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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
糖基化磷脂酰肌醇锚定型 EGFP真核
表达质粒的构建及表达
郭荫广 1 陈全 2 朱大冕 1
(1重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心 ,重庆 400016; 2重庆医科大学基础医学院免疫学教研室 ,重庆 400016)
　　摘 　要 : 　构建与增强型绿色荧光蛋白基因相连的糖基化磷脂酰肌醇 ( glycosyl phosphatidylinositol, GP I)序列的真核表达
质粒 ,并检测其在 A549细胞中的表达。分离人外周血淋巴细胞 ,提取总 RNA,以 RT2PCR法扩增 CD24基因的 243 bp GPI锚
定序列 ,双酶切后定向克隆入 pEGFP2C1质粒中 ,构建并鉴定 pEGFP2C12GP I质粒。经脂质体介导转染 A549细胞后 ,在荧光显
微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况。经酶切和测序鉴定证实 ,所克隆的 CD24 GP I序列正确 ,荧光显微镜观察
pEGFP2C12GP I质粒转染 A549细胞可见围绕细胞膜的强绿色荧光 ,而对照 pEGFP2C1质粒转染 A549细胞仅见胞内均匀荧光。
成功构建与 EGFP相连的 GP I真核表达质粒 ,且能在 A549细胞膜上锚定表达 EGFP2GP I融合蛋白 ,为构建锚定表达型肿瘤疫
苗奠定基础。
关键词 : 　GP I 真核表达载体 A549 绿色荧光蛋白
Construction of Eukaryotic Expression Plasm id of GPI2anchored
EGFP and Its Expression in A549 Cells
Guo Yinguang1 　Chen Quan2 Zhu Dam ian1
(1 Chongqing M edical University, Chongqing 400016; 2 Departm ent of Imm unology, College of P reclinical M edicine,
Chongqing M edical University, Chongqing 400016)
　　Abs trac t: 　 It was to construct a eukaryotic exp ression p lasm id of CD24 GPI gene linked with EGFP gene at itsN term inal, and ob2
serve its exp ression in A549 cells. Lymphocytes were isolated from human peripheral blood and total RNA was extracted. The gene frag2
ment encoding GP I of CD24 was amp lified by RT2PCR using the obtained RNA as temp late, which was inserted into the pEGFP2C1
p lasm id to construct recombinant p lasm id pEGFP2C12GP I. Then the p lasm id was transfected into A549 cells by L ipofectam ine 2000,
and its exp ression function was detected by observing the exp ression of enhanced green fluorescent p rotein ( EGFP) through fluorescent
m icroscope. The results of restriction endonuclease analysis and DNA sequencing p roved that the GP I gene fragment was correctly in2
serted into pEGFP2C1 p lasm id. The enhanced green fluorescence was observed around the cell membrane of A549 cells transfected with
pEGFP2C12GP I. A s the pEGFP2C1 control cells, the green fluorescence was observed in the cytop lasm uniform ly. Therefore, the eukary2
otic exp ression p lasm id pEGFP2C12GP I was constructed successfully and could exp ress anchored EGFP around the cell membrane,
which p rovides a basis for the construction of anchored tumor vaccine.
Key wo rds: 　 Glycosyl phosphatidylinositol Eukaryotic exp ression vector A549 Enhanced green fluorescent p rotein
收稿日期 : 2009207227
作者简介 :郭荫广 (19812) ,男 ,汉族 ,硕士研究生 ,主要从事恶性肿瘤的靶向性基因治疗的研究 ; E2mail: guoyg521@126. com
通讯作者 :陈全 , E2mail: quanchen@ tom. com　　肺癌等肿瘤是目前危及人类健康的最主要疾病之一 ,尽管手术、放疗及化疗等传统治疗癌症的方法已不断改进和发展 ,但其死亡率仍居高不下。利用基因工程技术在肿瘤细胞表面表达肿瘤抗原或 B7 等分子而构建的瘤苗 ,通过激发、增强机体特异性主动免疫而达到预防和治疗肿瘤的目的 ,越来越受到研究者重视。人外周血淋巴细胞 CD24分子中含有一种特定的糖基化磷脂酰肌醇 ( glycosyl phosphati2
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
dylinositol, GP I)锚定基序 ,与该 GP I相联的蛋白质
可通过重组蛋白羧基端的 GP I锚定于细胞膜表
面 [ 1, 2 ]。本研究拟构建 GP I真核表达质粒 ,研究其
在肺癌细胞中的表达功能 ,为探讨 GP I序列能否介
导靶蛋白锚定表达于肺癌细胞 ,进而为开发锚定表
达型瘤苗奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 质粒、细胞及菌株
真核表达质粒 pEGFP2C1、大肠杆菌 Top10、人
肺腺癌 A549细胞株由重庆医科大学免疫学实验
室保存。
1. 2 试剂
Primer Star DNA聚合酶、限制性内切酶 KpnⅠ
和 B am HⅠ及 DNA 连接试剂、DL2000 DNA marker
及琼脂糖凝胶等购自 TaKaRa公司 ; PCR引物合成
及测序由上海 Sangon公司完成 ;质粒小量抽提试剂
购自 Omega公司 ; PCR产物纯化试剂及胶回收试剂
购自上海华舜公司 ; RPM I 1640培养液购自 Gibco
公司 ;胎牛血清为天津 TBD 公司产品 ;转染试剂
L ipofectam ine 2000购自 Invitrogen公司。
1. 3　RT2PCR扩增 GP I序列
根据 GenBank (NM _ 013230 )登录的人 CD24
GP I基因序列及 pEGFP2C1载体上的酶切位点 ,设
计并合成 2条引物 P1和 P2,引物的 5′端分别加上
KpnⅠ、B am HⅠ限制性酶内切位点。
P1: 5′2GGGGTACCATGGGCAGAGCAAT23′
P2: 5′2CGGGATCCTTAAGAGTAGAG ATGCAG23′
抽取人外周血 5 m l, Ficoll液分离出淋巴细胞 ,根
据 Trizol方法 ,提取总 RNA进行逆转录 ,反应体系为 :
RNA样品 1 μl, MgCl2 2 μl, 10 ×RT buffer 1 μl,
RNase Free ddH2 O 3. 75μl, dNTP 1μl, RNA 抑制剂
0. 25μl, AMV逆转录酶 0. 5μl , Random 9 mers 0. 5
μl,共 10μl。反应条件 : 30℃ 10 m in; 42℃ 30 m in,
99℃ 5 m in, 5℃ 5 m in, 1个循环。再以逆转录产物为
模板 , P1、P2为引物进行 PCR扩增 ,反应体系 :去离子
水 33 μl、5 ×Primer StarTM buffer 10 μl、10 mmol/L
dNTP 4μl、0. 5μmol/L 的 P1和 P2引物各 1μl、cD2
NA模板 0. 5μl、Primer Star DNA聚合酶 0. 5μl。循
环参数 : 94℃预变性 4 m in; 94℃变性 1 m in, 57℃退火
40 s, 72℃延伸 40 s, 30个循环 ; 72℃延伸 10 m in。扩
增产物经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察后 ,用胶回收试
剂回收 243 bp的 DNA条带。
1. 4 pEGFP2C12GP I真核表达载体的构建
用 KpnⅠ和 B am HⅠ双酶切 pEGFP2C1载体 ,胶
回收载体大片段 ;同时也用这两种酶双酶切 GP I扩
增片段、并用 PCR产物纯化试剂进行纯化回收。再
用 DNA L igation Kit Ver2. 0将回收的 pEGFP2C1线
性载体和带有相同酶切位点的 GP I基因片段连接 ,
而后转化至用 CaCl2法制备的大肠杆菌感受态细胞
Top10中 ,涂布于含有 50μg/m l卡那霉素的 LK平
板上 , 37℃培养过夜 ,次日挑取单菌落 ,接种至含有
50μg/m l卡那霉素的 LK液体培养基中 , 37℃、150
r/m in摇菌过夜 ,离心收集菌体 ,用质粒提取试剂提
取质粒 ,并对质粒进行 KpnⅠ和 B am HⅠ双酶切鉴定
及测序鉴定 ,构建带有 GP I的 pEGFP2C1真核表达
载体 ,命名为 pEGFP2C12GP I载体。
1. 5 转染 A549细胞的 EGFP检测分析
复苏 A549 细胞 ,培养在含 10%胎牛血清的
RPM I 1640培养液中 ,转染前 24 h胰酶消化细胞并
记数 ,以 6 ×104个细胞 /孔传代于 24孔细胞培养板
中 ,设 3 复孔。 37℃、5% CO2 培养箱中培养至
80% ～90%融合 ,按照 L ipofectam ine 2000说明书转
染 pGFP2C12GP I和对照载体 pEGFP2C1至 A549细
胞中 ,转染 48 h后在荧光显微镜下观察 EGFP的表
达情况。
2 结果
2. 1　RT2PCR扩增 GP I基因
以分离出的淋巴细胞的 RNA为模版扩增出的
cDNA为模板 ,经 PCR扩增 ,获得约 250 bp DNA条
带 ,与预期 GP I基因大小 (243 bp)相符 (图 1)。
1. DNA marker DL2000; 2. GPI基因 PCR产物
图 1　PCR扩增 G P I基因片段
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2009年第 11期 　　　　　郭荫广等 :糖基化磷脂酰肌醇锚定型 EGFP真核表达质粒的构建及表达
2. 2 表达载体的双酶切鉴定及测序鉴定
用 KpnⅠ、B am HⅠ双酶切 pGFP2C12GP I重组质
粒后 ,经 1%琼脂糖凝胶电泳分离 ,出现大小分别约
为 243 bp和 4 kb两条带 ,其结果符合所构建质粒特
征 (图 2)。双向测序结果表明 ,所克隆的 GP I序列
与 GenBank所报道的序列完全一致。
1. DNA marker DL2000; 2. 质粒 pEGFP2C12GP I
经 KpnⅠ和 B am HⅠ双酶切的产物
图 2　重组 pEGFP2C12GP I质粒双酶切鉴定
2. 3　pEGFP2C12GP I表达的检测
A549细胞分别转染 pEGFP2C12GP I和 pEG2 FP2C1质粒后 ,于 24 h、48 h在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达。结果表明 ,在转染后 48 h,两种质粒转染细胞均观察到较强的绿色荧光。但是 , pEGFP2C12GP I质粒转染细胞的绿色荧光主要分布在细胞膜周围、呈不均匀分布 (图 3) ;而对照 pEGFP2C1质粒转染细胞的绿色荧光则位于整个胞浆中 ,分布较均匀 (图 4)。结果表明 ,重组 pEGFP2C12GP I质粒编码表达的 EGFP2GP I融合蛋白为胞膜锚定表达。3 讨论用基因转染的方法修饰肿瘤细胞或者抗原呈递细胞 ,已经证实能够有效地增强肿瘤疫苗的效果 [ 3 ]。但是肿瘤疫苗是一个复杂的系统工程 ,涉及多种免疫学机制 ,仅考虑单一基因或有限的数个基因联合修饰肿瘤细胞 ,很难达到理想的效果。而近年兴起的细胞表面工程技术 ,能够将多种蛋白同时或次序性地转移到同一细胞表面 ,为研发有效的肿瘤疫苗提供了新的思路和方法 [ 1 ]。
GP I锚定蛋白是一类通过其羧基末端的 GP I结
构锚定于真核细胞膜表面的蛋白 [ 1 ]。细胞中存在
多种锚定蛋白 ,如 CD16B、CD24、CD48、CD52、DAF
等。它们与传统的跨膜型表面蛋白不同 ,没有跨膜
区和胞内部分 ,不跨越细胞膜脂质双层 ,只通过其羧
基末端的 GP I结构锚定于细胞膜上而具备更强的膜
移动能力 ,在免疫识别、补体调节、跨膜信号转导及
诱导细胞产生应答等方面起着重要作用 [ 1, 4 ]。已经
发现 GP I锚定蛋白质、小窝蛋白、糖脂和胆固醇等以
脂质微域形式富集于细胞质膜的特定区域 ———小窝
内 [ 5 ]。小窝内还富集了大量信息传递通路的多种
蛋白 ,这些信息传递通路包括 G蛋白介导途径、
Ca2 +介导途径、酪氨酸激酶途径等。因此 , GP I锚定
蛋白质的释放可能影响到该蛋白质的生物学作用和
脂质微域的信号转导。当 GP I锚结构缺失或改变
时 ,通过其微域转导的信号也相应丢失 ,蛋白便不能
连接到细胞膜上 , 从而影响生物体的功能而致
病 [ 6 ] ,可见 GP I锚结构在 GP I锚定蛋白中非常重
要。有研究表明 , GP I锚定序列与目的基因连接成
(下转第 97页 )
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2009年第 11期 范晶等 :番茄 L eAB I3基因的生物信息学分析
H ordeum vu lga re. 大麦 ; T riticum aestivum. 小麦 ; O ryza sa tiva. 水稻 ; Zea m ays. 玉米 ;
Solanum tuberosum. 马铃薯 ; L ycopersicon escu len tum. 番茄 ; A rabidopsis tha liana. 拟南芥
图 6　不同植物 AB I3 /VP1的氨基酸序列同源树分析
参 考 文 献
1　 Nambara E, et al. Development, 1995, 121: 629～636.
2　 McCarty DR, et al. The Plant Cell, 1989, 1: 523～532.
3　 Rohde A, et al. The Plant Cell, 2000, 12: 35～52.
4　 Hattori T, et al. Genes and Development, 1992, 6: 609～618.
5　 Bassel GW , et al. J Exp Bot, 2006, 57 (6) : 1291～1297.
6　张雨良 ,等. 中国生物工程杂志 , 2009, 29 (1) : 27～33.
7　万敬员 ,等. 国外医学分子生物学分册 , 2003, 25 (6) : 342～345.
8　 Graveley BR. Trends Genet, 2001, 17: 99～108.
9　 Gagete AP, et al. J Exp Bot, 2009, 60 (6) : 1703～1714.
10　McKibbin RS, W ilkinson MD, Bailey PC, et al. Proceedings of the
National Academy of Sciences USA, 2002, 99: 10203～10208.
(上接第 91页 )
使编码的目的蛋白在真核细胞膜上表达 ,并能筛选
出高表达的锚定蛋白细胞株 [ 7 ]。
本研究中 ,将 GP I锚定序列克隆到 pEGFP2C1
质粒 EGFP基因的下游 ,旨在转染细胞内表达 EG2
FP2GP I融合蛋白。EGFP作为与目的蛋白融合的报
告基因 ,具有低毒、无需任何辅助因子或底物参与、
无需裂解细胞、在普通的激光激发下就能产生荧光 ,
从而在细胞或亚细胞水平上成像 ,达到对目的蛋白
的跟踪、定位的目的。分别将 pEGFP2C12GP I与
pEGFP2C1质粒转染 A549 细胞后 , pEGFP2C12GP I
质粒转染细胞观察到围绕胞膜、且呈非均匀分布的
强绿色荧光 ;而对照 pEGFP2C1质粒转染细胞观察
到均匀分布于整个胞浆的强绿色荧光。初步证实 ,
构建的重组 pEGFP2C12GP I真核表达质粒在肺腺癌
A549细胞中表达了 EGFP2GP I融合蛋白 ,且位于
EGFP羧基端的 GP I在 A549细胞中介导了“锚定 ”
作用。pEGFP2C12GP I真核表达载体的构建为进一
步开发锚定表达型肿瘤疫苗奠定了基础。
参 考 文 献
1　 Ikezawa H. B iol Pharm Bull, 2002, 25 (4) : 409～417.
2　 Nagarajan S, Selvaraj P. Vaccine, 2006, 24 (13) : 264～274.
3　刘煜 ,等. 南方医科大学学报 , 2007, 27 (4) : 558～559.
4　 Sangiorgio V, et a1. Ital J B iochem, 2004, 53 (2) : 98～111.
5　钱莉玲. 国外医学分子生物学分册 , 2002, 24 (2) : 100～103.
6　熊茂林. 国外医学免疫学分册 , 2003, 26 (5) : 230～233.
7　于继云 ,沈倍奋. 免疫学杂志 , 2003, 19 (6) : 478～479, 481.
79