全 文 ：收稿日期:2007-12-25
基金项目:国家科技支撑项目“优质抗逆生态树种柠条、蒙古栎新品种选育”(2006BAD01A1606)、国家 863计划“抗旱、耐盐碱优质柠条新品
种选育”(2002AA241091)
作者简介:林萍(1980-),女,在读博士研究生,主要从事锦鸡儿属植物脂肪酸合成相关基因研究;E-mail:linping80@126.com
通讯作者:张守攻,教授,E-mail:shougong.zhang@caf.ac.cn
Δ12脂肪酸脱氢酶(Δ12fatyaciddesaturase,Δ12FAD,也称为 fad2)催化油酸生成亚油酸,是植物体内
生成多不饱和脂肪酸的关键酶。组成型表达的 fad2主要催化形成生物膜脂中的油酸脱氢酶,直接影响植物
的抗寒性;种子中特异表达的 fad2负责种子贮脂中多不饱和脂肪酸亚油酸的生成,决定种子油脂的成分和
营养价值。
中间锦鸡儿(Caraganaintermedia),豆科锦鸡儿属,落叶灌木,广泛分别于我国黄河流域以北干燥地区,
中间锦鸡儿种子特异性fad2基因克隆及fad2-1A基因酵母
表达载体的构建
林萍 1 李春秀 2 齐力旺 1 张守攻 1
(1中国林业科学研究院林业研究所,北京 100091;2中国林业科学研究院森林环境与保护研究所,北京 100091)
摘 要: Δ12脂肪酸脱氢酶(Δ12fatyaciddesaturase,Δ12FAD,也称为fad2)催化油酸生成亚油酸,是植物体内
生成多不饱和脂肪酸的关键酶,种子中特异表达的fad2基因负责种子贮脂中多不饱和脂肪酸亚油酸的生成,决定种子油
脂的成分和营养价值。采用RT-PCR和RACE技术从中间锦鸡儿未成熟种子中克隆了种子特异表达的fad2-1A、fad2-1B
基因,fad2-1A编码的前 283个氨基酸与 fad2-1B的同源性高达 98.9%,前者比后者多编码 97个氨基酸,全部氨基酸
残基的同源性为 70.71%。将 fad2-1A克隆到真核表达载体 pYES2中,构建了重组质粒 pYES2-fad2-1A,经 PCR检测、
质粒酶切、测序等检测,目的基因确实插入重组质粒,且方向正确,为进一步研究 fad2基因的功能和表达调控机理奠
定了基础。
关键词: 中间锦鸡儿 fad2基因 克隆 真核表达载体
GeneCloningandEukaryoticExpressionVectorConstructionof
Caraganaintermediafad2
LinPing1 LiChunxiu2 QiLiwang1 ZhangShougong1
(1ResearchInstituteofForestry,ChineseAcademyofForestry,Beijing100091;2ResearchInstituteofForestEcology,
EnvironmentandProtection,ChineseAcademyofForestry,Beijing100091)
Abstract: Fatyaciddesaturase2(fad2)areinvolvedintheconversionofoleicacidtolinoleicacidinplant.The
seed-specificfad2convertoleicacidtolinoleicacidofseedstorefatanddecidetheseedoilcompositionandnutrition
value.Basedontheconservedoligoaminoacidresiduesofthepublisheddelta-12desaturasegenesfrom otherhigher
plantspecies,theseed-specificfad2genes(fad2-1A,fad2-1B)wereamplifiedbyRT-PCR(reversetranscriptase-polymerase
chainreaction)andRACE(rapidamplificationofcDNAends)fromthetotalRNAofimmaturecaraganainermediaseeds.
Thefirst283deducedaminoacidsequencesofFad2-1Aandfad2-1Bshowedhighidentitywhichwas98.9%.Thefad2-
1A weresubclonedintotheeukaryoticexpresionvectorpYES2andtherecombinantplasmidwastransformedinto
top10foridentification.TheresultsshowedthattherecombinantplasmidpYES2-fad2-1Awasconstructedcorectly.Al
ofthesewereveryimportanttostudythefunctionsandregulationofthesegenesfurther.
Keywords: Caraganaintermedia Fad2gene Cloning Eukaryoticexpresionvector
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
2008年第2期
抗干旱、耐盐碱,是沙漠半沙漠地区重要的防风固沙树种。锦鸡儿属植物茎叶富含营养,种子产量大,是牲
畜的好饲料,但除了牲畜采食外未进行深度的开发利用。基于对中间锦鸡儿种子油脂成分进行改良,进一
步提升中间锦鸡儿的经济价值的出发点,以中间锦鸡儿未成熟种子为材料,克隆了中间锦鸡儿种子特异表
达的 fad2-1A和 fad2-1B基因,构建了 fad2-1A的酵母表达载体,为下一步转化酵母进行基因功能验证,并
对其表达调控进行初步的研究打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 中间锦鸡儿未成熟种子采自中国林科院玉泉山苗圃。
1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒购自北京奥莱博生物技术有限责任公司;PowerScriptTM反转录酶以及
CDSII/3PCR引物、5-PCR引物购自 Clotech;Taq酶、pfu酶购自 TaKaRa;胶回收试剂盒购自北京博大泰克
生物基因技术有限责任公司;质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;T4连接酶、限制性核酸
内切酶购自 Promega;所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.1.3 菌种和质粒 大肠杆菌 DH5α感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司,PGEM-Teasyvector
购自 Promega;酵母 pYES2表达载体购自 invitrogen。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA的提取 RNA提取方法根据奥莱博 RNA提取试剂盒说明书进行,用 1%琼脂糖凝胶电泳
检测 RNA的提取质量及完整性。
1.2.2 双链 cDNA的合成 在一 0.5ml离心管中混合反应体系,其中包括 3μlRNA,1μlSMARTIV寡聚核
苷酸和 1μlCDSII/3PCR引物,混匀反应体系,72℃保温 2min,冰浴冷却 2min;然后依次加入:2μl5×第一
链缓冲液,1μlDTT(20mM),1μldNTPMix(10mM),1μlPowerScript反转录酶,混匀,略微离心;42℃空气浴培
养箱中温浴 1h;放置于冰上终止第一链反应。
取 2μl第一链 cDNA,依次加入 80μl去离子水,10μl10×Advantage2PCR缓冲液,2μl50×dNTP混合
液,2μl5-PCR引物,2μlCDSII/3PCR引物,2μl50×Advantage2聚合酶混合液,混匀,略微离心,进行 PCR
扩增,扩增程序为:95℃20s;95℃5s,68℃6min,22个循环。循环结束后,取 5μlPCR产物进行 1.1%琼脂糖凝
胶电泳,检测 cDNA合成质量。
1.2.3 RACE技术扩增 fad2基因 根据大豆、红花菜豆等已知豆科植物 fad2基因保守序列设计兼并引物
P1、P2,以稀释 20倍的双链 cDNA为模板进行 PCR扩增,获得中间锦鸡儿 fad2基因的保守序列。5RACE
试验方案根据 PowerScriptTM反转录酶合成 cDNA特点设计。根据保守序列设计 5RACE下游引物 P3,P3
与 5-PCR引物对以稀释 20倍的双链 cDNA为模板进行 5RACEPCR扩增。保守序列扩增与 5RACE扩增
的退火温度都是 56℃。根据保守序列和 5RACE获得的片段序列分别设计 3RACE上游引物 P4、P5,根据
CDSII/3PCR引物序列设计接头引物P6(P6与CDSII/3PCR引物是3RACE下游巢式引物),以稀释20倍的
双链 cDNA为模板进行 3RACE扩增,扩增体系为:14.3μlddH2O,2μl10×bufer,1.25μmol/LMgCl2,250μmol/L
dNTP,P4(或 P5)和 P6引物各 0.2μmol/L,CDSII/3PCR引物 0.1μmol/L,1UTaq酶。扩增的退火温度为
68℃。
PCR产物都进行 1.0%的琼脂糖凝胶电泳,与预期片段大小相符的条带用胶回收试剂盒回收。回收产
物与 pGEM-Teasyvector连接,转化 DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆测序。
1.2.4 fad2全长基因的克隆 将 3RACE、5RACE结果用 DNAStar软件进行电子拼接获得 fad2基因的全
长序列,分别命名为 fad2-1A、fad2-1B。根据基因序列设计共同上游引物 P7以及 fad2-1A下游引物 P8、fad2-
1B下游引物 P9,在上游引物中引入 SacI酶切位点,下游引物中引入 XbaI酶切位点。扩增全长的扩增体系
均为:14.5μlddH2O,2μl10×bufer,1.25μmol/LMgCl2,250μmol/LdNTP,引物各 0.2μmol/L,1Upfu酶。扩增程
林萍等:中间锦鸡儿种子特异性fad2基因克隆及fad2-1A基因酵母表达载体的构建 147
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
序均为:94℃3min;94℃30s,68℃30s,72℃30s,35个循环;72℃5min;加入 1UTaq酶,72℃5min,4℃保存。PCR
产物进行 1.0%的琼脂糖凝胶电泳,与预期片段大小相符的条带回收。回收产物与 pGEM-Teasyvector连
接,转化 DH5α感受态细胞,经 PCR检测筛选阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。
试验过程中所有的引物序列如下:
CDSII/3PCR引物:5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3
(N=A,G,C,orT;N-1=A,G,orC)
5-PCR引物:5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3P1:5-CGTCGCCA(C/T)CA(C/T)TC(C/T)AACAC-3
P2:5-CCCCTAA(A/G)CCA(A/G)TCCCA(C/T)TC-3 P3:5-CTGCCTGAAACATTAAGAGCCAAGT-3
P4:5-TTCTTGCAGCATACTCACCCTGCGT-3 P5:5-GTGTTACCCTTCTCATCACACTCACAT-3
P6:5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3
P7:5-CTAAGAGCTCAAGGAAACAATGGGAGCTGGAA-3
P8:5-GCGGTCTAGATATCATCATCCATGCTTTTCTTCA-3
P9:5-GATTTCTAGACTCCCCTGAGCCAATCTCATTCC-3(下划线碱基为酶切位点)
1.2.5 fad2-1A酵母表达载体的构建 用 SacI和 XbaI酶切 1.2.4中的 PCR产物,定向连接到经同样处理
的 pYES2载体上,构建酵母表达载体 pYES2-fad2-1A。将重组质粒转化 DH5α感受态细胞,在 Amp平板上
筛选培养,并经过 PCR检测初步挑选阳性克隆,用含 Amp的 LB液体培养基摇菌,根据质粒提取试剂盒操
作说明提取质粒,经酶切质粒再次验证后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。
2 结果与分析
2.1 RNA的提取及双链 cDNA的合成
提取的 RNA18s、28s(图 1)条带整齐完整,合成的双链 cDNA产物经电泳(图 2),主要分布在 0.1～4kb
范围内,质量较高,能够满足后续作为模板的要求。
2.2 扩增获得 fad2全长基因
PCR扩增得到两条种子特异性
fad2全长基因:Fad2-1A基因 cDNA全
长 1473bp,5非编码区 119bp,3非编
码区 196bp(不包括 polyA),开放阅读
框 1143bp,编码 380个氨基酸,估算
蛋白质分子量是 44.03kD。Fad2-1B基
因 cDNA全长 1363bp,5非编码区
119bp,3非 编 码 区 368bp(不 包 括
polyA),开放阅读框 852bp,编码 283个氨基酸,估算的蛋白质分子量是 32.47kD(图 3、图 4、图 5)。
Ck:阴性对照 1:发育 20d种子 2:发育
30d种子 3:发育 50d种子 M:Marker
图 3 中间锦鸡儿 fad23RACE电泳图
Ck:阴性对照 1:发育 20d种子 2:发育
30d种子 3:发育 50d种子 M:Marker
图 4 中间锦鸡儿 fad25RACE电泳图
1~3:fad2-1A 4~7:fad2-1B
图 5 fad2-1A、fad2-1B编码区
PCR扩增
148
2008年第2期
2.3 fad2基因的同源性比较
中间锦鸡儿种子特异表达的 fad2基因经 Blast(htp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比较分析,fad2-
1A、fad2-1B与大豆种子特异表达的 fad2-1B
的氨基酸同源性分别 为 82%和 80%。用
DNAMAN软件对中间锦鸡儿 4个 fad2基因,
包括组成型表达的 fad2-2A、fad2-2B和种子特
异性表达的 fad2-1A、fad2-1B的氨基酸同源性
进行分析。部分结果如图 6所示,fad2-1A与
fad2-1B同源性很高,fad2-1A编码的前 283个
氨基酸与 fad2-1B的同源性高达 98.9%,前者比后者多编码 97个氨基酸,全部氨基酸残基的同源性为
70.71%。4个基因中,fad2-2B与 fad2-1A的氨基酸序列同源性最低,为 64.7%,此外,fad2-2A与 fad2-1A的
同源性为 74.2%,fad2-2A和 fad2-2B与 fad2-1B的同源性都为 71.7%。
2.4 中间锦鸡儿 fad2-1A酵母表达载体 pYES2-fad2-1A的构建
将以稀释 20倍的 cDNA为模板,P7、P8引物对扩增的 PCR产物回收,与 pYES2载体一起进行 SacI和
XbaI双酶切。酶切产物电泳,胶回收。回收后的带黏性末端的两个片段连接构建表达载体。构建载体的原
理见图 7。构建的载体质粒转化 DH5α感受态细胞,在 Amp培养基上挑选菌落进行 PCR检测,出现一条约
1150bp左右的片段。摇菌提质粒进行双酶切鉴定,出现 2条带,一条约 5.9kb,是载体质粒;另一条在 1
150bp左右,是插入的 fad2-1A片段(图 8)。经上海生工测序验证,质粒中确实含有目的片段,且插入方向和
读码框正确,表达载体构建成功。
图 6 四个 fad2蛋白氨基酸序列部分比对结果
图 7 pYES2载体及 pYES2-fad2-1A表达载体构建原理
图 8 pYES2-fad2-1A质粒酶切鉴定
1~2:pYES2 3~4:pYES2-fad2-1A载体酶切产物
3 讨论
油酸去饱和酶 FAD2是负责植物体内非光合器官中产生亚油酸的关键酶,其催化的油酸生成亚油酸
的过程也是产生多不饱和脂肪酸的主要途径,在植物体脂肪酸代谢过程中具有举足轻重的作用。植物的
fad2基因具有一定的同源性,首次以中间锦鸡儿未成熟种子为研究对象,采用 RACE的方法对中间锦鸡儿
fad2基因进行分离与克隆,获得了中间锦鸡儿 2个种子中特异表达的 fad2基因的 cDNA全长序列。至此,
从中间锦鸡儿中一共克隆了 4个全长 fad2基因(两个组成型表达的 fad2-2A和 fad2-2B基因也由本实验室
克隆,数据未发表)。目前,从拟南芥中克隆了一个 fad2基因[1],李柱刚等[2]对芸薹属植物进行 fad2基因标
记,认为芸薹属植物基因组中有 1～2个拷贝,大豆中有 3个 fad2基因,包括组成型表达的 fad2-2、种子特异
表达的 fad2-1A和 fad2-1B[3],Hernandez等[4]用 PCR的方法从木本植物油橄榄中分离了编码微粒体油酸去
林萍等:中间锦鸡儿种子特异性fad2基因克隆及fad2-1A基因酵母表达载体的构建 149
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
饱和酶(FAD2)的两个不同的 cDNA序列,分别命名为 OepFAD2-1和 OepFAD2-2。Mikkilineni等[5]在玉米中
也发现了 3大类 fad2基因。从一种植物中克隆到 4个 fad2基因还未见报道。
根据 PowerScriptTM反转录酶在全长 cDNA5末端自动加尾的特性,在采用 RACE技术克隆 fad2基因
的过程中,直接设计引物进行 PCR,减去了常用的 5RACE方法中全长 mRNA5末端加帽的过程,也无需利
用巢式引物进行两轮 PCR,大大简化了克隆全长基因的操作步骤,提高了扩增效率。
一般认为,如果两个基因序列间相似性很高,那么它们可能来源于共同的进化祖先,它们是同源的。中
间锦鸡儿 fad2-2B与大豆微粒体 omega-6去饱和酶的氨基酸同源性达到了 90%,但与中间锦鸡儿自身的
fad2-1A的氨基酸序列同源性只有 64.7%。可以推测,fad2基因在同一个物种中基因家族不同成员之间同
源性较低,而在不同物种中同一个成员间的同源性较高,可能来源于相同的进化祖先,该基因在进化过程
中是相对保守的,同时,这也可能是由每个基因成员的分工不同所决定的。Fad2-1A蛋白的前 283个氨基酸
与 fad2-1B的同源性高达 98.9%,但前者比后者多 97个氨基酸,这种现象与大豆相似。Tang等[3]发现大豆
fad2-1A与 fad2-1BDNA序列的同源性达到了 98.3%,编码的蛋白只有 24个氨基酸残基不同,并且二者跟
组成型表达的 fad2-2DNA序列的同源性都在 67%左右。
将基因转到模式生物中是研究一个基因功能及表达调控规律简单有力的方法。酵母是一种简单的真
核细胞,比大肠杆菌等原核菌株更适合进行真核生物基因功能的研究,很多工程菌株已经被广泛的用于各
类基因的研究。pYES2载体是一种在大肠杆菌与酵母中都能够扩增的穿梭质粒,这个质粒带有能够高效诱
导表达下游蛋白的 GAL启动子,方便利用的多克隆位点,有效的转录终止子 CYC1、便于转化子筛选的
URA3基因以及 Amp抗性基因等(图 7),pYES2质粒的结构特点使将目的基因克隆进载体并转化酵母进行
表达过程简便易行。本研究将从中间锦鸡儿未成熟种子中克隆的 fad2-1A基因构建到真核表达载体 pYES2
中,为进一步将该基因转入酵母中进行功能验证及表达调控研究打下了坚实的基础。
参考 文献
1 OkuleyJ,LightnerJ,FeldmannK,YadavN,LarkE,BrowseJ.PlantCel,1994,6:147~158.
2 李柱刚,马荣才,曹鸣庆,崔崇士.农业生物技术学报,2004,12(5):515~520.
3 TangGQ,NovitzkyWP,GrifinHC,HuberSC,DeweyRE.ThePlantJournal,2005,44:433~446.
4 HernandezML,ManchaM,Martinez-RivasJM.Phytochemistry,2005,66(12):1417~26.
5 MikkilineniV,RochefordTR.TheorApplGenet,2003,106(7):1326~32.
150