全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第3期
收稿日期:2007-11-26
基金项目:国家948项目(2006-4-12)
作者简介:韩笑,男,在读硕士,主要从事酶基因克隆与表达方面的研究
通讯作者:陈介南,Tel:0731-5623078,E-mail:jncool@yahoo.com
前言
β-葡萄糖苷酶 (EC3,2,1,21),其英文名是:
beta-glucosidase,属于水解酶类,存在于自然界许多
植物体,还存在于一些酵母、曲霉菌、木霉菌属及细
菌体内。它可水解结合于未端、非还原性的 β-D-糖
苷键,同时释放 β-D-葡萄糖和相应的配基。在纤维
素的糖化作用中,β-葡萄糖苷酶功能是将纤维素二
糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖[1]。β-葡萄糖苷酶是
纤维素酶系的重要成员,而纤维素酶组分中该酶含
量最少、活力普遍较低,因此成为纤维素酶解的瓶
颈。在纤维素水解时,增加 β-葡萄糖苷酶活性,会
有效提高纤维素酶解效率。目前,国内外多家研究机
构正致力于 β-葡萄糖苷酶的分子生物学研究,以期
望更好改善纤维素酶的催化效率,利用纤维素资源。
1 β-葡萄糖苷酶的性质研究
1.1β-葡萄糖苷酶的分类与底物特异性
根据氨基酸序列分类,将 β-葡萄糖苷酶划分
在糖苷水解酶家族 1和 3中。家族 1中的 β-葡萄
糖苷酶来自于细菌、植物和哺乳动物;家族 3中的
酶来自于真菌、细菌和植物。家族 1中的酶除有葡
萄糖苷酶活性外,还有很强的半乳糖苷酶活性。几
乎所有的 β-葡萄糖苷酶对底物的糖基部分结构的
专一性较差,能裂解 C-O糖苷键、C-S键、C-N键、
C-F键等;有些对糖基部分的 C4和 CZ构形也不专
一,能同时水解 β-葡萄糖苷酶键和 β-半乳糖苷键,
有些甚至C6位的专一性也不高,能水解木糖[2]。但在
所有底物中,β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的活性最
强。在 β-葡萄糖苷酶 C端的高度保守序列可能与
结合糖苷底物有关,在这区段的微小差异决定了
β-葡萄糖苷酶的不同底物特异性。
1.2β-葡萄糖苷酶理化性质
β-葡萄糖苷酶有胞内酶和胞外酶之分,一般生
物体内只含有胞内 β-葡萄糖苷酶或胞外 β-葡萄糖
苷酶[3]。β-葡萄糖苷酶的相对分子量一般在 40~250
β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达研究进展
韩笑 陈介南 王义强 何钢 刘海波 谭力
(中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所,长沙 410004)
摘 要: β-葡萄糖苷酶是一类重要的纤维素酶,广泛的存在于各种生物体内,具有重要研究价值。详细介绍了 β-
葡萄糖苷酶的性质与结构,微生物、植物β-葡萄糖苷酶基因的克隆情况,及在大肠杆菌和酵母中表达方面的研究。
关键词: β-葡萄糖苷酶 基因克隆 基因表达
Research Advances ofβ-Glucosidase Gene Cloning and
Expression
Han Xiao Chen Jienan Wang Yiqiang He Gang Liu Haibo Tan Li
(Institute of Biological and Environmental Science & Technology,Central South University of Forestry and Technology,
Changsha 410004)
Abstract: Theβ-Glucosidase is a very important cellulase. It is widely existent in various living things,and has
important research value. This paper detailedly introduced character and structure ofβ-Glucos dase,cloning con ition of
β-Glucosidase gene,and its expression in E.coli and yeast.
Keywords: β-Glucosidase Gene cloning Gene expression
2008年第3期
kD之间。不同来源的 β-葡萄糖苷酶的相对分子量
由于其结构和组成不同而差异很大。大部分 β-葡
萄糖苷酶的最适 pI都在酸性范围,一般在 3.5~5.5
之间,也有少数的 β-葡萄糖苷酶其 pI在碱性范围[4]。
β-葡萄糖苷酶的最适温度在 40℃~100℃之间都有
分布,一般来说,来自古细菌的 β-葡萄糖苷酶其热
稳定性和最适温度要高于普通微生物来源的 β-葡
萄糖苷酶。对于工业应用来说,酶的热稳定性越高
越有利。因此,从嗜热细菌中分离 β-葡萄糖苷酶引
起了人们的兴趣。
1.3 β-葡萄糖苷酶的结构与功能研究
随着越来越多的 β-葡萄糖苷酶基因已被克隆
和序列分析,为其基因结构与功能方面的研究提供
了重要依据。国外通过 X射线晶体衍生法分析 β-
葡萄糖苷酶三维空间结构。糖苷水解酶家族 1的典
型结构具有 8个(a/β)结构围成的桶状结构,也被
称为 4/7超家族。糖苷水解酶家族 3有 A区和 B区
两个域构成,B区包括 SDW序列,内有活性为点
Asp(D)残基。在分子水平上,水解酶家族 3的编码
基因有 5个典型的区域构成,N端区、N端催化区、
非同源区、C端未知功能区、C端残基[5]。目前对酶
催化糖苷键水解的机理了解的还不是很清楚,普遍
认为酶有两个催化活性中心:一个为亲核中心,另
一个为酸碱催化中心。通过动力学标记、序列分析、
对特殊氨基酸进行化学修饰、点突变等方法来研究
酶催化底物水解的分子机制,对于酶的活性中心的
一些氨基酸残基的特殊作用已取得一些进展。酸性
氨基酸带有-COOH基团在 β-葡萄糖普酶的催化过
程起着非常重要的作用,酶的亲核催化中心和酸碱
催化中心都含有酸性氨基酸 Asp和 Glu。家族 1中
的 H一葡萄糖苷酶属于 4/7超家族成员,在其 β折
叠结构中的 C端第 4位和第 7位都是 Glu残基。而
在家族 3的成员中,则发现 Asp为保守氨基酸[6]。
由于水解酶家族 3主要来自于真菌、细菌和植
物,因此关于水解酶家族 3的研究要更深入些。
1974年,Bause[7]等人提出 β-葡萄糖苷酶活性位点
中的 Asp是糖苷水解酶家族 3的高度保守氨基酸,
作为该酶的催化亲核试剂,此位点以及周围的几个
氨基酸序列在糖苷水解酶家族 3中也是高度保守
的。SiegelDan[8]等人根据 Bause的研究列出了各种
来源于不同微生物的家族 3β-葡萄糖苷酶亲核中
心保守序列,如表 1所示。
2 β-葡萄糖苷酶基因的克隆
2.1 β-葡萄糖苷酶来源
目前已经发现的产生 β-葡萄糖苷酶的生物类
群包括原核生物、真核生物、古细菌 3个界,共几十
个属,几百个种。虽然 β-葡萄搪苷酶广泛存在于微
生物和植物中,但植物来源的 β-葡萄糖苷酶活性
远比微生物来源要低,所以目前的研究主要集中在
微生物上[9]。
产 β-葡萄糖苷酶的微生物种类极多,陆地及
海洋微生物均有分布。主要包括好氧及厌氧的细
菌、丝状真菌、放线菌、酵母、藻类及古细菌等。这其
中既有生长在潮湿环境中,可以分解植物残体的腐
生菌,也有能够侵染植物的寄生菌以及反当动物体
内的瘤胃微生物。在一些极端环境如盐碱湖、热泉
中,也发现具有产 β-葡萄糖苷酶能力的微生物。
2.2 β-葡萄糖苷酶基因克隆方法
由于利用纤维素酶的降解作用进行纤维素的
生物转化有着广阔的前景,对 β-葡萄糖苷酶基因
方面的研究已有较长历史,自 20世纪 70年代末就
开始了纤维素酶基因的克隆。到目前为止,已有上
百个微生物、植物和动物中的 β-葡萄糖苷酶基因
已得到克隆并被测序,其中以微生物和植物为主。
早期 β-葡萄糖苷酶基因的克隆是通过构建总 DNA
文库或鸟枪法进行活性筛选的方式获得的,随着
PCR技术的应用,利用种属相似性扩增克隆得到许
多 β-葡萄糖苷酶基因。随着基因组学的发展,越来
越多的微生物基因组全序列被测定,通过序列筛查
定位分析出可能的 β-葡萄糖苷酶基因,是获得 β-
葡萄糖苷酶新基因的有效手段。
表 1 家族 3β-葡萄糖苷酶亲核中心保守序列[8]
韩笑等:β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达研究进展 9
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
2.3 微生物 β-葡萄糖苷酶基因克隆
在产 β-葡萄糖苷酶的微生物中有很多种都不
止编码一种 β-葡萄糖苷酶,该酶分子量变化较大,
微生物中从 18kD~480kD均有报道,酶学性质也可
能相差很远。关于微生物 β-葡萄糖苷酶基因克隆
的研究又以真菌居多,因为研究表明微生物中 β-
葡萄糖苷酶酶活高的生产菌大多是真菌。少数细菌
也能产 β-葡萄糖苷酶,这主要集中在杆菌。Can-
delasL,RamonD[10]于 1990年从芽孢杆菌分离出的
两个编码 β-葡萄糖苷酶基因 bg1A和 bg1B的核苷
酸序列,其编码的蛋白质分别是胞内酶和胞外酶。
SeissM,GrabnitzF等[11]于 1991年对芽孢梭菌的 β-
葡萄糖苷酶基因进行克隆和序列分析,表明纤维素
酶和包括人体乳糖酶的 β-葡萄糖苷酶形成了一个
超基因簇。山东大学邹文等[12]以黄单胞菌 XA5-5为
供体菌,在大肠杆菌中克隆了一个 β-葡萄糖苷酶
基因,该基因编码的产物对于水杨苷底物有较强的
亲和力。真菌中目前研究得较多的是酵母和霉菌。
1984年,MainRaynal和 MichelGuerineau[13]通过构
建基因文库,从脆壁克鲁维酵母中克隆到 β-葡萄
糖苷酶基因,并分别在大肠杆菌和酿酒酵母中进行
表达研究。ChieKohchi和 AkioTohe[14]从假丝酵母
中克隆到 β-葡萄糖苷酶基因,也在酿酒酵母中进
行了表达研究。MerjaE.Pentil.K[15]等人通过构建基
因文库从一株黑曲霉中克隆到 β-葡萄糖苷酶基
因,在酵母中进行了表达研究。KazuhiroI和 Tat-
suyaN[16]从白曲霉中克隆到 bglA基因,研究发现该
基因可同时编码胞内酶和胞外酶,其氨基酸序列与
bglB有很高的同源性。近年来,热稳定性的 β-葡萄
糖苷酶成为研究热点,JiongHong和 HisanoriTama-
ki[17]于 2007年从一株嗜热子囊菌中分离出耐热的
β-葡萄糖苷酶,该酶在 70℃高温下仍有活性,序列
分析表明该酶属于水解酶家族 3成员。
2.4 植物 β-葡萄糖苷酶基因克隆
近年来除对其微生物体内 β-葡萄糖苷酶进行
研究外,还扩展到许多植物领域,如茶叶、水果、蔬
菜等,主要是该酶与萜烯类香气前驱体有密切关
系,使糖苷键合态变成游离态。另外,该酶能水解
野黑樱苷,释放 HCN,对植物体起到一定的抗病虫
害作用。很多植物都能产 β-葡萄糖苷酶,该酶首次
被发现是 1837年在苦杏仁中[9]。但直到 1995以后,
越来越多的植物的 β-葡萄糖苷酶基因才被陆续克
隆研究。最先研究的是一些基本农作物,如 Esen
A、LeahR、FalkA和 MayerS等人分别从玉米、大
麦、白菜和燕麦中克隆到 β-葡萄糖苷酶基因[18]。从
1995年到 2002年,更多的其他植物如草菇、长春
花、番茄、葡萄、旱金莲、鼠耳芥等 β-葡萄糖苷酶基
因也被克隆研究。植物中产生的 β-葡萄糖苷酶种
类较少,差别也不大,其分子量基本都在 150kD大
小。研究表明,β-葡萄糖苷酶在植物不同的组织器
官中均有分布,酶活性在叶、茎干、根表皮、果实、种
皮中随着植物的种类而变化。在细胞水平上 β-葡
萄糖苷酶不是分布在某个特定的细胞器中,细胞质
中含量较高,但细胞壁、叶绿体、胞质丝、液泡中也
有该酶的报道[19]。近年来,各种花卉、茶树等经济作
物成为研究热点,因为这些植物中存在葡萄糖苷形
式的单萜烯醇类物质,而 β-葡萄糖苷酶能与参与
这些物质的分解,释放出芳樟醇和香叶醇等香气物
质。2002年,安徽农业大学的李远华等克隆了茶树
中的 β-葡萄糖苷酶基因,在原核中进行表达,并研
究了该基因的 mRNA表达和分布定位情况[20]。
3 β-葡萄糖苷酶基因的表达研究
β-葡萄糖苷酶基因重组表达是当前 β-葡萄糖苷
酶研究热点之一,早期研究多在大肠杆菌中表达,这
种以克隆为目的的重组表达一般采用自身的启动
子,不能获得高效表达,多数重组菌产酶活力不如原
始菌株。随着表达系统的发展与完善,有的β-葡萄糖
苷酶已在大肠杆菌和酵母中得到高效表达(表2)。
3.1 表达检测方法
β-葡萄糖苷酶可与许多底物作用并显色,且方
法简便灵敏度较高使得筛选工作很方便。目前筛选
重组转化子和检测酶活大致有 3种方法:一是
Barush和 Swiain法,它以水杨苷作底物,酶解产物
用 4-氨基安替比林作显色剂,使释放出来的水杨醇
显色,再用分光光度法比色测定;二是荧光法,利用
伞形酮(7-羟基香豆素)与 4-甲基伞形酮具强烈荧
光的特点,将它们衍生为无荧光的底物,以此测定;
三是以对-硝苯-B-葡萄糖苷为底物进行酶解,底物
水解后释放出来的配基对-硝基苯酚可直接在 400~
420nm之间测定[21]。
10
2008年第3期
表 2 国外部分已克隆表达的 β-葡萄糖苷酶基因
3.2 原核系统中表达水平研究
MisawaN,NakamuraK[22]最早于 1989年对瘤胃
球菌蛋白 B-葡萄糖苷酶基因在 Z.mobilis中的表达
和稳定性进行了研究。RodjanaOpassiri[23]等从水稻
苗的 cDNA中克隆了 β-葡萄糖苷酶基因 BGlul并
在大肠杆菌中实现了可溶表达。国内有研究者从茶
树中克隆到 β-葡萄糖苷酶基因,并采用 pET载体
在大肠杆菌中实现了表达[20]。但真正能使 β-葡萄糖
苷酶进行高效,高活性表达成功研究并不多。
许多研究表明,β-葡萄糖苷酶基因可以在大肠
杆菌中表达。大肠杆菌基因结构简单,易于进行基
因操作,而且它生长迅速,周期短,营养需求简单,
适于工业化生产。但同时该系统也存在很多缺陷:
它是原核表达系统,缺少真核生物的翻译后加工过
程,产生的外源基因产物往往无活性;它表达的蛋
白多以包含体形式存在,需要经过复性,过程复杂;
它产生的杂蛋白较多,不易纯化,产物中有可能会
含有原核细胞中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。这
些都不利于表达真核基因,尤其是 β-葡萄糖苷酶
这种分子量大,结构复杂的蛋白质。但随着原核表
达载体的不断改进和完善,这种状况也发生了改
变,现在已有一些适合真核基因分泌表达的原核表
达载体,如 pET系列、pAB系列载体等,这些载体具
有融合表达的信号肽序列,可以协助目的蛋白转运
到细胞周质或胞外,以促进蛋白正确折叠。有的 β-
葡萄糖苷酶基因用这些新型原核表达载体表达水
平也很高。例如 WarenWakarchuk和 DouglasG.
Kilburn从 Agrobacterium克隆到的 β-葡萄糖苷酶基
因,采用 pAB载体在大肠杆菌中表达,其酶活性高
于原菌株的酶活[24]。
3.3 真核系统中表达水平研究
随着真核表达体系的建立与完善,根据近年来
研究表明,β-葡萄糖苷酶基因在酵母中表达比在大
肠杆菌中表达的表达量和酶活性普遍要高些。因为
酵母是单细胞低等真核生物,较适合表达真核基
因。最近 10年,许多细菌和真菌的 β-葡萄糖苷酶
基因已经在酵母菌中成功地克隆和表达。酵母表达
系统兼有大肠杆菌表达系统的优势:既便于培养,
便于基因操作,成本低,繁殖快,又可对真核基因产
物进行翻译后加工,得到正确折叠、有活性的蛋白。
所以近年来,酵母表达系统已广泛应用于工业生
产。
现在酵母表达系统研究主要集中在酿酒酵母
和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。酿酒酵母是最
Pinus contorta
58.3kD pET21a
E.coil 30%~50% Brian E. Ellis
John E. Carlson
Kluyveromyces fragilis 129.5kD pHCG3
S.cerevisiae 10%~20% Main Raynal
Michel Guerinea
Thermoascus aurantiacus 133.2kD yeast Pichia pastoris 70%~80% Jiong Hong
Hisanori Tamaki
filamentous fungal 118kD P3030
S. cerevisiae
10% Merja E. Penttil~
HelenaNevlainen
Candida pelliculosa 129.5kD pGCA
S. cerevisiae
120% Chie Kohchi
Akio Toh-e
Micromonospora chalcae 85kD pUC18
E.coil 50% A. Winters
J. Gallagher
Kluyveromyces fragilis 93.8kD KF21 S. cerevisiae Alain Raynal
Claude Gerbaud
Caldocellum sacharolyticum 63.6kD pNZ1065
KK223-3
E. coil
10%~15% D.R. Love
R. Fisher
Agrobacterium
59.2kD pABG5
E. coil
Warren Wakarchuk,
Douglas G. Kilburn
Phanerochaete chrysosporium yeast Pichia pastoris
Kawai R, .
Yoshida M.
韩笑等:β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达研究进展 11
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
早使用的真核表达系统,在早期进行真核基因表达
实验时,以酿酒酵母为受体菌相当普遍。很多具有
应用价值的基因都在酿酒酵母表达系统中得到成
功表达。而巴斯德毕赤酵母表达系统是 20世纪 80
年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系
统,由于它所具有的一些其它表达系统不可比拟的
优势而得到越来越广泛的应用。经过国内外研究对
比,β-葡萄糖苷酶基因可以在经改造的酿酒酵母中
成功表达,但总体表达水平与毕赤酵母表达系统相
比不高。主要原因可能是酿酒酵母对表达的蛋白进
行翻译后加工与修饰能力不足,以及分泌效率差、
表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷造成
的。而毕赤酵母表达系统较好的解决了这些问题,
因此表达水平普遍要比酿酒酵母高,有时表达的酶
活甚至高出原始菌株很多。国内有学者从扣囊复膜
饱酵母的总 DNA中扩增得到 β-葡萄糖苷酶基因,
实现了在毕赤酵母中的高效表达[24]。2003年,KawaiR
和 YoshidaM等人从 Phanerochaetechrysosporium中
克隆到的 β-葡萄糖苷酶基因,采用毕赤酵母表达
系统进行表达,其重组表达的酶活甚至达到原始菌
株几十倍[25]。
4 总结
纤维素是生物圈内最重要的可再生生物质资
源,在解决能源和环境危机中可起到重要作用,但
纤维素需被降解为葡萄糖后才能被大多数微生物
所利用。β-葡萄糖苷酶对纤维素糖化水解具有关键
性作用,但从微生物所产纤维素酶来看,β-葡萄糖
苷酶在纤维素酶中所占比例很低,不足 1%,这使得
β-葡萄糖苷酶成为纤维素降解成单糖的瓶颈。因此
许多研究者正致力研究 β-葡萄糖苷酶。除了在降
解纤维素方面有着重要作用外,β-葡萄糖苷酶在其
他领域应用也越来越广。该酶作为风味酶的一种应
用于茶叶、果汁和果酒中增香,其应用逐渐得到开
发。还可用于生产低聚龙胆糖,它比麦芽糖浆具有
更高的吸水性和较低的粘度,可防止淀粉的老化和
保持食品中的水分。另外该酶能水解野黑樱苷,释
放 HCN,对植物体起到一定的抗病虫害作用。现
在,通过基因工程手段构建工程菌或通过蛋白质工
程手段改造酶蛋白,以获得高活性的 β-葡萄糖苷
酶已成为研究的热点。
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