全 文 ：健物杖术通报
· 综述与专论 · 刀了口百付 口乙口 ! !∀ 年增刊
重寄生菌哈茨木霉的研究及其在植病生防中的应用
石一堵 ‘ 申屠旭萍, 俞晓平 ,
杭州师范大学生命与环境科学学院 , 杭州 中国计量学院生命科学院 , 杭州
摘 要 综述了国内外对哈茨木霉菌产生的抑菌活性物质的研究概况 , 包括几 丁质酶 、葡聚糖酶和蛋 白酶
在内的 细胞壁降解酶和抗生素 , 以 及哈茨木霉菌生防产品的应用现状 , 并提出了其在植病生防中的研究展望 。
关键词 哈芙木霉菌 抑菌活性物质 生防
几她
‘ , ,
“ 诉 二 , 刀邵 滋 , 岁人
, 邵 比 , 以 咭 , 价 了嘴认。。
邵 成
, ! ∀ ∀ , ! !
, ! 面
哈茨木霉菌 二 是一种广
泛应用于植物真菌病害防治的菌寄生真菌 , 它至少
可寄生于 个属中的 种植物病原真菌 , 如腐霉
菌 胡 、镰刀菌 ! ∀ 胡 ) 、长孺抱菌
(He lm inrho胡ori um 胡 ) 、 炭疽菌 (Co lle totriehum 胡 )
等〔’一 4 〕。 哈茨木霉菌主要通过识别寄主后缠绕寄主
真菌的菌丝 , 随后产生细胞壁降解酶和抗生素以及
对空间和营养的竞争机制达到防治植物病原菌的目
的[s] 。 对哈茨木霉菌产生的细胞壁降解酶和抗生
素以及哈茨木霉菌生防产品在国内外的应用现状做
一综述 。
1 细胞壁降解酶
真菌寄生是哈茨木霉主要拮抗机制之一 。 在趋
向生长 、识别 、接触 、缠绕和穿透等步骤的真菌寄生
过程中 , 哈茨木霉菌分泌产生的一系列细胞壁降解
酶如几丁质酶 、葡聚糖酶 、蛋 白酶等起着重要的作
用 , 其中以几丁质酶尤为重要 。
1
.
1 几丁质酶
哈茨木霉菌可产生三种类型的几丁质酶:p 一 1 ,
4
一
N
一乙酞葡糖胺酶 (EC3 .2. 1.52 ) 、 内切几丁质酶
(Ec3 .2.1.14 )和外切几丁质酶或几丁二糖酶 。 p -
1
,
4
一
N
一乙酞葡糖胺酶可以外切形式把几丁质降解成
N 一乙酞葡糖胺单体。 内切几丁质酶以随机形式内切
降解几丁质 , 酶解产物可能有几丁单糖 、几丁二糖和
几丁寡糖 。 外切几丁质酶水解几丁质为几丁二糖 。
哈茨木霉菌在与寄主的相互作用过程中往往能产生
几种不同的几丁质酶 , 并且在侵染的不同部位及不
同时期产生的几丁质酶也不尽相同(表 l) 〔6 , ’] 。
哈茨木霉菌几丁质酶在非诱导条件下表达量很
少 , 而在诱导条件下大量产生 。 对几丁质酶的诱导
主要有四种方式「8〕:(l) 底物诱导 几丁质 、 纯化的
真菌细胞壁和葡聚糖可诱导几丁质酶的产生 ;(2)
基金项 目:浙江省 自然科学基金项 目(Y 307 128 ) , 浙江省重大招标项目(2以M C1 20 巧 , 2 0 ( 拓 C1 20 32)
作者简介 :石一用 (19 84 一 ) , 女 , 硕士研究生 , 主要从事生物农药研究 。 E 一 m ail : w i nd sj a 邓31@ ho tm ail · co m
通讯作者:俞晓平 , e m ail : yx p @ cjl u · ed u · cn
年增刊 石一用等:重寄生菌哈茨木霉的研究进展及其在植病生防中的应用
寄主真菌的诱导 哈茨木霉与其寄主真菌立枯丝核
菌(R h如ct on ia so la ni )相互作用时 , 寄主真菌可诱导
其产生几丁质酶;(3) 凝集素诱导 寄主真菌细胞表
面的凝集素可 以诱导哈茨木霉菌的 cHI T1 02 几丁
质酶的产生 。 ( 4) 寄主产生的小分子诱导 由寄主立
枯丝核菌产生的一种耐热小分子能诱导哈茨木霉菌
的蛋白酶基因(prb l) 和内切几丁质酶基因(ec h4 2)
高水平表达【9〕。
表 1 几丁质诱导的哈茨木霉几丁质酶
简称 分子量大小(kD ) 几丁质酶 来源菌株
CH IT 102 103 一 1 1 8
C H r r 64
N 一乙酸葡糖胺酶
N 一乙酞葡糖胺酶
N 一乙酞葡糖胺酶
N 一乙酞葡糖胺酶
内切几丁质酶
内切几丁质酶
几丁二糖酶
内切几丁质酶
内切几丁质酶
TM
39 .1
TMP1C H I竹3 73
C H llV Z
C H I巧2 52
C H ll禅2 4 0 一 4 2 3 9 . I P I
C H I T 4 0
C H I竹3
40
33 ~ 37
CH I竹 1 31 一 3 3
近年来 , 对几丁质酶基因的克隆和表达作了许
多研究 。 哈茨木霉 Pl 菌株中的两种内切几丁质酶
基因已被克隆。 H ay es 等从哈茨木霉 Pl 菌株中分离
出 CH I科2 的 。n N A , 它具有 1 554 个 bp , 编码具有
42 4 个 A A 的蛋白质〔’”] 。 G arc 记 等也克隆了编码
CH IT4 3 的基因 , 通过对它编码的几丁质酶 N 一端 A A
序列分析和与推导的核酸序列分析表明 , 该基因编
码的几丁质酶具有一个 34 个 A A 的信号肤〔川 。
C a rs ol in 等首次在大肠杆菌中表达 ec h4 2c D N A
克隆 , 产物具几丁质酶活性 。 该几丁质酶在体外培
养的灰葡萄抱 (Bo t解15 ci ne re a) 上表现出细胞壁降
解酶活性[‘2 〕。 M arg ol e , 等又分离了哈茨木霉 Pl 的
染色体内切几丁质酶 , 并在纤维素酶基 因启动子
cb hl 作用下在里氏木霉(Tri ch o山~ re es ei )中得到过量表达 , 摇瓶培养每升产生 130 毫克活性酶 , 从活
性表现方面比哈茨木霉产生的内切几丁质酶活性提
高了 20 倍[, , ] 。
1
.
2 葡聚糖酶
p 一 1 , 3 一葡聚糖是真菌细胞壁的重要成分 。 p 一1 ,
3
一葡聚糖酶(包括外切酶和内切酶)直接参与哈茨木
霉菌与其寄主真菌之间的重寄生作用[‘4 〕。 c ru z 等
从哈茨木霉菌 cE c代4B 分离到 4 种 任1 , 3 一葡聚糖
酶[” ] 。 v a z q u e z 等从哈茨木霉 IM u 0604 0 中分离出
7 种 卜1 , 3 一葡聚糖酶 , 而且有 2 种编码 p 一 1 , 3 一葡聚
糖酶的基因已经被克隆【‘6 ] 。 哈茨木霉 Pl 菌株的内
切型 p 一 1 , 3 一葡聚糖酶不仅对寄主真菌灰葡萄抱的细
胞壁有明显降解作用 , 而且对寄主的抱子萌发和芽
管伸长有强烈的抑制作用[8〕。 哈茨木霉 cEcT 菌株
的内切型 p 一 1 , 6 一葡聚糖酶(分子量 43 kD )对多种植
物病原真菌的生长有抑制作用〔‘, ] 。
1
.
3 蛋白酶
除了几丁质酶和葡聚糖酶外 , 蛋白酶也起着重
要作用 。 有关哈茨木霉菌产生的蛋 白酶研究并不
多 。 哈茨木霉在植物病原真菌菌丝或细胞壁诱导下
可以产生蛋白酶 。 G e re m i a 等从哈茨木霉菌株中分
离鉴定了其中一种碱性蛋白酶 , 并克隆了相应的基
因prb l[ ’8 〕。 凡ore , 等通过增加基本蛋白酶基因prb l
的拷贝数来提高哈茨木霉的生物防治效率 , 哈茨木
霉Pr 况多拷贝转化株抑制立枯丝核菌的能力明显增
强[’9 ] 。 El ad 等在研究哈茨木霉 39 对灰霉病菌的生
防中发现哈茨木霉产生了一种蛋白酶 , 蛋白酶活性
与木霉菌防治蔬菜灰霉病的能力有关 。 将蛋白酶与
木霉菌的分生抱子混合可 以提高防治效果 【’“〕。
Go ld
m an 等发现在哈茨木霉和寄主相互作用过程中
产生一种碱性蛋白酶 , 并构建了过量表达此酶的转
化菌株〔川 。 在哈茨木霉中分离出一种天冬氨酞蛋
白酶 pap A , 克隆到酵母中能高效表达 〔”〕。 s ua re z 等
从哈茨木霉中纯化出一种类似胰岛素的蛋白酶〔”〕。
2 抗菌类物质
目前的研究表明 , 哈茨木霉菌可产生 12 种抗菌
类物质〔’一 4 〕。 H o rac 。 等报道 , 哈茨木霉菌防治立枯
丝核菌的主要机制之一就是产生了挥发性抗生素 ,
具有椰子香味 , 经过鉴定为 6 一戊烷基毗喃酮 〔’‘3 。 并
且灭活的立枯丝核菌菌丝体的加入能够诱导哈茨木
霉菌提高六戊烷基毗喃酮产生水平 (从 14 7m岁L 升
高为 474m留L )[”] 。
一株经过紫外诱变的哈茨木霉突变株可产生异
睛类抗生素 , 该抗生素对霉菌 、担子菌以及革兰氏阳
PlTM
生物技术通报 B io te ch n口勿舒 2008 年增刊
性和革兰氏阴性菌都有抑制效果 , 是一种广谱性的
抗生素〔‘] 。 哈茨木霉菌产生的壬酸 , 不仅能抑制袍
子萌发 , 还能抑制菌丝的生长【26] 。
有关哈茨木霉菌产生抗菌类物质的研究国内报
道不多 , 目前多从哈茨木霉能对一些植物病原菌产
生很强拮抗作用 (对峙培养中出现明显的抑菌带)
推测其所产抗菌类物质的存在 。 朱天辉等[’7 ] 研究
哈茨木霉菌对立枯丝核菌的抗生现象 , 发现 Fo60
菌株的代谢物质能抑制立枯丝核菌的菌落生长 , 降
低其菌丝干质量 , 而且非挥发性代谢物具热稳定性 ,
这些代谢物可以破坏菌丝细胞壁 , 使细胞内物质外
渗 , 引起立枯丝核菌菌丝的原生质凝聚 , 菌丝断裂解
体。 高克祥等以哈茨木霉T 8 菌株为研究对象 , 将
其与杨树烂皮病菌金黄壳囊抱(伽osPora ch rys osP er-
Ina )和杨树水泡溃疡病菌聚生小穴壳菌(D othi ore lagreg ari) 平板对峙培养 , 有抑菌带产生[’8 〕。
本研究组从拘骨中分离筛选到一株活性内生真
菌 , 该真菌经中国科学院微生物研究所鉴定为一株
哈茨木霉菌 。 对该内生真菌发酵液活性物质的分
离 、提纯和结构鉴定后表明 , 其拮抗病原真菌的主要
有效成分为一种单端抱霉烯化合物—木霉素(tri-ch od erm in )。 有关木霉素的制备方法以及在植物真
菌病害防治 中的应用等已经 申请了国家发 明专
利[” 一”〕。
3 哈茨木霉菌生防产品的应用情况
目前生产上常用的哈茨木霉菌剂多为活分生抱
子制剂 , 已有许多商品化的木霉制剂问世 , 如以色列
开发的哈茨木霉竹9 可湿性粉剂Tric hod ex , 美国的
Th pshield (哈茨木霉 代2)等 [川 。
目前我国登记的木霉菌剂也都为活的分生抱子
制剂 ,例如商品名称为快杀菌 、特立克的两种木霉可
湿性粉剂含抱量分别为 1.5 x 10 8 和 2.0 x 10 8 活
袍子/g , 抗菌谱较广 , 可有效地防治黄瓜 、大白菜霜
霉病及黄瓜灰霉病〔’4〕。 将木霉抱子与经过高温灭
菌且粉碎的有机物如草灰等混合制成有机菌肥 , 该
菌肥中有机质可作为肥力的基础 , 又可被木霉快速
分解利用 ,使之在植物根际迅速定殖 , 能够抑制植物
根部病害 , 促进作物生长 〔” ] 。
4 展望
随着现代生物技术的广泛应用 , 哈茨木霉菌对
植物病害的生防作用研究及其开发应用也会出现新
的发展 。 例如哈茨木霉菌产生的不同细胞壁降解酶
之间存在协同作用 , 而且与杀菌剂 、抗生素也具有协
同拮抗作用 , 可通过相互复配 , 实现优势互补 , 用量
减少 , 研制防效更强的生防制剂 。 寄主真菌细胞表
面的凝集素是诱导哈茨木霉菌产生细胞壁降解酶的
信号分子 。 通过生物技术大量生产这种凝集素 , 它
诱导哈茨木霉菌产生细胞壁降解酶 , 这些酶消解和
杀死寄主真菌细胞壁和植物病原真菌 , 从而达到防
治植物病害的目的 。 从自然界中筛选优良菌株或利
用基因工程技术构建高效哈茨木霉菌株也可 以拓展
哈茨木霉菌的生防应用前景 。
参 考 文 献
1 林超 , 孙辉 , 王瑞宾 , 等. 菌物研究 , 2 0 5 , 3 ( 1 ) : 46 ~ 52 .
2 G h i
s
alb
e rt E L
,
S i
v
as i th
am
p ar
am
K
.
So i l B i
o
l
o 群& B ioehem , 1 9 9 1 , 2 3
(
1 1 )
:
1 0 1 1
一 10 2 0
.
3 G h is吐be rt E L , R ow l an d C Y . J N at u ral P rod u e t s , 1 9 9 3 , 5 6 ( 1 0 ) :
1 7 9 9
一 1 8 04
.
4 F a u ll J L
,
G ra
e
m
e
一
C o o k K A
,
P i l k i
n
gt
o n
B L
.
Ph yt oc
h
e m
,
1 9 9 4
,
3 6
( 5 )
:
1 2 7 3
一 1 2 7 6
.
5 杨艳红 , 陈玉惠. 西南林学院学报 , 2 创〕4 , 14 ( 2) : 70 一 75 .
6 徐同 , 柳良好.植物病理学报 , 2 0 2 ,犯(2) :97 一 1 02 .
7 杨合同 , 黄玉杰 , 郭勇等. 山东科学 , 2 0 3 , 16 ( 1 ) : 1 一 8 .
8 H ar
n S
,
S
e
h i
e
k l
e r
H
,
C h
e t I M i
e
ro b i
o
l
o 盯 , 1 9 9 6 , 1 4 2 : 2 3 2 1 -
2 3 3 1
.
9 C
o rt e s A
,
G
u t i
e
re
z
V
,
0 l m
e
d
o
J
.
M
o
l
e e u
l ar an d G
e n e
ral Ce
n e t i
e s
,
1 9 9 8
,
2 6 0
:
2 1 8
一 2 2 5
.
1 0 H 叮es C K , Kl e m s d al S , 肠ri to M , e t al . G e n e , 1 9 9 4 , 1 3 8 : 1 4 3 -
1 4 8
.
1 1 G
arc
i
a
l
, 肠ra J M , d e l a C ru z , e t al . C u 讹nt. Ge neties, 1 9 94 ,
2 7
:
8 3
一 8 9
.
1 2 C ars
o lio C A , G u t i e
re
z
B
,
J i m
e n e z
M
, e t al
.
P
roc
e e
d i
n
g
s
Of t h
e
N
a t i
o n
al A
e a
d
e
m y
o
f S
e
i
e n e e s ,
1 9 9 4
,
9 1
:
1
09
0 3
一 l 0 9() 7
.
1 3 M 毗olles C E , H 叮es C K . A pplied envi ro nm ental M iero biolo罗 ,
1 9 9 6
,
6 2
:
2 1 4 5
一 2 1 5 1
.
1 4 Th ran
e C , T ro n s m o a A , J e n s e n D E
.
E
u
ro v
e
an J Pl an
t P at h
o
l
o 罗 ,
1 9 9 7
,
1 0 3
:
3 3 3 1
一 3 3 4
.
1 5 C ru z J
,
P i
n t o r
一 t o ro J A
,
B
e n
i t
e z
L
, e t al
.
Ge
n e ,
1 9 9 5
,
1 7 7
:
6 9 3 7
-
6 9 4 5
.
1 6 V aZ q
u e z 一 G
arc
d u e n as e 5
. 玩al C A , H e
re
ra
一
E s t re l l a A
.
A p p l i e d a n d
E n v i ro n
me
n t al M i e m b i o l o 群 , 1 9 9 8 , 64 : 1 4 2 一 1 4 6 .
17 彭仁旺 , 管考梅 , 黄秀梨. 生物化学与生物物理进展 , 19 % , 23
(
2
)
:
1 0 2
一 1 0 7
.
( 下转第 89 页)
年增刊 游明乐等:天然真菌与人工发酵制品对免疫系统的影响研究概况 89
学报 , 2 (X) 5 , 2 4 ( 增刊)28 1 一 2 8 7 .
6 许美风 , 顾振纶 , 周文轩 , 等.云芝多糖对大鼠免疫功能的影响.苏
州医学院学报 , 1 9 9 3 , 1 3 ( 4 ) : 2 7 0 .
7 吴宪瑞 , 孔令员 、淦洪.黑木耳多糖的医疗保健价值.林业科技 ,
1 9 9 6
,
2 1
(
3
)
:
3 2
一 3 3
.
8 龚晓键 , 季晖 , 卢顺高 , 等.人工虫草多糖对小鼠免疫功能的影响.
中国药科大学学报 , 2 0 1〕, 3 1 ( 1 ) : 53 一 5 .
9 甘勇 , 吕作丹.阿魏蘑多糖理化性质及免疫活性研究.菌物系统 ,
2
(X]
l
,
2 0
(
2
)
:
2 2 8
一 2 3 2
.
10 于敏 , 沈业寿 , 梅一德 , 等.蜜环菌菌索多糖的免疫增强作用研
究.生物学杂志 , 2 0 1 , 18 ( 4 ) : 16 、 19 .
宋玉光 , 李庆章 , 高学军.滑菇多糖对荷瘤及正常小鼠免疫功能
的影响.食用菌 , 2 0 2 , 24 ( 6) : 40 一 42 .
沈新蛾 , 龚珊 , 蒋量红 , 等.复方虫草精华对小鼠免疫功能的影
响.中国血液流变学杂志 , 2 0 3 , 13 ( 4 ) : 3 27 一 3 30 .
杜巍 , 袁静 , 李元瑞 , 等.灰树花菌丝体多糖 G .F一2理化性质
及生物活性的研究.菌物系统 , 2 0 3 , 2 2 ( 2 ) : 2 89 一 2 95 .
张劲松 , 贾薇 , 邢增涛 , 等.灵芝子实体和菌丝体的提取物及其
各纯化组分生物活性的比较.菌物学报 , 2 以〕4 , 2 3 ( 1 ) : 85 一 92 .
王金华 , 薛宝云 , 戴宝张 , 等.金耳发酵液多糖免疫调节作用的实
验研究.中国中医药科技 , 1 9 97 , 4 ( 5 ) : 2 82 一 2 83 .
( 上接第78 页)
Cerem ia R , G o l d m an G H , J ac ob s D , e t 滋. M o lee u lar M iero b iolo-
gy , 1 9 9 3 , 8 : 6 0 3 一 6 1 3 .
Fl ore
s A , C h e t l , H e
re
ra
一
E s t re l a A
.
C u
re
n t G e ne t i
e s ,
1 9 9 7
,
3 1
:
3 0
、 3 7
.
E la d Y ,
Ka
p
a r A
.
E
u
ro p
e
an J
o
uxn
al
o
f P l an
t P at h
o
l
o 群 , 1 9 9 9 , 1 0 5 :
1 7 7
~
1 8 9
.
GO
l d m an M H S
,
Go
l d m
an
G H
.
Ce
n e t i
e s
an d M
o
l
e e u
l ar B i
o
l
o 盯 ,
1 9 9 8
,
2 1
:
3 2 9
一 3 3 3
.
J e抓5 D J , A n a M R , T 曲ia B . M iero biolo群 , 2 0(] 2 , 1 4 8 : 1 3 05 -
1 3 1 5
.
S
u
are
z
B
,
R
e
y M
,
C as t i l l
o
P
, e t al
.
A P p l y M i
e
ro b i
o
l
o 群 B ioteehnol-
ogy , 2 砚X 阵 , 6 5 ( 1 ) : 4 6 一 5 5 .
H o rac
e G C , R i e h 耐 H C , F an i s t G , e t al . A 护euliu司 an d Bio-
logi eal Che而stly , 1 9 8 6 , 5 0 ( 1 1 ) : 2 94 3 一 2 9 4 5 .
玩。b a 司0 S C , C 山a F , B l an e a R , e t al . B i ot ec h n Ol o gy Le t e rs ,
2 砚洲)4 , 2 6 : 1 4 0 3 一 1 4 0 6 .
A nej
a M , G i a n f a g n a T J
,
H
e
b b ar p K
.
p h y
s
i
o
l
o
gi
e
al an d M
o
l
e e u
l ar
Pl an
t P
a t
h
o
l
o 邵 , 2 (X) 5 , 6 7 ( 6 ) : 3 04 一 3 0 7 .
朱天辉 , 邱德勋.四川农业大学学报 , 1 9 94 , 1 ( 1 ) : 1 1 一 巧 .
高克祥 , 刘晓光 , 郭润芳 , 等.林业科学 , 2 0 1 , 3 7 ( 5 ) : 82 一 86 .
申屠旭萍 , 俞晓平一种防治蔬菜真菌病害微生物农药的制备方
法:中国 , 2 (X) 7 1 创沁692 8 . x [ P」. 2(X) 7一 1 0 2 4 .
俞晓平 , 申屠旭萍一种构骨内生真菌—哈茨木霉菌株 L :中国 , 2 0() 7 1 (X] 6 6 8 4 3 . 1 [ P ] . 2 (X) 7 刃9 一 1 9 .
俞晓平 , 申屠旭萍 , 陈列忠. 倍半菇类化合物 Tri ch oth ec 一en 4 -
。l , 1 2 , 1 3 一e p o x y
一 ,
ac
e
ta
e ,
(
4
p )
一
( S C I
,
g C I
) 的制备方法 :中国 ,
2
(X]
7 1 ( X 拓6 8 4 6 .5 [ P ]
. 2 (X) 7一9 一6 .
俞晓平 , 申屠旭萍.Tri ch oth ec 一即4 一 d , 12 , 13 一e po xy 一 , ac et at “ ,
(4 日)一 ( s cl , g cl ) 在防治蕃茄早疫病或菜豆炭疽病中的应用:
中国 , 2 (X) 7 1 (X) 6 6 8 4 7 . X 仁P J.2(X) 7伪一6 .
B h uy an 5 A . Jou n al Of A gh eul tu ral se ien ee s, iet y of No rt h E as t In -
d ia , 1 9 9 4 , 7
(
1
)
:
1 2 5
一 1 2 7
.
顾宝根 , 叶纪明. 农药登记公告汇编〔M 〕. 北京: 中国农业大
学出版社 , 2 0 03 .
王慧中 , 赵培洁.江西农业学报 , 1 9 9 , 1 1 ( 3 ) : 1 9 ~ 23 .
了只O声,一2,乙