全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(5)：678— 682 2009年 9月
广藿香抗青枯病离体筛选技术的研究
张燕玲，贺 红 ，吴立蓉 ，刘 星
(广州中医药大学 中药学院，广州 510405)
摘 要：以广藿香叶片及带节茎为材料，研究青枯菌粗毒素不同制备方法 、青枯菌不同培养时间及不同菌液
浓度对外植体离体再生的影响。结果表明：过滤灭菌法制备 的青枯菌粗毒素致毒性比湿热灭菌法处理更强，
外植体成活率明显降低；以培养 12 h的青枯菌粗毒素对外植体有较大的致毒性，外植体变褐死亡现象较突
出，培养 30 d后，叶片及带节茎出芽率分别为 lO．33 及 36．11 ；浓度在 l_41×lOs cfu／ml以上的菌液粗毒
素对外植体有明显的毒害作用，大多外植体枯黑死亡 ，出芽率较低 ，同时在该浓度时，大多数无根苗难以生根，
植株基部变黑 ，叶片变黄 ，生长不良。确定了青枯菌粗毒素对广藿香不同离体培养阶段的致毒性，建立了以青
枯菌粗毒素为选择压力的广藿香离体筛选体系。
关键词 ：广藿香 ；青枯菌粗毒素；离体培养
中图分类号：Q943．1 文献标识码 ：A 文章编号：i000—3142(2009)05—0678—05
Study on in vitro selection of Pogos temon
cablin resistant to bacterial wilt
ZHANG Yan-Ling，HE Hong ，WU Li-Rong，LIU Xing
(Colege of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510405．China)
Abstract：The leaf segments and nodular stem segments from Pogostemon cablin were cultured in vitro．The factors
connected with the ”vitro selection，such as the different antiseptic methods of R．solanacearum crude tOxins。the cul—
tural time and the concentrations of R．solanacearum were studied．The results showed that：The survival rate of ex—
plants on the media with R．s0lanacearum crude tOxin sterilized from filters iS lower，which showed the toxicity of the
crude tOxin sterilized from filter was stronger than that of crude toxin sterilized in hot and damp．The explants on the
media with the crude toxin from cultured 12 h bacteria were prominently browning and dead．And after 30 d，the
shoot formation rate of leaf segments and nodular stem segments were 10．33 and 36．11 respectively．Crude tox—
in from bacteria concentration above 1．41×10 cfu／ml could inhibit the regeneration of explants obviously．with high
death rate and lOW shoot formation rate．And also，the root formation of the shoots from the explants was difficult at
that concentration of crude toxin．The R．solanacearum crude toxin had toxicity to the explants and could inhibit the
plant regeneration of P．cablin．The system of in vitro selection of P．cablin resistant to bacterial wilt was established
Key words：Pogostemon cablin；bacterial wilt crude toxin；in vitro culture
广藿香(Pogostemon cablin)为唇形科刺蕊草属
植物，其干燥地上部分入药，为广东道地药材，“十大
广药”之一，是多种著名中成药以及现代中药制剂
“抗病毒口服液”的主要原料。目前广藿香生产中面
临青枯病的危害(刘东明等，2003)，该病由青枯菌
(Ralstonia solanacearum)侵染所致，为典型的维管
束病害，在广藿香整个生长期均可发生，但以盛夏高
温多雨季节发病最盛。青枯菌为土传细菌，一旦有
植株感染，便可迅速蔓延 ，导致大面积死亡。青枯菌
可以在土中和病残组织内越冬，连作的土地危害更
收稿日期：2008—01—28 修回日期：2008—1 2-31
基金项目：国家自然科学基金(304 721 52)[Supported by the National Natural Science Foundation of china(3O472152)]
作者简介：张燕玲(1982一)。女，广东梅州人，硕士研究生，从事药用植物诱变育种研究 ，(E—mail)echozhangyl@sina．tom．cn。
通讯作者(Au,hor for correspondence)
5期 张燕玲等 ：广藿香抗青枯病离体筛选技术的研究 679
为严重，目前尚无有效的防治方法，迫切需要进行抗
病品种的选育(黄宁珍 ，2002)。青枯菌致病的主要
机理在于细菌侵染植物的过程 中，细菌所分泌的致
病毒素对植物细胞造成伤害。在培养基中加入病原
菌的致病毒素进行离体筛选，是培育植物抗病突变
体的重要方法 ，前人在烟草抗野火病、水稻抗白叶枯
病等突变体的选育中获得了成功 (Carlson等，l973；
曾列先等，1992；敖世恩等，2006)。本研究以广藿香
试管苗叶片及带节茎等为材料，探讨青枯菌粗毒素
对广藿香离体培养的影响，建立抗青枯病离体筛选
的技术体系，为广藿香抗病育种奠定基础。
1 材料与方法
1．1材料
广藿香(Pogostemon cablin)采 自广州中医药大学
药圃，采取茎尖，经表面消毒，接种至MT培养基中培
育试管苗。青枯茵(Ralstonia solanacearum)菌株，来
源于华南农业大学，将青枯菌在 TZC培养基上划线，
挑取有致病力的菌落，分别进行以下试验。
1．2方法
1．2．1青枯茵茵液浓度与A值之间关系的测定 将
青枯菌接种于NA平板培养基上，在3O℃条件下培
养 24 h后，在 1 000 mL锥形瓶中加入 350 mL液体
培养基，取平板培养的青枯菌菌落，接种至准备好的
NA液体培养基中，3O℃、200 r／min摇床培养。以
600 nm作为吸收波长，随时检测摇瓶 中菌液 A值 ，
当 A值达到接 近 0．943时停止摇 床，取 8个 250
mL的锥形瓶各加入 50 mL菌液，用培养基稀释成
系列浓度进行以下操作：以原始培养基调零，测定不
同稀释度菌液的 A值；再将每一浓度菌液再梯度稀
释(一般至 l0～、lo～、10 )，分别吸取 0．1 mL涂平
板(3次重复)，取平均数进行活菌的准确计数。
1．2．2青枯菌粗毒素的制备方法 湿热灭菌法：将
培养了 20 h的菌液以2O 体积比加入相应培养基
中，然后用高温高压灭菌处理。过滤灭菌法：将培养
了 20 h的菌液离心，取上清液用针筒式细菌过滤器
经过 0．22 m 细菌过滤 膜过滤 ，获得青枯 菌粗毒
素，于 O～6O℃在无菌条件下以 2O％体积比加入
相应培养基并混匀。
1．2．3广藿香的离体培养 以广藿香试管苗的叶片
及带节茎等为材料，以 MT为基本培养基，根据不
同培养阶段分别附加 BA 0．05 mg／L、IBA 0．2 mg／
L(林小桦等 ，2007)。每个处理接种外植体数为 1O
块，设置 3次重复。多处理的多重 比较采用新复极
差测验 ，显著水平 0．05。
2 结果与分析
2．1青枯菌菌液浓度与 A值之间对应关系的建立
以青枯菌粗毒素为选择压力，进行广藿香的离
体筛选试验，首先需要建立快速而准确 的菌液浓度
计算方法 。现测定了不同稀释度菌液的 A值，结合
平板计数结果，列出了青枯菌菌数与 A值关系表
(表 1)，以A值为横坐标，以活菌数为纵坐标，绘制
XY散点图(图 1)。
表 1 青枯菌菌液浓度与 A值的关系
Table 1 Relation between R．solanageatulqt
concentration and A value
A值 A value 青枯菌菌液浓度(100个／mI )
Concentration Of R．solanacearum
一
一J
E
＼
3
一
∞
u
0
=
粗
图 1 青枯菌菌液浓度与A值关系的XY散点图
Fig．1 XY plot of relation between R．solanacearum
concentration and A valHe
利用数理统计中的最小二乘法(童一中，1996)，
设所求 直线为 Y—kx+b，k为回归系数，b是直线
在轴上的截距，在波长 600 nm下，建立青枯菌菌液
的 A值与菌数之间的直线回归方程：Y=1．8662z一
0．0458，R 一0．9904， ：A值，y：菌浓度(10。cfu／
mL)。可见，青枯菌菌液浓度与 A值之间相关性
3 3 5 3 u 3 5 7
0 钉 盯 踮 ％ “ ”
O O O O 1 1 1 1
7 4 5 1 0 1 9 7
0
骢 l蛊
O O O O O O 0 O
68O 广 西 植 物 29卷
强，采用 A值进行青枯菌菌液浓度的实时检测具有
简便、迅速、准确等优点。
2．2不同方法制备的青枯菌粗毒素对外植体的致毒性
分别采用湿热灭菌法和过滤灭菌法 ，制备青枯
菌粗毒素，以考察不同方法制备的粗毒素对外植体
的致毒性。根据 2．1建立 的青枯 菌菌液浓度计算
法 ，设置两种不 同的浓度。由于粗毒素对寄主细胞
的毒害作用，外植体表现为发黄、褐化，甚至死亡。
统计培养 15 d后 的成活率 (表 2)。由表 2可知，菌
液浓度 13．1×10。cfu／mL时，在加入湿热灭菌处理
菌液的培养基中，叶片成活率 85．33 ，带节茎为
100 ，而加入过滤灭菌处理菌液的培养基 中，外植
体成活率大幅度下降，叶片及带节茎成活率分别为
24．67 9／6和 41．63 9／6；菌液浓度 l3．1×10。cfu／mL
时 ，在加入湿热灭菌处理菌液的培养基中，叶片成活
率 51．0 ，带节茎为 85．33 9／6，而在加入过滤灭菌处
理菌液的培养基 中，叶 片和带节茎的成活率分别为
0和 l2．67 。这表 明不同方法制备的青枯菌粗毒
素对广藿香外植体培养 的影响差 别较大，可能的原
因是 ：菌液与培养基一起高温高压湿热灭菌时，过高
的温度不仅杀死了细菌，还会使毒素毒力大大减弱，
在此培养基上培养的外植体成活率高；而经过滤灭
菌的粗毒素，其致毒性较强，外植体成活率较低。故
在以下试验 中均采用过滤灭菌法。
表 2 不同方法制备的粗毒素对外植体成活的影响
Table 2 Effect of the crude toxins sterilized from different antiseptic methods on the survival rate of explants
菌液浓度 成活率 Survival rate(％)
Concentration of
R．solanacearum
(efu／ml )
叶片 I eaf segment
湿热灭菌 Disinfection 过滤灭菌 Percolation
带节茎 Nodular stem segment
湿热灭菌 Disinfection 过滤灭菌 Percolation
表 3 不同培养时间的菌液粗毒素对外植体出芽的影响
Table 3 Effect of the crude toxins from the R．$olanacearum cultured in different times on shoot formation
注：用邓肯氏新复极差法进行分析，不同的字母表示差异达0．05显著水平。下同。
Note：Analysis with Duncan’s multiple-rang test，different letter meant significant of difference at 0．05 leve1．The same he low
2．3不同培养时间菌液粗毒素对外植体出芽的影响
取 NA平板培养的青枯菌菌落，配制成菌悬液，
无菌条件下在 5份 100 mL的 NA液体培养基中分
别加入 1 mL菌悬液，振荡培养 4、12、24、72、120 h，
然后分别置备菌液粗毒素，以 20 体积比加入 MT十
BA 0．05 mg／L培养基中，以未加菌液粗毒素的 MT
+BA0．05 mg／L培养基为对照，考察不同培养时间
的菌液粗毒素对外植体出芽的影响。统计外植体在
培养 lO、20、3O d后的出芽率。从表3可知，叶片在培
养 10 d后各处理均未出芽；培养2O d时，加人培养l2
h菌液粗毒素的处理仍未出芽，其它处理均有不同程
度的出芽；培养 30 d时，加入培养 12 h菌液粗毒素的
处理出芽率为 1O．33 9，6，其它处理大多数叶片均能出
芽，其中加入培养 72、120 h菌液粗毒素的处理出芽
率与对照相同，均为 100 9／6。茎段培养的不同时间内，
出芽率均比叶片高，仅培养 l2、24 h的青枯菌粗毒素
对出芽有明显的抑制作用，带节茎培养 30 d时，出芽
率分别为 36．11 、73．33 ，其它处理出芽率均为
100 。实验还观察到，叶片培养 10 d后，对照外植
体基部膨大，加入培养4、l2、24 h菌液粗毒素的处理
开始变黄，而加入培养 72、120 h的菌液粗毒素的处
理则无明显变化，随着培养时间的延长，部分变黄的
5期 张燕玲等：广藿香抗青枯病离体筛选技术的研究 68l
外植体逐渐变褐死亡；外植体再生芽的生长情况，加
入培养 l2、24 h的菌液粗毒素的处理，芽较细小，叶
色发黄，尤以12 h处理更明显。因此 ，以培养 12 h的
青枯菌粗毒素对外植体有较大的致毒性 ，外植体变
褐死亡现象较突出，出芽率也明显降低；同时，不 同
外植体对青枯菌粗毒素的耐受性不同，带节茎比叶
片抗青枯菌粗毒素的能力更强。培养 12 h后 的菌
液粗毒素对出芽的影响力下降 ，可能是因为青枯菌
在 l2 h后随着培养时间的延长，活力逐渐下降，所
产生粗毒素的致毒性也逐渐减小 。
2．4不同浓度青枯菌粗毒素对外植体出芽的影响
以培养 12 h的青枯菌菌液，稀释成不同浓度，分
别制备成粗毒素，以2O％体积比加入 MT+BA0．05
mg／L培养基中，考察不同浓度青枯菌粗毒素对外植
体出芽的影响。从表 4可知，叶片在培养 lO d后各
处理均未出芽；培养 20 d后，对照出芽率已达 100％，
菌液浓度为 3．52x 10 ～7．O4×10 cfu／mL时，有较
高的出芽率，均在 59 以上 ，随着培养时间的延长，出
芽率上升；菌液浓度升至 1．41×10 cfu／mL时，叶片
培养 20 d仍未出芽，至 3O d后出芽率仅为 23．33 ；
菌液浓度继续升至 3．52×10 cfu／mL，叶片培养 30 d
后，出芽率仍为 0。茎段培养的不同时间内，出芽率
均比叶片高，菌液浓度为 3．52×10 ～7．O4×10 cfu／
mL时，lO d后达到较高出芽率，且随着培养时间的延
长，出芽率上升，30 d后均达 100 ；菌液浓度为 1．41
×10 cfu／mL和 3．52×10。cfu／mL时，出芽率明显降
低 ，30 d后出芽率仅为 36．1l 和 25．OO 。结果表
明，浓度在 1．41×108 cfu／mL以上的菌液粗毒素对
外植体有明显的抑制和毒害作用 ，大多外植体枯黑死
亡。不同外植体出芽率所受影响，并不随着制备粗
表 4 不同浓度青枯菌液制备的粗毒素对外植体 出芽的影响
Table 4 Effect of the crude toxins from different concentrations of R．solanacearum on shoot formation
表 5 不同浓度青桔菌液制备的粗毒素对生根的影响
Table 5 Effect of the crude toxins from different concentrations of R．sola玎ace口r 7 on root formation
毒素菌液浓度的增加而增大 ，原 因可能是粗毒素在
一 定浓度时，除了外植体的毒害作用外，还有部分类
激素作用 ，出芽率是两者综合表现的结果 。陈耀锋
等(1997)在研究镰刀菌毒素对小麦组织离体培养的
影响时，也得出相似的结果。
2．5不同浓度青枯菌粗毒素对生根的影响
以培养 12 h的青枯菌菌液，稀释成不同浓度，
分别制备成粗毒素，以 20 体积 比加入 MT+
IBA0．2 mg／L培养基中，考察青枯菌粗毒素对生根
的影响。从表 5可知 ，制备粗毒素的菌液浓度为 0
～ 7．O4×10 (cfu／mL)，培养 5 d时，较多无根苗开
始生根 ，随着培养时间的延 长，生根率继续上升，至
培养 20 d时，生根率均达 100 。制备粗毒素的青
枯菌浓度升至 1．41×10 cfu／ml，无根苗培养 20 d
时还未能生根，培养 30 d时，生根率仅为 13．33 。
菌液浓度继续升高至 3．52×10 cfu／mL，生根率为
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0。实验还观察到，制备粗毒素的的菌液浓度在
1．4l×10 efu／mL以上时，对无根苗本身具明显的
毒害作用，无根苗基部变黑，叶片变黄，生长不良。
3 讨论
植物青枯病是 由青枯菌引致的一种植物毁灭性
病害，目前还没有有效杀青枯菌的商业化制剂 ，而栽
培措施防治在实施上存在 困难 ，青枯病的防治更依
赖于抗病育种(韦爱梅等 ，2006)。Toyoda等(1989)
以综合性状优良的番茄感病 品种作起始材料 ，通过
施加毒素压力，对成千上万个细胞进行选择，得到具
有可遗传抗 性的抗 青枯病 突 变体。Baruah等
(1995)采用相似方法也获得稳定的番茄抗病突变
体。在植物离体培养的培养基中加入适量致病毒素
以杀死敏感细胞，选出抗病细胞，即以细菌或真菌等
病原菌所产生的致病毒素作为选择压力筛选抗病突
变体，是植物抗病育种的重要方法。致病毒素致病
的原因可能是其堵塞了导管，也可能是其产生过度
流体静压力而使导管破裂等(王军，2005)。导管的
堵塞和破裂等都使得营养物质无法输送至各个植物
细胞，从而导致外植体的褐变、枯萎甚至死亡，在以
致病毒素作为压力进行植物抗病育种离体筛选试验
中，常认为外植体的褐变、死亡与毒素的致病力成正
比。本试验研究了粗毒素不同制备方法、青枯菌不
同培养时间及不同菌液浓度对外植体出芽及生根等
的影响，确定了青枯菌粗毒素对广藿香不同离体培
养阶段的致毒性，建立了以青枯菌粗毒素为选择压
力的广藿香离体筛选体系。
测定细菌菌液浓度的传统方法一般有平板计数
法和比浊法，平板计数法虽然结果准确但耗时较长
且比较烦琐，比浊法虽然方便迅速但结果不够准确
(徐涛伟等，1996)。我们将测定的不同浓度的青枯
菌菌液的吸光度(A)值，分别与涂平板计数结果相
对应 ，制作细菌数对 A值的标准 曲线 ，建立一种实
时测定青枯 菌菌液浓度 的方法。根据 朗伯一 比尔
(Lambert—Beer)定律 ，对各类低浓度溶液吸光值定
量进行测定时，浓度过高或过低都能影响测定结果
的准确性(南京大学，l996)，因此我们选定 A值在
0．943以下菌液进行稀释，保证所有待测样品 A值
均在分光光度计可信值之内，结果证明在此范围内，
青枯菌的吸光度与其浓度之间呈相关性。
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