全 文 ：中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月·1857·
药材与资源
青蒿鲨烯合酶基因打靶研究
冯丽玲，杨瑞仪，杨雪芹，曾庆平+
(广州中医药大学热带医学研究所，广东广州 510405)
摘 要：目的 通过代谢途径工程调整代谢流向，试图增大转基因青蒿Artemisiaannua植株中的青蒿素产量。
方法利用青蒿鲨烯合酶(ss)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因和胞嘧啶脱氨酶(CodA)基因构建基因打靶载
体，并通过冻融法将载体导入根癌农杆菌Agrobacteriumumefaciens。以叶盘法转化青蒿，采用“分段选择法”筛选
转基因再生植株。结果对表达GFP基因后发出绿色荧光的转基因植株，采用PCR及PCR产物杂交法，在1棵
转基因植株中检测到外源GFP基因，而未检测到内源SS基因。初步证据显示，在转基因青蒿植株中，突变型sS
基因已取代野生型SS基因。结论青蒿鲨烯合酶基因打靶已取得初步成功。
关键词：青蒿；鲨烯合酶；基因打靶；基因敲除
中图分类号：R28z．】 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)12—1857—05
GenetargetingofsqualenesynthaseinArtemisiaannua
FENGLi—ling，YANGRui—yi，YANGXue—qin，ZENGQing—ping
(InstituteofTropicalMedicine，GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，Guangzhou510405，China)
Abstract：ObjectiveToincreaseartemisininy eldintransgenieArtemisiaannuaplantsbyregulating
metabolicaffluxionthroughmetabolic‘pathwayengineering．MethodsThegenetargetingvectorwas
constructedbysqualenesynthase(SS)geneofA．annua，greenfluorescentpro ein(GFP)gene，and
cytosinedeaminase(CodA)gene，andthevectorwasintroducedintoAgrobacteriumumefaciensbyfreeze—
thawingprocedure．A．annuawastransformedthroughLeafDiskmethodandregeneratedtransgenic
plantswerescreenedbythe“Step—by—StepSelection”．ResultsAmonghetransgenieA．annuapl nts
emittinggree帝fluorescenceafterxpr ssionofGFPgene，theexogenousGFPgeneratherthanendogenous
SSgenewasdetectedinonetransgenicplantbyPCRaswellashybridizationofPCRproducts．The
preliminarydatashowedthatthewild—typeSSgenewasreplacedbymutatedSSgeneinthetransgenicA．
annuaplant．ConclusionGenetargetingofsqualenesynthasesofA．annuaiSsuccessful．
Keywords：ArtemisiaannuaL．；squalenesy thase(SS)；genetargeting；geneknockout
青蒿素(artemisinin)是最有效的抗疟化学药
物单体，对氯喹等传统抗疟药表现抗性的疟原虫也
有高效和速效杀灭效果口]，至今未见疟原虫产生抗
性，已成为全球抗疟药物的最大希望[2]。可是，受品
种、产地和气候条件等因素的限制，现有青蒿素的产
量远远不能满足市场需求，而常规栽培育种方法在
提高青蒿素产量中的作用又十分有限。因此，采用基
因工程手段培育高产青蒿素品种正在受到国内外学
者的广泛关注[3“]。
青蒿素是青蒿经类异戊二烯次生代谢途径形成
的倍半萜衍生物，天然合成量极低(通常在1％以
下)[5]。从类异戊二烯途径中碳源的流向来看，甾类
作为主要代谢产物成为碳流的主导者，而倍半萜类
作为次生代谢产物只能分享部分碳流。因此，为了将
碳流从甾类途径“分流”至倍半萜类合成途径，最佳
办法是从生化角度抑制甾类合成酶的活性或采用基
因敲除(geneknockout)手段阻断甾类合成酶基因
的表达。本试验室尝试利用“基因打靶”(gene
targeting)技术，通过对甾类合成关键酶——SS基
因的野生型与突变型的交换重组进行基因敲除，最
终获得稳定遗传的转基因高产青蒿素品系。
本实验采用携带SS基因、GFP基因(报告基
因)和CodA基因(负选择标记基因)构建的基因
打靶载体的根癌农杆菌对青蒿外植体进行共培养转
收稿日期：2006—03—10
基金项目：国家中医药管理局资助项目(02—03ZP43)；广东省自然科学基金重点资助项目(020799)
作者简介：冯丽玲(1975一)，女，广州人，学士，助理研究员，从事中药生物工程研究。
Tel!(020)36585422Fax：(0 0)86373516E—mail：fenglilingl@21cn．corn
*通讯作者曾庆平E—mail：qpzeng@gzhtcm．edu．cn
万方数据
·1858· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月
化，并诱导形成愈伤组织及再生转基因植株。以荧光
显微镜挑选发射绿色荧光的转基因植株叶片，通过
PCR扩增及PCR扩增产物杂交，初步显示基因打
靶已获得成功。
1材料
1．1青蒿叶片：采自四川酉阳种植青蒿所收种子发
芽后离体生长的叶片。
1．2菌种及质粒：大肠杆菌JMl09菌种由本室保
存；pTargeT载体购自Promega公司；根癌农杆菌
LBA4404(pAL4404)菌株及Ti质粒载体pROK
Ⅱ由中国科学院微生物研究所提供。
1．3抗生素：卡那霉素(Kan)为Sigma公司产品，
羧苄青霉素(Carb)为Invitrogen公司产品，利福
平(Rif)为广东台山新宁制药厂产品。
1．4扩增引物：分别设计带有末端酶切位点Hind
Ⅲ(用下划线表示)的SS基因扩增引物SS一1一H：
57一AAGCTTATGAGTAGTTTGAAAGCAGTA—
TTGAAACAC一37，SS 2一H：57一AAGCTTTTAC—
AAAGTGAATTCTGCAGAGAGTAAGCA一37；不
带末端酶切位点的SS基因扩增引物SS一1：5，-
ATGAGTAGTTTGAAAGCAGTATTGAAACA—
C一37，SS一2：57一TTACAAAGTGAATTCTGCAG—
AGAGTAAGCA一3’；分别带有末端酶切位点Xho
I和EcoRI的GFP全基因扩增引物GFP一1一X：
57一GGCTCGAGACCGGTCGCCACC一37，GFP一2一E：
5-GAATTCTAGAGTCGCGGCCGC一37，不带末端
酶切位点的GFP基因片段扩增引物GFP—l：5，_
CAAGGGCGAGGAGCTGTTCA一37，GFP一2：57一
GTGCTCAGGTAGTGGTTGTC一37，均委托大连
Takara公司合成。
1．5试剂：质粒提取试剂盒、植物DNA提取试剂
盒、植物RNA提取试剂盒购自Omega公司；质粒
DNA纯化试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自Life
Technologies公司；PCR扩增试剂盒购自Takara
公司；dNTP、Bio一11一dUTP、DAB浓缩显色液购自
华美公司。
2方法
2．1 载体构建
2．1．1 中间载体pRSC的构建：以青蒿SS基因[63
为模板，利用添加了酶切位点的SS一1一H和SS一2一H
引物进行PCR扩增，扩增条件：94℃、30S，57℃、
1min，72℃、5min，共30个循环。将凝胶回收的
PCR产物用HindⅢ酶切后，电泳回收酶切片段，
插入用相同酶切并去磷酸化的pRCodA载体[71中，
获得中间载体pRSC。
2．1．2 中间载体pGSN的构建：将pROKⅡ上的
CaMV35S启动子插入pEGFP的PstI和BamH
I之间，再将pROKⅡ上的Nos终止子插入pEGFP
的NotI和EcoRI之间，获得中间载体pGSN。
2．1．3基因打靶载体pRSCG的构建：用XhoI酶
切中间载体pGSN，电泳回收35S—GFP—Nos片段，
插入用相同酶切并去磷酸化的中间载体pRSC中，
获得pRSCG基因打靶载体。
2．2根癌农杆菌转化：用冻融法[83将基因打靶载体
pRSCG导入根癌农杆菌LBA4404(pAL4404)中。
2．3青蒿的转化和再生：选取12～15d叶龄的青
蒿叶片 剪成大小为0．5mm×0．5mm的叶块，置
于附加5mg／L6-BA和0．5mg／LNAA的MS培
养基上，于25℃暗培养2d。挑取YEB平板(Kan
25mg／L+Rif50mg／L)上含pRSCG的根癌农杆
菌单菌落，接种于4mLYEB(Kan25mg／L+Rif
50mg／L)培养液中，于28℃、180r／min振荡培养
过夜。取400pL菌液转接入20mL无抗生素的
YEB培养液中培养，离心，弃上清，加入20mLMS
培养液悬浮菌体，转入无菌容器中。将预培养材料取
出，倒入稀释菌液，轻轻摇晃1min，立即取出外植
体置无菌滤纸上吸去多余菌液。将外植体转入附加
200gmol／L乙酰丁香酮(AS)的MS培养基中，于
25℃黑暗下共培养2d，转入附加5mg／L6一BA、
0．5mg／LNAA和500mg／LCarb的MS培养基
上进行脱菌培养。每隔7d更换1次新鲜杀菌培养
基，4～5周后将Carb降至125mg／L。待丛生芽长
出后，将6-BA和NAA分别改为1mg／L和0．2
mg／L，最后将新芽移置三角瓶中(1／zMS+NAA
0．5mg／L+Carb125mg／L)生根。
2．4荧光观察与照相：将转基因再生芽放在载玻片
上，用盖玻片压片，同时将未转基因再生芽作为对
照，在LeicaMPS60荧光显微镜下，观察转基因再
生芽的荧光发射现象，并采用LeicaDMRA2自动
成像系统拍照。
2．5 PCR
2．5．1DNA提取：将转化的青蒿叶片放人液氮中
充分研磨，按试剂盒所述方法提取总DNA。
2．5．2GFP基因扩增：反应体积为50弘L，其中
10×buffer3肛L，dNTP(2mmol／L)3pL，GFP一1
弓l物(35pmol／L)1弘L，GFP一2弓I物(34pmol／L)
1肛L，模板DNA(200ng／弘L)3ttL，TaqDNA聚
合酶(3U／t-L)1肛L，加无菌水定容至50弘L。样品
万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月·1859·
经95℃变性3min后，按下列程序进行扩增：94
℃变性30S，57℃复性30S，72℃延伸2min，30
个循环后，72℃延伸10min。
2．5．3SS基因扩增：SS一1(30pmol／L)1肛L，SS-2
(30pm01)1弘L，其他成分及条件同上，延伸时间改
为5min。
2．6 PCR产物杂交：PCR产物经0．8％琼脂糖凝
胶电泳分离后，将凝胶放在20×SSC浸润的尼龙膜
上，采用高盐转移法转膜后，将膜在紫外交联仪中照
射10min。以bio一11一dUTP扩增标记的GFPDNA
序列为探针，杂交，洗膜，按显色试剂盒说明书进行
显色。
3 结果
3．1基因打靶载体的构建：将中间载体pGSN和
pRSC合并，即由pGSN切出的35S—GFP—Nos片段
组装到pRSC中，构建了含有CaMV35S启动子控
制的GFP基因、CodA基因及分离成两段的SS基
因的植物基因打靶载体pRSCG(图1)。
RB
4--1920bp寸卜840bp斗I卜-762bp-一卜265bp斗I卜-1670bp-斗l
H X X H B K EJp1 867bp——一I
lt—--——————------———------—--——--------一5457bp——I+～2697bp———，II一3522bp——_IH—HindIi X—XhoI B—BamHI K—I@nI E—EcoRI RB—T—DNA右边界LB—T—DNA左边界
RB—rightborderofT—DNALB-leftborderofT—DNA
图1 SS基因打靶载体pRSCG的限制图谱
Fig．1RestrictionmapofSSgenetargetingvectorpRSCG
3．2基因打靶载体的酶切鉴定：将pRSCG用Xho
I和HindⅢ酶切，分别获得1867bp的35S—GFP—
Nos片段和54 7bp的SSl—35S—GFP—Nos—SS2片
段，其大小与图1所示预期值相符，表明打靶载体中
基因排列顺序正确(图2)。
1-pRSCG的Xho
I酶切产物
2—1000bpladder
3-pRSCG的Hind
I酶切产物
4-pRSCG质粒
1一pRSCG／XhoI
2—1000bpladder
3-pRSCGHindⅢ
4-pRSCGplasmid
图2 pRSCG的酶切鉴定
Fig．2IdentificationofpRSCGbyrestriction
enzymedigestion
3．3基因打靶载体的扩增鉴定：用GFP一1一X、SS一2
引物和GFP一2一E、SS一1引物扩增pRSCG，分别获得
2697bp的GFP—Nos—SS2片段和35 2bp的SSl-
35S—GFP片段，其大小与图1所示预期值相符，表
明打靶载体中SS基因插入方向正确(图3)。
3．4转化菌中基因打靶载体的检测：将pRSCG重
组质粒通过冻融法导入农杆菌后，从农杆菌中提取
1一以GFP一1一X、SS一2引
物的扩增 2一以GFP一3、
S孓1引物的扩增
3—1000bpladder
4一以GFP一2一E、SS一1引
物扩增5一以GFP一
2一E、SS一2引物的扩增
1-pRSCG／primerGFP一
1一X、SS一22-pRSCG／
primerGFP一3、SS一1
3—1000bpladder
4-pRSCG／primerGFP一
2一E、SS一15-pRSCG／
primerGFP一2一E、SS一2
图3 pRSCG的PCR鉴定
Fig．3IdentificationofpRSCGbyPCR
质粒，以GFP一1和GFP一2为引物进行PCR检测，
结果显示农杆菌LBA4404和大肠杆菌DH5a中均
携带pRSCG，并能扩增出600bp的GFP基因片段
(图4)，说明重组的pRSCG质粒已成功导入农杆菌
LBA4404中。
3．5转化细胞培养与植株再生：在未加抗生素的培
养基上，对转化的青蒿外植体进行愈伤组织培养和
植株再生。在长芽培养基上，转化的外植体培养2周
时长出愈伤组织，其上再生出幼芽；3周时幼芽长成
茂盛的小叶丛；4周时小叶扩展成大叶。5周后转接
到长根培养基上出现根系，继续生长至6周后获得
完整植株。结果如图5所示。
万方数据
·1860· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月
1一阳性对照(pRScG转化
的大肠杆菌PCR产物)
2—100bpladder3～5一
pRSCG转化农杆菌PCR
产物6一阴性对照(未转
化农杆菌PCR产物)
1-positivesample(PCR
productofpRSCGinE．
coli)2—100bpladder
3一S—PCRproductof
pRSCGinA．tumefaciens
6-negativesample(PCR
productof A．tume—
faciens)
图4大肠杆菌及农杆菌中GFP基因的PCR鉴定
Fig．4PCRIdentificationofGFPgeneinE．coli
andA．tumefaciens
3．6转化细胞的荧光镜检：将转基因再生叶片置于
荧光显微镜下观察，可见叶身发出较强的绿色荧光，
而未转化再生叶片则无绿色荧光(图6)，表明GFP
基因已在转基因细胞中表达而发出绿色荧光。
3．7 PCR扩增：采用相应的扩增引物对转基因植株
进行PCR扩增，可分别得到预期的600bp的GFP
基因片段(图6—2、3)及5457bp的Ssl—35S—GFP—
Nos—SS2基因片段(图6—8)，而未见青蒿植株原有的
SS基因片段。相反，从对照植株中则可扩增出3590
bp的SS基因片段(图6—6、7)。这一结果初步表明，
青蒿SS基因已由SSl—35S—GFP—Nos—SS2基因片段
取代，即已获得“基因敲除”成功的初步证据。
A一愈伤组织及再生幼芽(2周)B一再生小叶(3周)c一再生大叶(4周)D-生根幼苗(5周)E一完整植株(6周)
A—callusandregeneratedbuds(2weeks)B—regeneratedyoungleav s(3weeks)C—regeneratedleaves(4we ks)
D—regeneratedshoots(5weeks)E—wholeplants(6weeks)
图5转基因青蒿植株再生
Fig．5Regenerationof ransgenicA．annuapl nts
A一未转化再生叶片B-转基因再生叶片
A—anon—transformedlyregeneratedleafbuofA．annua
B—atransgenicregeneratedleafbuofA．annua
图6转基因青蒿的荧光检测
Fig．6FluorescenceassayoftransgenicA．annua
3．8 PCR扩增产物杂交：为进一步印证PCR检测
结果，用GFP基因和SS基因特异探针对PCR产
物进行杂交，结果仅预期大小的扩增片段有杂交带
(图7)。
4讨论
基因打靶技术的核心是基因敲除，即突变型基
因通过同源序列重组替换野生型基因。按基因敲除
的机制不同，可分为定点诱变与随机诱变，前者可用
于生物性状改良(代谢途径工程)，后者可用于基因
功能发现(功能基因组学)。自1997年Kempin首次
报道植物基因打靶成功以来‘9|，迄今仪住拟南芥m]
1一未转化植株以GFP一1一x、GFP一1一E引物的扩增2一转基因植株
以GFP一1一X、GFP一1一E引物的扩增3-pRSCG质粒以GFP一1一
X、GFP一1一E引物的扩增4-100bpladder5-1kbladder6～
7一未转化植株以SS一1、SS一2引物的扩增8一转基因植株以SS一1、
SS一2引物的扩增9-pRSCG质粒以SS一1、SS一2引物的扩增
I-amplificationofnon—transformedA．annuapl ntbyGFP—l—
X，andGFP一1一EPrimers2-amplificationoftransgenicA．
annuaplantbyGFP一1一XandGFP一1一EPrimers3-amplification
ofpRSCGplasmidbyGFP一1一XandGFP一1一EPrimers4-100
bpladder5-1kbladder6—7一amplificationof non—
transformedA．annuaplantbySS一1andSS一2Primers8一
amplificationoftransgenicA．annuaplantbySS一1andSS一2
Primers9-amplificationofpRSCGplasmidbySS一1andSS一2
Primers
图6转基因青蓠植株的PCR鉴定
Fig．6PCRIdentificationoftransgenicA．annuapl nts
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12,El·1861·
1-pRSCG质粒以GFP一1一X、GFP一1一E引物的扩增2一转基因植
株以GFP一1一X、GFP一1一E引物的扩增3一未转化植株以GFP一1一
X、GFP一1一E引物的扩增4一未转化植株以SS一1、SS一2引物的扩
增5-pRSCG质粒以SS一1、SS一2引物的扩增6一转基因植株以
SS—l、SS一2引物的扩增
1-amplificationofpRSCGplasmidbyGFP-r1-XandGFP—-1—-E
Primers2-amplificationoftransgenicA．a，znuaplantbyGFP-
1-XandGFP—l—EPrimers3-amplificationofnon—transformed
A．annuaplantbyGFP一1一XandGFP-1-EPrimers4一
amplificationofnon—transformedA．annuapl ntbySS一1and
SS—-2Primers5-amplificationofpRSCGplasmidbySS——1and
SS一2Primers6-amplificationoftransgenicA．annuapl ntby
SS一1andSS一2Primers
图7 PCR扩增产物的杂交检测
Fig．7HybridizationofPCRamplicons
和水稻[1”中取得了实质性成果。植物基因打靶研究
进展缓慢的主要原因是外源基因插入植物基因组的
方式通常以随机整合为主，定点整合异常罕见[12|，
因而导致植物中基因打靶效率极低(10_3～
10_)[13|。随着正一负标记筛选技术的建立，基因打靶
效率已经得到普遍提高。然而，由于选择标记基因表
达水平低、多拷贝标记基因沉默[143或植物细胞耐受
性[1明等原因，常常导致一些基因打靶已获成功的转
化细胞死亡。在植物基因打靶效率很低的情况下，采
用正一负双向选择难以得到成活的转化细胞，因而无
从进行选择。为此，在青蒿基因打靶实验中尝试“分
段选择法”，即第1步不加任何抗生素，以保证转化
细胞成活，并以报告基因(GFP)取代正选择标记(如
抗生素抗性标记)基因，以尽快淘汰非转化细胞；第
2步经过PCR扩增并结合分子杂交区分突变基因
与野生基因；第3步才利用负选择区分含有定点替
换与随机插入的转化细胞，从而确认基因打靶成功。
采用这种方法，笔者检查了大约200棵转基因植
株，从中发现了l株可能带有打靶基因的转基因青
蒿植株，基因打靶效率已达到o．02。由此可见，分段
选择法有利于获得基因打靶植物，对于在其他植物
中开展基因打靶研究也可能具有一定的启发意义。
下一步工作是鉴定基因打靶的表型效果，即SS基
因的缺失对青蒿素含量及植株生长发育的影响。
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万方数据
青蒿鲨烯合酶基因打靶研究
作者： 冯丽玲， 杨瑞仪， 杨雪芹， 曾庆平， FENG Li-ling， YANG Rui-yi， YANG Xue-qin，
ZENG Qing-ping
作者单位： 广州中医药大学热带医学研究所,广东,广州,510405
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(12)
被引用次数： 1次

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引证文献(1条)
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