全 文 ：·578· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月
药材与资源
大肠杆菌CodA基因表达赋予转基因青蒿负选择表型
冯丽玲，杨瑞仪，杨雪芹，曾庆平
(广州中医药大学热带医学研究所，广东广州 510405)
摘 要：目的 为了验证CodA基因是否适宜作为有效的青蒿基因打靶负选择标记。方法用PCR法扩增大肠杆
菌胞嘧啶脱氨酶基因CodA，经克隆和测序后插入植物基因表达载体pROKⅡ，并导入根癌农杆菌LBA4404
(pAL4404)中。以共培养法转化青蒿叶盘，在添加25pg／mL卡那霉素(Kan)的N6培养基上选择青蒿转化愈伤组
织并再生绿芽。将Kan抗性转基因青蒿芽转植到含有500pg／mL5-氟胞嘧啶(5一FC)和25pg／mLKan的MS培养
基上继续培养2周。结果转基因青蒿芽全部死亡，而未转化青蒿芽仍正常生长，表明导入CodA基因的青蒿细胞
已赋予其预期的负选择表型。经RT—PCR检测，转基因青蒿芽显示CodA阳性扩增带，而未转化青蒿芽无此特异扩
增带。这一结果显示，CodA基因已在青蒿细胞中转录生成相应的mRNA，从而进一步印证了表型检测结果。结论
CodA基因可作为有效的青蒿基因打靶负选择标记。
关键词：青蒿；基因打靶；负选择
中图分类号：R282．12 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)04—0578～05
ExpressionofC dAgenefromEscherichiacoliconferingane ative
selectionphenotypeontransgenicArtemisiaannua
FENGLi—ling，YANGRui-yi，YANGXue—qin，ZENGQing—ping
(TropicalMedicineInstitute，GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，Guangzhou510405，China)
Abstract：ObjectiveToexplorethfeasibilityofu ilizingthecytosinedeaminaseA(CodA)geneas
aneffectivenegativeselectablemarkerinArtemisiaannuaforgenetargeting．MethodsThePCRproce—
durewasemployedtoamplifyCodAgenefromEscherichiacol ．Afterbeingclonedandsequenced，the
genewasinsertedintoaplantexpressionvector，pROKⅡ，andthenintroducedintoAgrobacteriumume-
／&ciensLBA4404(pAL4404)．The1eardisksofA．annuaweretransformedbythCO—cultivationprot eol，
afterwhicht etransformedcalliw reselectedangreenshootsofA．annuawereregeneratedonN6medi—
umsupplementedwith25弘g／mLKanamycin(Kan)．ThentheKan—resistanttransgenicshootsweretrans—
plantedontotheMSmediumcontaining500#g／mL5-fluocytosine(5一FC)plus25弘g／mLKanandcontin—
uouslyculturedforuptotwoweeks．ResultsThetransgenicshootshavetotallydiedwhileuntrans——
formedshootsstillkeptnormalgrowth，indicatingthatA．a nuacellsintroducedintotheCodAgenehad
conferredanexpectednegativesel ctionphenotype．WhendetectedbyRT—PCR，thetransgenicshootsdi —
playedaCodA—positiveamplifiedban ，butun ransformedshootsgavenosuchCodA—specificamplified
pattern．ThisresultsuggestedthatCodAgenehadtranscribedintocorrespondingmRNAin ．annuacells
withfurtherlyverifyingtheresultofphenotypicassay．ConclusionTheCodAgenecanbeutilizedasan
effectivenegativeselectablemarkerinA．annuaforgenetargeting．
Keywords：ArtemisiaannuaL．；genetargeting；negatives lection
正负双向选择标记的应用已成为植物基因打靶
中富集同源重组体的新策略‘1|。迄今报道的植物正
选择标记多达10余种，主要是抗生素抗性基因，如
赋予卡那霉素(Kan)抗性的新霉素磷酸转移酶
收稿日期：2004—06—27
基金项目：国家自然科学基金新技术探索项目(30271591)、国家中医药管理局基础研究项目(02一03zP43)、广东省自然科学基金重点项
目(020799)、健桥科研基金项目(JQ0205)。
作者简介：冯丽玲(1975一)，女，广东广州人，学士，助理研究员，主要从事中药生物工程研究。
Tel：(020)36585422Fax：(0 0)86373516E—mail．．fenglilingl@21cn．corn
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月·579·
(NPT1I)基因和赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转
移酶(HPT)基因等，但负选择标记仅有大肠杆菌胞
嘧啶脱氨酶基因(cytosinedeaminaseA，CodA)[21和
双翅目昆虫毒蛋白基因(diphtheriatoxinA，DT—
A)[31等。细菌CodA基因编码的胞嘧啶脱氨酶可催
化无毒的5一氟胞嘧啶(5-FC)转变成有毒的5一氟尿
嘧啶(5一FU)。在动植物细胞中表达细菌CodA基因
可使其在添加5-FC的培养基上迅速死亡，从而赋
予“自杀”(负选择)表型。
自1993年Perera等H1首次将CodA基因用作
植物负选择标记以来，至今已成功地应用于拟南
芥‘56|、烟草‘7引、大麦‘93和日本黄连‘10|。最近据
Tarada等口玎报道，水稻愈伤组织对5-FU表现较强
的耐受性，因此CodA基因不宜作为转基因水稻中
可靠的负选择标记。为了验证CodA基因是否适宜
作为青蒿的负选择标记，本实验从大肠杆菌中扩增
了CodA基因，并将其与花椰菜花叶病毒(CaMV)
35S启动子融合后插入T—DNA末端内侧，然后通
过根癌农杆菌双元载体介导的共培养转化系统导入
青蒿细胞。经过选择培养，已成功地获得Kan抗性
和5-FU敏感的转基因青蒿芽，并在分子水平上进
行了验证，为进一步在青蒿中实施基因打靶奠定了
基础。
1材料
1．1植物种子：青蒿种子采自四川酉阳地区大田栽
培青蒿，由广州华立健药业有限公司提供。
1．2菌种及质粒：大肠杆菌JMl09菌种由本室保
存；pTarget载体购自Promega公司；根癌农杆菌
LBA4404(pAL4404)菌株及Ti质粒载体pROKⅡ
由中国科学院微生物研究所提供。
1．3抗生素和植物激素：头孢霉素(Cef)、卡那霉素
(Kan)、5-氟胞嘧啶(5一FC)为Sigma公司产品，利福
平(Rif)为广东台山新宁制药厂产品，6一苄氨基嘌呤
(BA)为新华活性材料研究所产品，a一萘乙酸
(NAA)为上海曹杨第二中学化工厂产品。
1．4扩增引物：按文献[12]设计大肠杆菌CodA基
因扩增引物，并委托大连Takara公司合成。末端无
酶切位点的上游引物CodAl的序列为：57一AT—
GTCGAATAACGCTTTA一37；下游引物CodA2的
序列为：57一TCAACGTTTGTAATCGAT一37。末端
有BamHI酶切位点的上游引物CodA—B的序列
为：57一GGATCCATGTCGAATAACGCTTTA；末
端有I@nI酶切位点的下游引物CodA—K的序列
为：57一GGTACCTCAACGTTTGTAATCGAT。
1．5 试剂盒：质粒提取试剂盒、植物DNA提取试
剂盒、植物RNA提取试剂盒购自Omega公司；质
粒DNA纯化试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自
LifeTechnologies公司；PCR扩增试剂盒、RT—PCR
扩增试剂盒购自Takara公司。
2方法
2．1 CodA基因扩增、pT—CodA构建和CodA基因
测序：以大肠杆菌JMl09菌液制备的DNA为模板，
利用CodAl和CodA2扩增引物进行PCR扩增，扩
增条件为：94℃、1min，55℃、1min，72℃、3min，
共30个循环。将凝胶回收的PCR产物与pTargeT
载体连接，转化JMl09感受态细胞，涂板，蓝白斑筛
选重组质粒pT—CodA，用T7启动子引物测序。
2．2 pROKⅡ一CodA构建及酶切鉴定：以pT—
CodA重组质粒为模板，利用CodA—B和C0dA—K
扩增引物进行PCR扩增，扩增条件为：94℃、1
min，55℃、1min，72℃、3min，共30个循环。将
BamHI和脚咒I酶切PCR产物后所得片段插入
相同酶切的pROKII载体中，获得中间表达载体
pROKⅡ一CodA。以pROKⅡ一CodA转化JMl09感
受态细胞，挑取单菌落，用BamHI和gpnI进行双
酶切鉴定。
2．3 pROKⅡ一CodA导人根癌农杆菌及青蒿培养细
胞[13|：用pROKⅡ一Coda直接转化根癌农杆菌
LBA4404(pAL4404)感受态细胞，以50肛g／mLRif
和25弘g／mLKan选择转化。选取8～10d叶龄的青
蒿无菌幼苗，将叶片剪成5mm长小块，转入N6培
养基(0．5gg／mLNAA)中，于25℃光照下预培养
2d。将预培养材料用稀释的农杆菌菌液浸泡lmin，
吸去多余菌液后放回N6培养基(o．5Fg／mLNAA)
中，28℃黑暗中培养2d，再转到N6培养基(o．3肛g／
mLNAA)中，25℃光照下培养2d，最后转入含25
弘g／mLKan和500Fg／mLCef的MS培养基(1Fg／
mLBA+0．2Fg／mLNAA)中继续培养。
2．4转基因青蒿的筛选培养：在含1pg／mLBA+
0．2肛g／mLNAA及25Fg／mLKan+500>g／mL
Cef的正选择培养基上筛选Kan抗性转基因青蒿
芽，转入含1弘g／mLBA+0．2弘g／mLNAA及500
gg／mL5-FC、25gg／mLKan和500弘g／mLCef的
正负双向选择培养基上继续培养，同时用未转化的
正常青蒿芽作为对照。
2．5转基因青蒿RNA提取与RT—PCR扩增：将转
基因青蒿芽和未转化的正常青蒿芽放入液氮冻于
后，按RNA纯化试剂盒说明书提取总RNA。将
万方数据
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RNA用DNA酶消化，经抽提和沉淀后进行RT—PCR
PCR扩增，扩增条件为：50℃、30min一85℃、
1rain，45℃、1min，72℃、1min，共30个循环。
3结果与讨论
3．1 目的基因的扩增、克隆和测序：大肠杆菌
JMl09菌株DNA经CodA基因特异PCR扩增和
凝胶电泳，可检测到长度约为1．3kb的特异扩增区
带(图1)。该扩增带的大小与大肠杆菌CodA基因
的实际长度(1284bp)相符[1引，表明其为CodA基
因的阳性扩增产物。
。
呸
劬I+BamHI I
35S一花椰菜花叶病毒届动子Ter一胭脂碱合成酶基因终止子
35S——CaMVpromoterT —-NOSpolyAsignalsite
图2中间表达载体的构建
Fig．2Constructionofintermediatevector
1一^DNA／HindⅢ相对分子质量标准2-PCR产物
1一XDNA／HindⅢmarkers2一PCRamplicon
图1大肠杆菌CodA基因PCR扩增产物
Fig．1PCRampliconofCodAgenefromE．coli
将扩增产物克隆后进行序列分析，结果与已发
表的大肠杆菌CodA基因序列(GenBank登记号
$56903)相同，进一步证实该扩增序列为CodA基
因。本研究测得的CodA基因序列已被GenBank收
录(GenBank登记号AY552602)。
3·2 中间表达载体的构建与鉴定：将携带BamHI 1一pROKⅡ(B。HI+Kp。I)双酶切产物
和脚竹I酶切位点的CodA基因PCR扩增产物与 2-pROKⅡ一C。dA(B。。HI+酗 I)双酶切产物
pROKⅡ同时用KbnI和BamHI消化，然后经T4 3一xDNA／EcoRI+Hindm相对分子质量标准
DNA连接酶连接而获得重组质粒pROKⅡ一CodA 1一PRoK“(B—H1+印n
1’
c蚴。 2-。p汕RONKAI嚣，‘僦1兰。二’
将pROKⅡ一C。dA与pROKⅡ用BamHI和
图3 pRoKⅡ一CodA的酶切鉴定
劫以I进行双酶切，结果pROKⅡ一CodA可产生大 Fig．3IdentificationofpROKⅡ一CodA
小2个片段，其中小片段的长度为1．3kb，pROK“ byenzymecI avage
只产生1个片段(图3)。这一结果显示，CodA基因白化现象(图4b)，而转基因青蒿芽则出现发白和变
已被成功克隆到中间表达载体中。 枯等现象(图4c)，2周后全部死亡(图4d)。
3．3青蒿的转化与选择培养：经共培养转化的青蒿 以上结果表明，外源NPTⅡ基因和CodA基因
叶盘在加有Kan的正选择培养基上生长4～6d后， 都已在转基因青蒿芽中表达，使其对Kan具有抗
叶盘周边长出颗粒状愈伤组织，并不断膨大，14～21性，而对5一FC表现敏感；相反，未转化青蒿芽中因
d开始出现绿芽分化，继续培养并淘汰白化芽及畸 无CodA基因而不受5一FC的影响。Perera等‘43发
形芽后，可获得生长及形态正常的Kan抗性转基因 现，由于重复基因诱导的基因沉默，某些含有多拷贝
青蒿芽(图4a)，转化率为15％。将转基因青蒿芽与CodA基因的转基因拟南芥仅有低水平的CodA基
未转化青蒿芽转植在含有500弘g／mL5-FC的负选因表达，故对5-FC不甚敏感。本研究尚未对CodA
择培养基上培养1周后，未转化青蒿芽生长正常，无 基因整合的拷贝数进行分析。
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月·581·
3．4转基因青蒿芽的RT—PCR检测：以DNA酶消
化的转基因绿芽RNA为材料进行RT—PCR扩增，
同时设置对照，检测CodA基因是否已在青蒿细胞
中表达，结果如图5所示。
无DNA的转基因青蒿芽总RNA经RT—PCR
扩增后，可见约1．3kb的扩增产物(3泳道)，这与
CodA基因的大小一致(2泳道)。无DNA的转基因
青蒿芽总RNA经PCR扩增后，未检测到相应的扩
产物(4泳道)，表明青蒿基因组中的CodA基因
已被DNA酶消化。未转化青蒿芽总RNA中因无可
扩增CodA基因模板而无扩增产物(5泳道)。这一
结果表明，CodA基因在青蒿细胞中已转录生成相
应的mRNA，而对照细胞无扩增信号，表明其中无
CodA对应的基因拷贝及转录产物。
a未加5一FC的转基因青蒿芽b一加5-FC的未转化青蒿芽c一加5一FC的转基因青蒿芽(1周)d一加5一FC的转基因青蒿芽(2周)
a—transgenicshootsofA．annuanotby5一FCb-untransgenicshootsofA．御2n“nby5一FCc—transgenicshootsofA．annua
by5-FC(oneweek)d-transgenicshootsofA．annunby5一FC(twoweeks)
图4转基因青蒿芽的筛选
Fig．4ScreeningoftransgenicshootsofA．annua
常罕见[14|。因此，通常植物基因打靶的效率非常低，
一般在10q～10_5L15|，而且成功的报道很少，目前
仅见3例[11,16,173。为了富集植物基因打靶中的同源
重组体，常用的策略是利用正负双向选择标记区分
同源重组与非同源重组，其中正选择标记位于同源
序列以内，用于筛选全部整合体，包括定点整合与随
机整合；负选择标记位于同源序列以外，用于淘汰随
机整合体。以大肠杆菌CodA基因作为负选择标记
的筛选技术已在少数几种植物中建立[3“⋯，本研究
1 100bp梯度分子量标准2-pROKⅡ一CodA质粒的PCR产物首次应用CodA基因作为负选择标记进行转基因青
3_转基因芽总RNA经DNA酶消化并去蛋白后的RTPCR产物 蒿芽的快速筛选，将为下一步实施青蒿基因工程改
4一转基因芽总RNA经DNA酶消化并去蛋白后的PCR产物造打下良好的基础。
5一未转基因芽总RNA经DNA酶消化并去蛋白后的RT—PCR产物
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E53G23。l：l。799。3-M79E9．，si。d—P。g。。tP，whi 。CI．P。。iti。。。g。ti。。
整合方式均以“非同源末端连接”(non—homologoussetectionandT—DNAstabilityinArabidoD5istran formation
endjoining，NHEJ)即随机整合为主，而同源重组E6]导蠹冀nHt，Mvoli州BioJl,F1，9E991“,3d99：。8A3-，9三a1．P0si。i。 。gative
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荒漠肉苁蓉茎腐病的初步研究
程齐来1，陈君h，于晶1，刘杏忠2，孙炳达2，程惠珍1
(1．中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京100094；2．中国科学院微生物研究所
真菌地衣系统学重点实验室，北京 100080)
摘 要：目的 分离和鉴定肉苁蓉茎腐病病原菌，研究其生物学特性，并室内筛选对该病原菌有效的杀菌剂。方法
组织分离法和菌丝尖端纯化法得到主要病原菌，通过测量不同营养条件下菌落生长直径研究其生物学特性，平皿
菌丝生长抑制法进行杀菌剂的生物测定。结果 接骨木镰刀菌Fusariumsambucinum是肉苁蓉茎腐病的主要病原
菌，为首次记录；适合其生长的培养基为PSA培养基，对碳和氮的吸收主要以蔗糖和蛋白胨为主，适宜生长温度为
lo～30℃，适宜生长pH为6～8；多菌灵、菌线威、绿享二号在室内可以有效地抑制病原菌。结论该病原菌的分离
鉴定可以为该病害原的防治提供理论依据。
’
关键词：肉苁蓉；茎腐病；接骨木镰刀菌；杀菌剂
中图分类号：R282．2 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)04—0582一05
StemrotofCistanchedeserticola
CHENGQi—lail，CHENJunl，YUJin91。LIUXing—zhon92，SUNBing—da2，CHENGHui—zhenl
(1．InstituteofMedicinalPl nt，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，
Beijing100094，China；2．KeyLaboratoryofSystematicMycologyandLichenology，Institute
ofMicrobiology，ChineseAcademyofSciences，Beijing100080，China)
Abstract：ObjectiveToisolatendidentifypathogenofCistanchedeserticolastemrot，studyitsbio～
logicalharacteristics，andselecttheffectivefungicidesagainstthepathogenicbacteria．MethodsThe
mainpathogencanbegainedbytissueisolationandmyceliumcusppurification，thebiologicalcharacteris～
ticscanbestudiedbymeasuringthegrowthdiameterunderdifferentnutrientconditionsandseededthehy～
phaediskatthecentreofagarplatecontainingchemicalstodofungicideb oassay．ResultsFusariumam～
bucinumwasthemainpathogenicbacteriaonC．deserticolastemrotwhichwasfirstrecorded；itssu able
mediumwasPSAculturemedium；amongthecarbona dnitrogensourcessupplied，saccharoseandpep～
toneweremostavailable：thetemp raturerangeofitsgrowthwas1O一3O oCanditgrewbestbetween6—
8pHvalue．Duojunling(carbendazim)，Junxianwei(1．5％methanedithiocyanate)，LijxiangNo．2(80％
收稿日期：2004—09—11
基金项目：国家科技部西部专项(2002BA901A32)
*通讯作者Tel：(010)62899731
万方数据
大肠杆菌CodA基因表达赋予转基因青蒿负选择表型
作者： 冯丽玲， 杨瑞仪， 杨雪芹， 曾庆平， FENG Li-ling， YANG Rui-yi， YANG Xue-qin，
ZENG Qing-ping
作者单位： 广州中医药大学热带医学研究所,广东,广州,510405
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(4)
被引用次数： 1次

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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200504040.aspx