和 H indⅢ于 37℃水浴酶切 4 h,酶切
后进行载体胶回收。将退火后的双链 shRNA模板
与线性化载体于 16℃连接过夜 ,以连接产物转化
E. coli DH5α感受态细菌 ,涂布于含 Amp抗性的 LB
平板上 , 37℃恒温培养箱培养过夜 ,挑取单克隆菌落
接种于含 Amp抗性的 LB培养液中 , 37℃恒温摇床
培养过夜 ,收集菌液 ,小量快速抽提重组质粒 ,送上
海生工测序鉴定插入模板是否正确。测序鉴定正确
的质粒分别命名为 pSUPER2shRNA2NFBD121, pSU2
PER2shRNA2NFBD122及阴性对照质粒。
114　逆转录病毒的制备及感染 SiHa细胞
将 PT67细胞种植于 10 cm细胞培养盘中 (约 1
×107 个细胞 ) ,培养过夜后 ,将测序正确的干扰质
粒及阴性对照质粒各 10μg经 L ipofectam ine2000转
染到 PT67细胞中 ,具体操作按使用说明书进行。
7 2 h后 ,收集病毒上清并用 0. 4 5μm孔径的滤器
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图 1　pSUPER Retro载体图谱
表 2　PSUPER Retro载体主要位点及其特点
主要位点 质粒特点
B glll: 1447 PGK p romoter: 1669～2177
H indlll: 1441 Puro ORF: 2202～2801
EcoR I: 1668 H1 p romoter: 1420～1668
Sall: 1426 Amp icillin resistance ORF: 4558～5415
Xhol: 1420 3′delta LTR: 2931～3224
5′LTR: 1～515 ( homologous to otherMSCV LTR)
引物序列 5′2GGAAGCCTTGGCTTTTG23′结合位点 : 1241～1257
(M illipore) 过滤 , 滤液按 4 μg/m l加入 polybrene
( Sigma) ,混匀后将滤液加入到提前 1 d种植到六孔
细胞培养板中的 SiHa细胞 (4 ×105 /孔 ) ,每隔 12 h
更换滤液 ,重复感染 3～4次后 ,用不含病毒上清的
正常培养基培养细胞 , 24 h后用含 0. 65μg/m l puro2
mycin的培养基培养细胞 ,每隔 3天更换培养基 ,直
到没有感染病毒的孔中 SiHa细胞完全死亡 ,表明抗
生素筛选完成。收集存活的细胞并扩增培养。
115　Real time PCR检测 NFBD1 mRNA表达水平的
变化
将上述扩增培养的细胞按试剂盒说明书提取总
RNA,紫外分光光度计定量 ,以随机引物在 MMLV逆
转录酶作用下进行逆转录合成 cDNA后进行 Real
time PCR反应。反应体系 : SYBR Prem ix Ex TaqTM (2
×) 12. 5μl, PCR上下游引物 (10μM )各 0. 1μl, cD2
NA模板 2μl, ROX Reference DyeⅡ(50 ×) 0. 5μl,灭
菌水补充到总体积为 25μl。PCR引物序列如下 : NF2
BD1 (产物长度 240 bp )引物正义链 : 5′2AGCAAC2
CCCAGTTGTCATTC23′,反义链 : 5′2TCAGATGTGCCA
AAGTCAGC23′; GAPDH (产物长度 227 bp )引物正义
链 : 5′2ACCTGACCTGCCGTCTA2GAA23′,反义链 : 5′2TC
CACCACCCTGTTGCTGTA23′。将反应物混匀后放入
Real time PCR仪 ( iQ5型 )进行反应 ,反应程序 : 94℃
变性 5 m in; 94℃ 10 s, 60℃ 30 s,共 40个循环 ,相同试
验重复 3次。
116　W estern blotting检测 NFBD1蛋白水平的表达
细胞用 PBS清洗后加入裂解液提取蛋白 ,用
B radford法定量后 ,取 15μg处理的蛋白样品进行
SDS2PAGE电泳并电转移至 PVDF膜上 , 5%脱脂奶
粉室温振荡封闭 1 h,与 1∶500稀释的 NFBD1一抗
4℃孵育过夜 , PBST洗膜 3次 , 10 m in /次 ,再与 HRP
标记的 IgG (1∶50 000)二抗室温孵育 2 h, PBST洗
膜 3次 , 10 m in /次 ,用化学发光法检测蛋白表达。
以β2actin作为参照。相同实验重复 3次。
117　统计学分析
采用统计软件 SPSS11. 5分析 ,实验数据均以 €x
±s表示 ,多组间参数采用单因素方差分析。
2　结果
211　重组逆转录病毒质粒的构建及测序鉴定
构建的 pSUPER2shRNA2NFBD1重组逆转录病
毒质粒 ,经转化感受态 E. coli DH5α扩增后送上海
生工测序鉴定 ,结果证实插入的碱基序列与设计的
DNA序列完全一致 ,无碱基突变。测序结果见图 2。
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图 2　重组逆转录病毒质粒 pSUPER2shRNA2NFBD1测序结果
212　逆转录病毒感染 SiHa细胞
pSUPER2shRNA2NFBD1及阴性对照质粒转染
PT67包装细胞 ,收集病毒上清滤液感染 SiHa细胞
后 ,均出现 puromycin抗性克隆 ,而没有感染的 SiHa
细胞完全死亡。
213　RNA i逆转录病毒作用后 SiHa细胞中 N FBD1
mRNA表达变化
SiHa细胞经 pSUPER2shRNA2NFBD1及阴性对
照组逆转录病毒作用后生成的细胞克隆扩增培养后
提取总 RNA ,逆转录为 cDNA 后用特异性引物行
Real time PCR反应。利用 22△△Ct法对结果进行分
析 ,结果见表 3。
表 3　实时定量 PCR检测 N FBD 1 m RNA的表达变化
组别 NFBD1 Mean (Ct) GAPDH Mean (Ct) 2 - △△Ct
pSUPER2shR
NA2NFBD121 24. 13 ±0. 35 16. 62 ±0. 02 0. 37 ±0. 11ab
pSUPER2shR
NA2NFBD122 24. 32 ±0. 50 16. 84 ±0. 05 0. 39 ±0. 19ab
阴性对照组 24. 66 ±0. 39 18. 32 ±0. 39 0. 86 ±0. 09
正常组 24. 64 ±0. 14 18. 60 ±0. 09 1. 00 ±0. 00
a p < 0. 01,与正常组相比较 , b p < 0. 01,与阴性对照组相比
统计分析结果显示 : pSUPER2shRNA2NFBD121
组及 pSUPER2shRNA2NFBD122组 NFBD1的 2 - △△Ct
值较正常组及阴性对照组明显降低 ,差别具有统计
学意义 ( P < 0. 01)。阴性对照组与正常组比较 ,差
别无统计学意义 ( P > 0. 05)。结果表明经逆转录病
毒介导的 RNA干扰作用后 , N FBD1在 mRNA水平
的表达明显降低。
214　RNA i逆转录病毒作用后 SiHa细胞中 NFBD1
蛋白表达变化
SiHa细胞经 pSUPER2shRNA2NFBD1及阴性对
照组逆转录病毒作用后生成的细胞克隆扩增培养
后 ,提取细胞总蛋白进行常规 SDS2PAGE后行 W est2
ern blotting检测 ,结果各组均能检测到 NFBD1和β2
actin蛋白。其中 pSUPER2shRNA2NFBD121及 pSU2
PER2shRNA2NFBD122组与阴性对照及正常组比较 ,
NFBD1条带明显减弱 (图 3) ;相同试验重复 3次 ,
结果一致。结果表明经逆转录病毒介导的 RNA干
扰作用后 , NFBD1在蛋白水平的表达明显降低。
1. pSUPER2shRNA2NFBD121组 ; 2. pSUPER2shR
NA2NFBD122组 ; 3. 阴性对照组 ; 4. 正常组
图 3　W estern blotting检测 RNA i逆转录病毒
感染的 S iHa细胞中人 NFBD1蛋白的表达
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3　讨论
宫颈癌是严重威害妇女健康的恶性肿瘤之一。
传统治疗方法以手术、化疗及放疗为主 ,但患者生存
率仍不理想。因此 ,结合最新分子生物学的研究成
果 ,研究新的宫颈癌诊断及防治方法具有重要的理
论及现实意义。
NFBD1的功能研究目前是国际上一个活跃的
热点 ,目前的研究主要集中在 NFBD1在 DNA损伤
应答中的分子功能理论研究 ,而对于 NFBD1在肿瘤
中的作用研究大多处于推测中。来自丹麦的一个研
究小组检测了 NFBD1在乳腺癌、肺癌和睾丸生殖细
胞瘤等肿瘤组织中的表达情况 ,结果发现 :与癌旁正
常组织相比 , NFBD1在乳腺癌和肺癌组织中表达异
常降低甚至缺失 ,而在睾丸生殖细胞瘤组织中 ,并没
有观察到 NFBD1 的表达异常降低甚至缺失的情
况 [ 6 ] ,这说明 NFBD1在肿瘤的发生发展中可能具有
作用。Nakanishi等 [ 7 ]也发现 N FBD1可以和著名的
肿瘤抑制基因 (抑癌基因 ) P53相互结合并抑制 P53
的抑癌功能。本课题组卜友泉博士 [ 8 ]前期用化学
合成的 N FBD1 siRNA介导 N FBD1基因表达沉默后
显著抑制宫颈癌 HeLa细胞的生长增殖 ,同时诱发
了 HeLa细胞的 G2 /M期停滞和细胞凋亡的出现 ,这
提示 NFBD1参与 HeLa细胞的生长增殖和凋亡的调
控。这些研究结果表明 NFBD1可能在宫颈癌的发
生发展中具有重要作用。
RNA i( RNA interference, RNA i)是近年发展起
来的一项新的分子生物学技术 ,主要由双链 RNA
( double2stranded RNA, dsRNA )引发的转录后基因
沉默机制 ,与基因替代、反义寡核苷酸等技术相比 ,
RNA i技术可以简单、有效、特异地下调细胞中靶基
因表达 ,因此是研究基因功能的一种有力工具。
由于逆转录病毒载体能将外源基因有效地整合
到宿主细胞基因组中 ,并随细胞分裂而传给后代 ,而
且未经包装时为缺陷性病毒不具有完整功能 ,只有
经包装细胞系为其提供结构蛋白组分 ,二者相互补
偿后才能包装成具有完整功能的病毒颗粒 ,因此仅
能在包装细胞系中扩增 ,感染靶细胞后不能扩增 ,具
有很高的安全性 [ 9 ] ,是目前基因转移中应用较为广
泛的一类载体。本研究采用的 4UPER Retro载体是
能携带 siRNA片段的逆转录病毒载体 ,全长 6 349
bp,由 H1启动子启动 ,两端分别带有 B glⅡ、H indⅢ
酶切位点 ,能将目的 siRNA片段有效转染入哺乳动
物细胞并整合到宿主细胞基因组中 ,由于带有嘌呤
霉素抗性 ,因此能对表达重组 DNA的细胞进行有效
筛选 ,使用比较方便。本研究中成功构建针对人
N FBD1基因特异的 RNA i逆转录病毒载体 pSUPER2
shRNA2NFBD1,经 PT67细胞包装成具有完整功能
的病毒颗粒后 ,感染 SiHa细胞 ,建立稳定表达 siR2
NA的 SiHa细胞系。结果能在 mRNA和蛋白水平
有效抑制 NFBD1的表达 ,为进一步在体外和体内研
究 NFBD1在宫颈癌中确切作用奠定了良好的实验
基础。
参 考 文 献
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