全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第1期
收稿日期:2007-07-16
基金项目:福建省科技计划项目(2003N085)及福建省青年科技人才创新项目(2003J046)资助
作者简介:陈坚(1965-),男,博士研究生,分子生物学与生物化学;E-mail:chejian3@hotmail.com
通讯作者:林忠平,E-mail:linzp@pku.edu.cn
青枯菌(Ralstoniasolanacearum)是一种广泛分
布的植物细菌性病原菌。它可侵染约 50个科的植
物,能使许多重要经济作物产生毁灭性病害。其为
害对象不仅包括茄科作物如番茄、马铃薯、烟草等,
还包括豆科作物(如花生)、单子叶作物(如香蕉、生
姜)和一些林木作物(如桑树、桉树)[1]。正因为如
此,在青枯菌被发现、命名的近 100年以来,对其遗
传、生理、病理及系统学等方面的研究是不断的深
入进行。尤其是在近年来,随着青枯菌基因组全序
列测定的完成,对其基因结构与功能的研究进入了
一个崭新的阶段。
同许多革兰氏阴性的植物病原菌一样,青枯菌
可激发植物的超敏性(HR)反应。这种反应也是由
其基因组中的 hrp基因簇决定的,该基因簇用以编
码细菌的类型 II蛋白分泌系统 (typeIIprotein
secretionsystem,TTSS)。这是一条病原菌的分泌途
径,通过其可将细菌产生的诱导蛋白释放到胞外或
宿主细胞中,从而诱发宿主的各种效应。目前已从
欧氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)和黄
单胞菌属(Xanthomonas)的植物病原菌中分离出导
致植物产生超敏反应的蛋白诱发子——harpin蛋
白,该蛋白是由 hrp基因编码的[2]。与此不同的是,
尽管目前也从青枯菌中分离到多种经 TTSS途径释
放的诱发植物 HR反应的蛋白因子,但它们均不是
青枯菌hrp基因的研究进展
陈坚 1,2 林营志 1 刘建 1 胡鸢雷 2 林忠平 2
(1福建省农业科学院生物技术研究所,福州 350003;2北京大学生命科学学院,北京 100871)
摘 要: 青枯菌的hrp基因可诱发植物的超敏反应。对其基因组全序列测定表明:hrp基因簇位于基因组的大质粒
上,共有20多个基因组成。从青枯菌中分离得到的可直接诱发植物超敏反应的效应蛋白主要为pop基因编码,它由 hrp
基因编码的类型II蛋白分泌通道释放。目前的研究表明:(1)在hrp基因簇中,hrpY、hrpX及hrpV与分泌通道的一种纤毛
的组装有关;(2)hrpB是整个类型II蛋白分泌通道基因的转录激活子并作用于基因组中的其它效应基因;(3)hrpG是植
物信号对hrp基因的表达进行级联调控的组分之一。
关键词: 青枯菌 hrp基因 超敏反应
ProgressinhrpGeneofRalstoniasolanacearum
ChenJian1,2 LinYingzhi1 LiuJian1 HuYuanlei2 LinZhongping2
(1InstituteofBiotechnology,FujianAcamdemyofAgriculturalSciences,Fuzhou350003;
2LifesciencecolegeofPekingUniversity,Beijing100871)
Abstract: ThehrpgeneofRalstoniasolanacearumcaninducehypersensitivityreaction(HR)inplant.Theanalysis
ofitscompletegenomesequenceindicatedthatthehrpclusterislocatedinmegaplasmidandiscomposedbyover20
genes.Theefectorwhichwasisolatedfrom bacteriatoelicittheHR ofplantiscodedbypopgeneandwasreleased
throughhrpIIsecretionsystem.Recentstudiesofthehrpgeneclusterrevealedthat:(1)hrpY,hrpVandhrpXgenesare
required forHrp pilusasembly,(2)Activation ofthetypeIIsecretion system and efectorgenesin Ralstonia
solanacearumismediatedbyhrpBgene,(3)hrpGisoneofcomponentsoftheplantsignal-dependentregulatorycascade
tocontrolhrpexpresioninRalstoniasolanacearum.
Keywords: Ralstoniasolanacearum hrpcluster Hypersensitivityreaction
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
由 hrp基因编码的,迄今为止还未在青枯菌中得到
harpin蛋白。由于近年来对青枯菌的 hrp基因的研
究有了较快的进展,就这个方面的内容进行综述。
1 青枯菌 hrp基因簇及其在细菌基因组中的
定位
2002年报道的对番茄青枯菌 GM1000基因组
的全序列测定表明:其基因组大小为 5.8Mb,分为
3.7Mb的染色体及 2.1Mb的大质粒两个部分,预计
编码 5120个蛋白。青枯菌的 hrp基因簇被定位于
大质粒上(图 1)[3]。
通过在 NCBIGenebank上对青枯菌的 hrp基因
的电子克隆步行表明:青枯菌相关的 hrp基因位点
多达 23个,可分为 3类。
第 1类包括 12个 HRP蛋白基因:hrpG、hrp
Z、hrpY、hrpX、hrpW、hrpV、hrpK、hrpJ、hrp
H、hrpF、hrpD、hrpB;第 2类包括 9个 HRP保守
基因:hrcS、hrcR、hrcQ、hrcV、hrcU、hrcJ、hrcN
、hrcT、hrcC,这类基因可能存在于所有的病原菌
的 hrp基因簇中;第 3类为 2个 HRP相关蛋白基
因:hpaB、hpaP;此外,在 hrp基因簇的两侧,还分
布有与 hrp基因有关的调控基因(如植物信号调控
相关的基因 prh)及分泌的效应蛋白基因(如 popA
基因)。
由图 1可见:在青枯菌的大质粒上,hrp基因簇
占有率不到 1%,但这 20多个基因构成了一个相对
独立的致病力岛。因为其中任何一个基因的突变不
仅会导致青枯菌失去诱导宿主植物超敏反应的能
力,也会导致其丧失致病性。
2 青枯菌 hrp基因功能的研究进展
植物病原细菌的 hrp基因参与和介导植物 HR
的发生,并且能够决定病原菌的致病性。1986年,
Lindgren等首次在 Pseudomonassyringaepv.phaseoli
cola中克隆到 hrp基因。随后,人们证实,许多革兰
氏阴性细菌,包括 Erwinia、Pseudomonas、Ralstonia
和 Xanthomonas等属的植物病原细菌都含有 hrp基
因[4]。图 2指明青枯菌的 hrp基因构成了 7个转录
单位,编码为数超过 20个多肽。这些蛋白多肽组合
在一起就构成了一条跨越细菌内外膜的蛋白通道,
它一直可以触及植物细胞。通过这条通道,可将细
菌产生的毒性因子和无毒蛋白(Avrs)等注入植物
细胞中,以抑制宿主的防御系统的活性并造就可从
宿主细胞中获取养分的环境[5]。因此,对青枯菌 hrp
基因功能的研究,就是用各种手段揭示 hrp基因簇
中各基因成员在这条蛋白通道的结构形成、功能调
控、信号传递以及效应蛋白的编码等方面所起的作
用。通过近年来的深入研究,在上述 20多个 hrp基
因之中,已有 5~6个基因成员的作用较为清晰地呈
现出来。
2.1 青枯菌中诱发植物 HR反应的效应蛋白的
分离及相关基因的研究
植物病原菌的 hrp基因同植物的 HR反应密不
可分,从病原菌中分离出能直接诱导植物 HR反应
的效应物是hrp基因功能研究的重要一环。1992年,
韦忠民等首先从梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)中分
离出激发植物过敏反应的蛋白,定名为 harpinEa,
它可以引起烟叶的超敏反应。随后从多种植物革兰
氏阴性病原菌中分离类似的蛋白因子,它们有的由
hrp基因编码,有的由其它基因编码:如 Avr无毒蛋
白因子;Pop外分泌蛋白以及 Xop分泌蛋白等,这
些蛋白因子均通过 II型分泌通路进入植物体从而
引起植物的过敏反应[2,4]。
1994年,Arlat等在比较野生型青枯菌 GMI1000
和不能引起烟草叶片 HR反应的青枯菌突变株
GMI1462的细胞上清液的高压液相色谱(HPLC)
图 1 青枯菌大质粒结构示意图及 hrp基因簇的位置
图 2 青枯菌 hrp基因簇的结构
数字箭头为转录单位;白色箭头为 hrp基因;灰色箭头为 hrc
基因;黑色箭头为分泌蛋白基因;带框箭头为调节基因。
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2008年第1期
时,发现突变株的色谱中明显减少了两个峰值的组
分。经纯化分析这就是能引起植物 HR反应的激发
子:PopA1及 PopA3蛋白。进一步比较不同 hrp基
因成员的 Tn5-B20插入突变型的 HR反应的诱导
能力以及细胞上清液中 PopA组分的变化,发现
PopA的释放依赖于 hrp基因体系并且受到 hrpB基
因的调控[6]。随着 popA基因被克隆并定位于 hrp基
因簇的一侧,发现在 popA下游至第 1个 hrp基因
之间还存在 2个 ORF,其转录方向与 popA相一致,
被分别称为 popB和 popC。2000年,GueA^neron等
发现如果在低营养培养基中加入刚果红就可以检
测到某些由 hrp途径分泌的蛋白,从而得到了
PopB、PopC蛋白。插入突变分析发现:popA、popB、
popC共同组成了一个操纵子,其表达受到 hrpB基
因的调控并可由共培养的拟南芥悬浮细胞诱导提
高。但 popABC的突变体却仍然具有诱导植物超敏
反应(HR)的能力且保持有致病性,这与同样可诱
发植物 HR反应的 harpin蛋白基因完全不同[7]。
近来,Meyer等又从青枯菌中分离到 2个可导
致植物产生超敏反应的 Pop蛋白:PopF1与 PopF2。
两者均受 hrpB基因的调节,其中 PopF1在决定病
原菌的毒性以及诱发植物 HR反应方面起更大的
作用,它们是青枯菌将 AvrA无毒蛋白导入烟草细
胞中必不可缺的因子。研究证实:它们与黄单胞菌
的 hrpF以及根瘤菌的 NopX可能是属于同一族的
蛋白,对 TTSS系统其它分泌蛋白起到定位导向作
用[8]。
2.2 hrpY、hrpX及 hrpV与菌体的一种纤毛 hrp-
pili的组装有关
VanGijsegem等(2000)在对青枯菌 GM1000菌
体表面附生物进行观察时发现了一种由 hrp基因
簇控制形成的纤毛 hrp-pili。通过进一步提纯这种
纤毛的蛋白,对其进行氨基酸序列分析后发现它与
hrpY编码的蛋白序列相吻合。由 hrpY突变株分析
发现:该菌株由于不能产生纤毛,因此也不能分泌
PopA蛋白,但仍可以附着在植物细胞上。从而证明
了hrpY是构成青枯菌hrpII型分泌通道主要蛋白[9]。
2002年,通过基因的定位突变技术得到了多种 hrp
基因突变的非极性(no-polar)突变株,这些突变株
大多不能引起烟草叶片的超敏反应。通过对这些突
变株的免疫显微观察发现 hrpV和 hrpX的突变株
不能或仅能产生极少的纤毛,但仍可在菌体细胞表
面检测到 hrpY蛋白的存在。而且这两者均不能分
泌 PopA蛋白。因此,推断 hrpV和 hrpX所表达的蛋
白也参与了菌体纤毛 hrp-pili的组装[10]。
2.3 hrpB是整个 hrp基因簇的转录激活子并作用
于基因组中的其它效应物基因
早期的研究就已经发现:病原菌 hrp基因的表
达和类型 II效应因子的释放是受环境条件调控
的。在营养完全的培养基中,hrp基因的表达水平很
低。而在低养分或模仿植物源条件的培养基中,hrp
基因的表达水平则会提高很多。对青枯菌的遗传分
析表明:环境信号是通过一个复杂的级联系统传递
的,最终由一个属于 AraC家族的调节因子 hrpB所
接受并激活整个 hrp基因簇的表达[11]。为了在分子
水平更清晰的了解 hrpB在这个信号接受和传递过
程中的作用,近年来,不同的研究者从不同的角度
进行了十分有意义的工作。
Cunnac等(2004)根据受黄单胞菌 Xanthomonas
campestris中 AraC家族调节因子 hrpX调控的 hrp
基因成员的启动子上均含有 PIP(plantinducible
promoterbox)保守区的事实,对已知受 hrpB调控
的青枯菌的 popABC操纵子和 hrpY基因的启动子
进行了分析。发现由 hrpB调控的 hrp基因成员的
启动子区域存在序列为 TTCG-N16-TTCG的 hrpI
框,它位于转录起始点上游-70~-47的区域内,较
为保守。进一步通过对青枯菌 GMI1000全基因组
进行搜寻,发现了有 114基因启动子区含有类似的
保守框,这样就形成了一个候选的基因库[12]。他们
又通过利用插入突变等技术,对整个基因组中的
71个基因进行了诱变处理(其中有 58个基因是选
自上述 114个的基因库)并得到了 56个的基因插
入突变体。通过对 hrpB-的互补表达分析,他们发现
了 48个基因是受 hrpB调控的,并称为 brg基因
(hrpBregulatedgene)[13]。
Mukaihara等(2004)也利用转座子诱变体系筛出
受 hrpB调控的多种 hpx(hrpB-dependentexpression)
新候选基因。其中 2个位于 hrp基因簇中:hpaB及
hpaZ;30个位于 hrp基因簇以外。大多数 hpx基因
的启动子区域含有 PIP框[14]。而后,这个研究小组
陈坚等:青枯菌hrp基因的研究进展 49
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
得到了 hrpB组成型表达的青枯菌突变株 hrpBc。同
野生型青枯菌比起来,hrpBC中受 hrpB调控的基因
表达活性更强,释放到胞外的 PopA及 PopC的水平
也更高。在对前面得到的 hpx候选基因进行免疫标
记 FLAG处理后,通过对 hrpBC菌体细胞释放物的
蛋白电泳并进行 FLAG免疫分析,共得到了 5种
TTSS通道释放的蛋白。其中 3种与丁香假单胞菌
的番茄病菌 Pseudomonassyringaepv.Tomato释放的
胞外效应蛋白十分的类似,其余 2种分别为 2种
酶:glyoxalaseI和 Nudixhydrolase的类似物[15]。
上述研究证明:在青枯菌的 hrp基因簇中,
hrpB是起着转录激活子的作用。它不仅激发本基
因簇中转录单元及 popABC操纵子的表达,也调控
了菌体中其它基因的表达,其中许多为依赖 TTSS
分泌系统释放的效应蛋白。
2.4 hrpG是植物信号对 hrp基因进行级联调控作
用的组分之一
由于青枯菌 hrp基因的表达受生长环境影响
很大,以氮源为甚。如在缺氮的低营养培养基中,
hrp的表达得以加强。如果与植物细胞进行共培养,
hrp基因的表达会提高 20倍左右。研究证实:位于
hrp基因簇一侧的 prhA基因在接受植物的信号中
起了重要的作用。番茄青枯菌的 prhA突变株在与
植物细胞共培养时也不会大幅度提高 hrpB的表
达,但它也不影响 hrpB基因在低养培养基中的表
达及其致病性。通过铁离子处理未发现 prhA及 hrp
基因的表达会受到铁浓度的影响并以此推测 prhA
表达的蛋白可能位于菌体细胞的表面,通过接受来
自植物的信号以诱发 hrp调控元的表达[16]。
将植物的信号从 PrhA传递到 hrp基因的启动
子上还可能存在着许多中间递体,Brito等的研究
表明 prhJ基因是其中之一。因为在同拟南芥细胞
共培养时,青枯菌 prhJ基因的表达被提高了 50
倍,但如果 prhA基因失活了,这种情况就不存在
了。同样地,如果 prhJ基因失活了,共培养的拟南
芥细胞也不能激活 hrpB的表达。此外,他们还发现
属于 hrp基因簇中的 hrpG也参与了信号的传递过
程。在低营养的培养基中,hrpG基因的存在同 hrp
基因簇的表达是密切相关的。在青枯菌与植物细胞
共培养时,hrpG也控制了 hrpB的表达。由此,图 3
总结了植物信号调控 hrp基因簇的传递途径为
prhA——>prhJ——>hrpG——>hrpB,信号的最终受
体是 hrpB基因。而prhA、prhJ、hrpG是植物信号的中
间递体[17]。
近年来的研究揭示出青枯菌的另一个毒性控
制基因 PhcA也参与了 hrp基因表达的调节。因为
对于 PhcA的突变株而言,完全培养基对 hrp基因
的抑制作用被大大地减缓了。研究证明,PhcA对
hrp基因的调控作用是在 HrpG的水平实现的[18]。
3 展望
迄今为止,在青枯菌 R.solanacearum中还未见
有分离到有活性的 harpin蛋白的报道。而得到具有
激发子功能和性状的是 Pop蛋白,其编码基因为
pop基因。但由于 pop基因的突变对病原菌的致病
性没有影响,说明 Pop蛋白与病原细菌致病性关联
不大。因此,有可能在青枯菌 R.solanacearum的 hrp
基因簇中还存在编码分泌多个 harpin蛋白激发子
的成员。青枯菌基因组全序列测定的完成,可通过
生物信息学 insilico的方法对基因的预期功能大规
模的加以挖掘,这对青枯菌 hrp基因簇中其它基因
的功能的揭示有重要的意义。
随着对青枯菌 hrp基因功能研究的不断深入,
由该基因簇决定的青枯菌类型 II蛋白分泌系统的
调控机制及生物功能的复杂性也不断地显现出来。
特别是由其分泌的效应蛋白在数量及其在功能上
图 3 植物信号对 hrp基因表达进行调控的传递途径
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突变结合其在引起植物反应的形态表型上变化的
比较分析还是最主要的手段。更深入的研究将在细
胞水平开展,即发现青枯菌的效应蛋白对植物细胞
的作用,并鉴定出宿主细胞中能与青枯菌效应物相
互作用的靶标。
对青枯菌 hrp基因的深入研究还发现这是一
个十分精细的感应调节系统。它的表达受到环境及
植物宿主等各种外界信号的调控,目前的研究发现
仅是揭示出冰山一角。接下去的工作从植物细胞、
根际及土壤环境中寻找促使 hrp基因表达的信号
及其传递途径。通过这方面的研究,找到阻断信号
传递的有效方法将会在青枯菌病害的防治上显现
出实用价值。
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