全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
MAR介导的逆转录病毒包装细胞系的建立
张靖 1 王天云 2 张俊河 2 杨保胜2 张继红 2
( 1新乡医学院三全学院生命科学技术系,新乡 453003; 2新乡医学院生物化学与分子生物学教研室,新乡 453003)
摘 要: 根据 GenBank登录的序列号,使用 pr im er5 0进行引物设计, 提取人的外周血基因组 DNA为模板, PCR方法扩
增出人 珠蛋白 MAR序列, 将 MAR序列插入到逆转录病毒表达载体 pLXSN, 构建 MAR序列介导的逆转录病毒载体。酶切
和测序鉴定后, 阳离子聚合物转染 PA317细胞, G418筛选出阳性细胞克隆,提取病毒液上清, 测定逆转录病毒颗粒滴度, 逆转
录病毒颗粒的最高滴度为 16 106 CFU /mL,成功建立了 MAR介导的逆转录病毒包装细胞系。
关键词: 核基质结合区 逆转录病毒载体 包装细胞系
Construction ofMARmediated Retroviral Packaging Cell L ine
Zhang Jing
1 W angT ianyun2 Zhang Junhe2 Yang Baosheng2 Zhang Jihong2
(
1
San QuanM ed ical College, X inx iang M edical University, X inx iang 453003;
2
D epartm ent of
B iochem istry andM olecular Biology, X inxiangM edical University, X inx iang 453003)
Abstrac:t Theg lob inMAR was am plified through PCR using the pr im er5 0 designed accord ing to theGenBank sequence. The
hum an genom icDNA was ex tracted from hum an blood. The clonedg lobinMAR fragment was inserted in to pLXSN vector to construct
theMARmed iated retrov ira l v ec to rs. A fter iden tification by restr ic tion enzym e d igestion and DNA sequenc ing, the recomb inants w ere
transfected into PA317 ce lls through pos itive ion liposom em ethod. Pos itive cells w ere screened by G418, and v ira l titers in supernatants
w as harvested from culturem ed ia of G418 res istant transfected ce l.l Result showed that the h ighest v ira l tite rs is 16 106CFU /mL, and
packag ing cell linew as established.
Key words: Scaffo ld m atr ix a ttachment reg ion Retrov ira l vec to r Packag ing ce ll line
收稿日期: 20100504
基金项目:河南省科技厅科技攻关项目 ( 0624410041)
作者简介:张靖,女,硕士研究生,研究方向:真核基因表达调控与基因工程; Em ai:l t ian _827@ yahoo. com. cn
通讯作者:王天云,男,博士,副教授,硕士生导师,研究方向:基因表达调控与基因工程; Em ai:l w ty@ xxm u. edu. cn
随着转基因技术在各个应用领域的深入和发展,
转基因沉默现象也引起人们越来越多的关注 [ 1]。转
基因沉默是指转入并整合到受体基因组中的外源基
因在当代或后代中表达活性受到抑制的现象。如何
增加外源基因在宿主细胞中的稳定性和独立性,并有
效克服转基因失活、提高转基因的表达效率,是基因
工程领域急需解决的课题之一。近年来,人们利用核
基质结合区 (matrix attachment reg ion, MAR)来克服外
源基因沉默,提高外源基因在真核生物细胞中表达水
平 [ 2- 4]。MAR序列, 亦称核骨架结合区 ( scaffo ld at
tachment reg ion, SAR ), 是真核生物细胞内染色质上
可与细胞核基质结合的一段特殊 DNA序列。近年来
的研究发现,将 MAR构建到外源基因的两侧,能明显
提高外源基因的表达水平,降低转基因沉默, 同时还
能使染色质形成环状结构, 也可以作为 DNA复制的
起始点或者调控基因的转录 [ 5- 8]。
目前,随着基因治疗的深入开展,建立安全高效
的基因转移载体系统成为至关重要的研究课题。病
毒载体系统中的逆转录病毒载体是应用最广泛的基
因转移系统。该系统包括重组逆转录病毒载体和包
装细胞两部分,当逆转录病毒载体进入包装细胞后,
即可包装出完整的逆转录病毒。此外,一个拷贝的
重组逆转录病毒基因在一个包装细胞内,可以成千
上万倍地得以复制以便使用 [ 9]。逆转录病毒载体
在理论上可使外源基因达到长期的表达,但在基因
治疗中存在的主要问题之一是其介导的外源基因的
2010年第 12期 张靖等: MAR介导的逆转录病毒包装细胞系的建立
沉默问题 [ 10]。据报道 MAR序列能明显提高外源基
因的表达水平, 降低转基因沉默。本研究为克服逆
转录病毒介导的外源基因的沉默, 提高逆转录病毒
pLXSN载体介导的转基因的表达, 构建了 MAR介
导的逆转录病毒载体 pLXSNMAR ca,t旨在筛选出高
滴度缺陷型逆转录病毒的产毒细胞系。
1 材料和方法
1. 1 试验材料
DNA聚合酶、限制性内切酶、pMD18T 载体,
PCR试剂均购自 TaK aRa公司。大肠杆菌 ( E sche
richia coli ) JM 109、pLXSN质粒载体、PA317细胞均
为本实验室保存。梭华sofast基因转染试剂盒购于
厦门太阳马生物工程有限公司, G418以及基因组
DNA提取试剂盒购自于索莱宝公司, 胎牛血清购自
于杭州四季青生物制品公司, DMEM细胞培养基购
自美国 G ibco BRL公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 珠蛋白 MAR的扩增 根据 GenBank报道
的人的 珠蛋白 MAR (登录号: L22754)设计如下引
物: 5TTAGTAAGACATCACCTTGCATTT3, 5AGC
CATAGTTTGAGTTACCCTTT3。为了实现人 珠蛋
白 MAR的定向克隆,引物的 5端要分别引入 Bg l/
Kpn酶切位点 ( AGATCT; GGTACC ) , 以及 Sal/
BamH酶切位点 (GTCGAC; GGATCC)。以提取的外
周血基因组 DNA为模板, 设计的引物采用 PCR扩增
MAR序列。PCR条件采用改进的降落 PCR程序: 95
3m in, 94 40 s, 60- 56 30 s, 72 40 s,每个退火温
度 4个循环,最后 55 30个循环, 72 3m in。片段长
度 770 bp。引物由上海生工合成。
1. 2. 2 pLXSNMAR cat质粒的构建 将载体 pLXSN
与连接有报告基因 cat的载体均用 Hpa和 Xho
酶切,酶切完成后, 1%琼脂糖凝胶电泳酶切鉴定,凝
胶回收 cat基因片段及 pLXSN线性质粒, 用 T4连接
酶将 cat基因片段连接至线性的 pLXSN上, 混合均
匀, 16 PCR连接反应 12 h, 转化 E scherichia coli
JM 109感受态细菌,构建中间载体 pLXSNcat。
将构建好的 pLXSNcat和连接有 MAR片段的
Tvector用 Xho I和 BamH 酶切, 酶切完成后, 1%
琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切情况, 凝胶回收 MAR片
段和 pLXSNcat线性载体。用 T4连接酶将 MAR片
段连接至相同内切酶酶切的 pLXSNcat上, 混合均
匀, 16 PCR连接反应 12 h, 转化 E scherichia coli
JM 109感受态细胞细菌, 构建载体 pLXSNMAR cat。
1. 2. 3 病毒包装及阳性细胞克隆筛选 以 1 105细
胞 /孔在 24孔板接种 PA317细胞, 至细胞 70% - 80%
融合时阳离子聚合物法转染 pLXSNMAR cat载体,设未
转染的 PA317细胞作为培养对照组。转染 48 h后用胰
酶以 13传代,然后用含 200 mg /L G418的 DMEM培
养基筛选,将细胞培养板放置 37 , 5% CO2孵育箱培
养,每天视细胞生长情况可酌情增加 50- 100 mg /L
G418,当加至总量为 400- 500 mg /L G418时,不再增
量,维持 G418浓度, 2- 3 d更换 1次含 ( 300- 400mg /
L G418)培养基。 10 d后阳性克隆出现,挑选 10个克
隆,进一步扩大培养,待细胞接近完全融合后移取上
清,即含有病毒的培养液。
1. 2. 4 阳性重组逆转录包装细胞的鉴定 提取转
染后的阳性细胞基因组 DNA,以正常 PA317细胞的
基因组 DNA为对照组, 采用针对报告基因 cat序列
设计引物: p1 上游引物: 5ATATATCCCAATG
GCATCGTA3, p2下游引物: 5AAATCAAAACTG
GTGAAACTC3,扩增片段为 439 bp。 PCR反应程
序: 95 预变性 5 m in, 94 40 s, 50 30 s, 72
40 s, 30个循环,最后 72 充分延伸 5 m in。反应结
束后分别取 5 L反应产物进行 2%琼脂糖凝胶电
泳。引物由上海生工合成。
1. 2. 5 病毒滴度测定 在做病毒滴度测定的前一
天,按 13将靶细胞分别转入 25 mL培养瓶中, 做病
毒滴度测定的当天,将转染成功的 PA317细胞培养
48 h后制备的上清病毒液取出, 均作相应的 10- 2、
10
- 3、10- 4倍稀释,倒去靶细胞培养基,分别吸取 1 mL
稀释的病毒液,加入培养瓶内,每种病毒液加 2瓶,置
37 , 5% CO2孵育箱培养,使病毒 25 h吸附后,补加 2
- 3mL含 200- 300 mg /L G418的 DMEM 培养液置
37 , 5% CO2孵育箱培养 3 d, 更换含 200mg /L G418
的 DMEM培养培养 7- 10 d,期间 2- 3 d换液 1次,未
感染病毒的靶细胞作为对照组。
2 结果分析
2. 1 MAR序列的扩增与鉴定
PCR扩增结果见图 1,测序结果表明, 克隆的片
段与 MAR序列 (登录号: L22754)完全一致。
183
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
M. DNA M ark er; 1. PCR产物
图 1 珠蛋白 MAR的 PCR电泳图
2. 2 pLXSNM AR cat载体的构建
酶切鉴定结果见图 2,插入片段 1 300 bp, 与预
期结果相符。
1. E coR单酶切; 2.未酶切质粒; M. DNA M ark er;
3. E coR和 BamH双酶切
图 2 载体 pLXSNMARcat酶切电泳图
2. 3 阳性克隆的筛选
加入 G418的第 1天,非转染的包装细胞已经开
始死亡。第 3天, 转染的 PA317细胞也开始出现死
亡,对照组细胞开始出现大量死亡。第 4天转染组也
出现大片死亡,第 6天,对照组全部死亡,转染组只剩
下零星细胞存活。第 12天, 转染组个别区域可见细
胞增殖相 (图 3), 经过 2- 3周培养,细胞逐渐形成
抗性细胞克隆。克隆形成之后即可将细胞转移出
去。从开始包装到克隆形成大约需要 3- 4周时间。
2. 4 阳性重组逆转录包装细胞的鉴定
提取转染后的阳性细胞基因组 DNA, 以正常
PA317细胞的基因组 DNA为对照组,采用针对报告
基因 cat序列设计引物,图 4所示, 阳性细胞扩增出
片段为 439 bp,而对照组无片段扩出。
图 3 G418筛选 12 d被感染的 PA317细胞形成克隆
1.载体基因组; M. DNA M arker; 2. PCR产物; 3.对照组
图 4 载体 pLXSNMARcat PCR电泳图
2. 5 逆转录病毒滴度测定
抗性细胞筛选成功后,约维持 7- 10 d后可以
开始进行病毒液的制备与病毒滴度的测定。转染有
pLXSNMAR cat质粒的包装细胞克隆所产生上清的最
高病毒滴度为 16 106 CFU /mL。
3 讨论
转基因沉默是在转基因动植物中所遇到的关键
问题。在基因治疗中逆转录病毒载体介导的转移基
因启动子失活而造成的基因沉默也是基因治疗中亟
待解决的问题之一 [ 10]。核骨架基质结合区是能够
与核骨架或核基质在体外具有很高亲和力的 DNA
序列。这些序列一般处于基因的上游或下游或内含
子等非编码区 [ 11 ]。目前, 随着转基因技术的兴起,
核基质结合区的研究显得尤为重要。据报道, 将
MAR序列置于外源基因的两侧,可以减少外源基因
在不同转化细胞间表达水平的差异, 并能提高外源
基因的表达水平和稳定性。因此, 对 MAR序列的
性质功能进行深入的了解, 有助于我们利用 MAR
序列克服转基因中外源基因的表达水平低或基因沉
默。但是有关 MAR的促进作用报道并不一致, 有
时还有相反的试验结果 [ 5, 6 ]。
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2010年第 12期 张靖等: MAR介导的逆转录病毒包装细胞系的建立
目前的逆转录病毒载体主要是以 M oloney小鼠
白血病病毒为基本骨架改造而来的。这类载体能够
有效地整合至宿主基因组中,使所携带的外源基因
能够持续稳定地表达, 其感染细胞种类十分广泛。
并且逆转录病毒基因结构简单、清楚,易于改造和操
作,是目前用于体内外研究最有效的基因转移系统
之一 [ 12]。逆转录病毒重组载体 pLXSN是复制缺陷
的, 它没有感染能力, 须通过包装细胞系的包装。
PA317细胞缺失了包装信号 序列,但含有 gag、pol
和 env等编码病毒结构蛋白的基因。因此,当逆转
录病毒载体转染此类细胞后,形成只有一次感染能
力的病毒颗粒。但缺点是逆转录病毒的整合是随机
的,有可能受到基因组的干扰而出现转基因沉默的
现象, 其次逆转录病毒载体的病毒滴度不高也是影
响基因治疗的关键因素。本研究构建 pLXSNMAR cat
转染细胞 PA 317后, 得到的最高病毒滴度为 16
10
6
CFU /mL的缺陷性逆转录病毒的产毒细胞, 足以
满足转染的需要。该产病毒细胞系产生的逆转录病
毒,为进一步基因治疗的试验研究奠定了基础。
参 考 文 献
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(上接第 181页 )
总之,本研究对小鼠黑质蛋白质组双向凝胶电泳
的条件、标本预处理等各个环节进行了调整、优化,建
立了相对稳定、分辨率较高、重复性较好的黑质双向
凝胶电泳技术方案,为进一步分离、鉴定帕金森病生
物标志物和药物作用靶点的研究奠定了坚实的基础。
参 考 文 献
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