全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月476
西伯利亚蓼几丁质酶基因Class IV的克隆及生物信息学分析
刘关君 1,*，刘昌财 1,2，刘明坤 1，魏志刚 1，刘桂丰 1
1林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室，东北林业大学，哈尔滨 150040；2中国人民解放军 61699部队，湖北
枝江443200
提要：根据西伯利亚蓼抑制消减文库(SSH)中获得的几丁质酶(CHI)基因的部分序列，采用RACE 技术克隆了具完整编码
区的 cDNA序列，基因全长 1 017 bp，开放阅读框编码 270个氨基酸。序列分析表明，该基因的编码蛋白(PsCHI1)以前
体形式存在，N端分别有22个氨基酸的信号肽和35个氨基酸的几丁质结合域(CBD)，C端199个氨基酸为催化区(CD), 连
接CBD与CD的 14个氨基酸为可变交联区，成熟蛋白为不含信号肽部分，呈碱性，带正电荷。PsCHI1与所选其它植物
class IV CHI前体序列具有高度的同源性(53%~69%)，而与 class I和 class II CHI的氨基酸序列同源性较低，推测为植物
class IV CHI。根据日本水稻 CHI晶体结构构建了 PsCHI1三维分子模型，分析显示 PsCHI1可以识别比 class I和 class II
CHI短的几丁质片段，并以其它植物CHI的已知结构域和功能为基础，确定PsCHI1具有能够水解真菌细胞壁的结构，推
测其可能有抗病原微生物的功能。
关键词：西伯利亚蓼；几丁质酶(CHI)；RACE；GPI锚
Cloning and Bioinformatics Analysis of Class IV Chitinase Gene from
Polygonum sibiricum Laxm.
LIU Guan-Jun1,*, LIU Chang-Cai1,2, LIU Ming-Kun1, WEI Zhi-Gang1 , LIU Gui-Feng1
1Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology, Ministry of Education, Northeast Forestry University,
Harbin 150040, China; 2 The NO. 61699 Army of Chinese People’s Liberation Army, Zhijiang, Hubei 443200, China
Abstract: A partial sequence of a Chitinase gene (CHI) was obtained from a random clone in Polygonum
sibiricum SSH library and the CHI was isolated from P. sibiricum leaves by using rapid amplification of cDNA
end (RACE) technology. The acquired gene was 1 017 bp in full length, including an open reading frame (ORF)
of 810 bp which encoded 270 amino acids. Sequence analysis suggested that the protein (PsCHI1) existed as a
precursor which comprised an amino-terminal (N-terminal) signal peptideof 22 amino acids, a cysteine-rich
chitin-binding domain (CBD) of 35 amino acids, a variable hinge domain (VHD) of 14 amino acids, and a
catalytic domain of 199 amino acids. The mature protein without signal peptide was positive charged and
showed slightly highly basic. The deduced amino acid sequence showed 53%–69% homology with class IV
CHI, and low homology with class I and class II CHI from selected plants. Therefore, it was identified as a
typical plant class IV CHI. A homology model based on the structure of a class I chitinase from rice (Oryza
sativa L. Japonica) was constructed, the analysis suggested that PsCHI1 enzyme recognized an even shorter
segment of the substrate than class I or II enzymes. On the basis of known structure and function of plant CHI,
we explained that PsCHI1 could attack against pathogen cell walls. As result, PsCHI1 was possibly involved in
antimicrobial activity.
Key words: Polygonum sibiricum; CHI; RACE; GPI anchor
收稿 2008-05-04 修定 2008-05-06
资助 黑龙江省重点攻关项目(GB06B303)。
* E-ma i l：l iu gu a nju n2 0 0 3 @1 2 6 .c om；T e l：0 4 5 1 -
82190607-13
几丁质是昆虫外骨骼、甲壳类外壳以及真菌
细胞壁的主要成分，高等植物本身不含几丁质。
植物几丁质酶(chitinase，CHI，EC3.2.1.14)是一
种酸性或碱性蛋白，分子量 25~35 kDa，通过水
解病原微生物细胞壁几丁质中 β (1→ 4)糖苷键产
生N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体或单体而起到抑菌作
用(Collinge等 1993)。大量证据显示，纯化的
CHI，尤其是与 β-1,3-葡聚糖酶组合在体外能够
降解真菌细胞壁且抑制真菌的生长，在病原菌(细
菌、真菌和病毒)侵染植物的过程中，不仅CHI普
遍被过量表达(Nielsen等 1993)，而且其酶活性也
明显增强(Grison等 1996) ；一些非生物胁迫如高
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盐、干旱、伤害、植物激素、重金属和臭氧等
也促进植物 C H I 基因的大量表达( G r a h a m 和
Sticklen 1994)。转基因实验表明，组成性表达
CHI增强植物对体外侵染真菌(Pasonen等 2004)和
细菌(Grison等 1996)的抗性，从而说明 CHI积极
参与植物防御病原微生物的过程，并能够赋予植
物一定的抗病性。近些年来，随着对 CHI在植物
防御生理与分子基础研究的不断深入，人们陆续
从多种高等植物中克隆了 CHI，并分离纯化了不
同类型的 CHI，根据其一级结构氨基酸序列的同
源性和某些特征，将植物 CHI分为 class I~class V
(Meins等 1994)，且不同种类的 CHI具有不同的
催化活性、物理特征、细胞定位和作用方式。这
些 CHI对采用基因工程技术提高植物的抗病性具
有一定的价值。迄今，应用 CHI已获得了抗病力
较强的杨树植株(许农等 1993)。
本文用NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼地下茎消
减文库中的 EST序列(GenBank登录号 ES599907)
和RACE技术克隆了PsCHI1基因 cDNA 序列，并
作了生物信息学分析，推断了编码蛋白的结构、
功能和可能的细胞定位，为进一步研究其基因功
能以及与非生物胁迫关系建立了基础。
材料与方法
西伯利亚蓼(Polygonum sibiricum Laxm.)耐盐
种质材料XBLYL-027由本实验室提供，采自黑龙
江省肇东县盐碱地。本文所用的大肠杆菌菌株为
Escherichia coli TOP10 (天根公司)， 克隆载体为
pGEM®-T (Promega公司)。DNA片段回收试剂
盒、DL2000、dNTP、RNase A、Taq DNA 聚
合酶、Taq Plus DNA聚合酶(高保真)、IPTG、
X-gal购自天根生化科技有限公司；逆转录合成试
剂盒Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 购
自百泰克生物技术有限公司；BD SmartTM RACE
cDNA Amplification Kit购自BD Biosciences公司；
各种限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自Promega
公司； EDTA、DEPC、MOPS为赛百盛公司产
品；SDS、Tris为 Sigma公司产品；其它总 RNA
提取试剂及常规药品均为进口或国产分析纯级。
引物合成及测序工作由上海生工生物工程有限公司
完成。
根据王玉成等(2003)文中的方法，取盐胁迫
处理后的西伯利亚蓼茎部组织提取总 RNA。非变
性琼脂糖凝胶电泳参照《分子克隆实验指南》
(2002)的方法进行，胶浓度为 0.8%，检测总RNA
的完整性。用紫外分光光度计测定提取的RNA 在
波长 260和 280 nm 处的光吸收值，确定 RNA 的
纯度及浓度。
参照SMARTTM RACE cDNA Amplication Kit，
取1 µg的总RNA分别反转录合成5 RACE模板(5
RACE-Ready-cDNA，5 rrcDNA)和 3 RACE模板
(3 RACE-Ready-cDNA，3 rrcDNA)。
根据已知序列设计 3 RACE特异性正向引物
CHI-S，序列为5 CCTGTTTATTGGAACTACAAC-
TATGG 3，反向引物为UPM (见 RACE说明书)，
以 3 rrcDNA为模板，PCR反应体系参照试剂盒
(SmartTM RACE cDNA Amplification Kit BD Biosciences)
说明书。反应条件为 94 ℃中变性 3 min，然后按
94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 进行 35轮的
循环反应，最后在 72 ℃下延伸 8 min。
将此 PCR扩增产物的特异性片段进行胶回
收，载体连接，转化，经 Amp+抗性及蓝白斑筛
选，随机挑取阳性克隆进行 PCR鉴定，由上海
生工生物工程技术服务有限公司完成测序。
根据上述方法将已获得的 3 RACE扩增产物
序列经NCBI blastX分析确认为 PsCHI1 3到头序
列，在其 3非翻译区分别设计引物 CHI-A1 (外侧
引物)和 CHI-A2 (内侧引物) 以获得具完整编码区
的 cDNA，CHI-A1引物序列为 5 TCAAGTAC-
GATGATAATAATACATTCCAC 3，CHI-A2引物序
列为5 GAGCACAGAACACATCTTATTCAAGTACG
3，将 5 rrcDNA作为模板，反应体系同前，CHI-
A1与UPM作为引物进行第 1次 PCR反应，反应
条件为 94 ℃变性 3 min，然后按 94 ℃ 30 s、52
℃ 30 s、72 ℃ 1 min 进行 35轮的循环反应，最
后于 72 ℃下延伸 8 min。取其 0.5 µL产物作为模
板，CHI-A2与NUP (见RACE说明书)作为引物进
行第 2次 PCR反应，反应体系同前，反应条件为
94 ℃变性 3 min，然后按 94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、
72 ℃ 1 min 进行 35轮的循环反应。
第 2次 PCR扩增产物的特异性片段进行胶回
收，载体连接，转化，经 Amp+抗性及蓝白斑筛
选，随机挑取阳性克隆进行 PCR鉴定，由上海
生工生物工程技术服务有限公司完成测序。
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BioEdit软件的CAP (contig assembly program)
进行电子拼接，ORF程序(http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/gorf/gorf.html )查找序列的开放读码框(open
reading frame，ORF)，应用 BioEdit程序选择 13
种CHI建立本地蛋白数据库Local Blast程序进行序
列一致性比较，ClustalW Mutiple alignment进行多
序列比较和生成系统进化树文件，Treeview 1.6.6
查看进化树文件，BioEdit软件的KyteζDoolittle
Scale Mean Hydrophobicity profile程序算法进行疏
水性分析，ProtParam (http://au.expasy.org/tools/
protparam.html)计算蛋白的分子量、净电荷和理
论等电点，选用 BlastP (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/BLAST/)比对并预测保守区，应用 Profile
search、Scan prosite和Motif Scan程序(http://au.
expasy.org/prosite)进行轮廓、结构域和基序分
析。SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/
SignalP)预测蛋白的信号肽及可能的切割位点，
TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP)
进行亚细胞定位，TMHMM 2.0 (http://www.cbs.
dtu.dk/services/TMHMM/)预测蛋白内部跨膜螺旋，
big-PI Plant Predictor (http://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/
plant_server.html)分析GPI锚位点。
应用 Swiss-Model (http://www.expasy.org/
swissmod/SWISS-MODEL.html)和MolMol软件产
生推断的 PsCHI1三维结构模型。
实验结果
1 总RNA提取质量鉴定
总RNA的质量是关系反转录cDNA完整性的
重要因素。提取的西伯利亚蓼茎部总 RNA 用无
RNase 的Dnase I处理，除去污染的基因组DNA，
用 1%的非变性琼脂糖凝胶电泳检测，RNA提取
结果见图 1。可以看到 28S rRNA与 18S rRNA条
带清晰，亮度比例达到 2:1以上，说明 RNA的完
整性较好。将所提取的RNA (OD260/OD280介于1.8~
2.0)用于反转录合成 RACE模板。
2 PsCHI1基因 3 RACE片段和具完整编码区
cDNA的获得
根据 SSH文库中获得的 129 bp PsCHI1片段
序列，设计引物 CHI-S，采用 3 RACE的方法扩
增 PsCHI1的 3端。经扩增得到 1条约 500 bp的
DNA片段(图 2)，测序后比对证实为 PsCHI1的 3
图 2 PsCHI1 的 3 RACE扩增产物
Fig.2 The 3 RACE product of PsCHI1 cDNA
M：D L 2 0 0 0 分子量对照；1：3 R A C E 扩增的产物。
端到头序列。
根据 3 RACE产物序列在其非翻译区设计引
物 CHI-A1和 CHI-A2，采用 5 RACE的方法直接
扩增完整的 PsCHI1全长。经巢式(Nested) PCR扩
增得到 1条约 950 bp的DNA片段(图 3)，与所推
测的片段大小一致，测序后经比对，证实为具完
整ORF的 PsCHI1序列。
3 PsCHI1的序列分析
将 3 RACE和 5 RACE的产物序列经电子拼
接获得带有 PolyA的全长 cDNA序列 1 017 bp，
ORF程序显示 5非翻译区 15 bp，3非翻译区 192
bp，ORF 810 bp，编码 270个氨基酸(图 4)。
经疏水性、S igna lP 3 .0、Pr ot Pa ra m和
ScanProfile程序分析此推断的氨基酸序列发现，
PsCHI1所编码的蛋白(PsCHI1)以其前体形式存
在，由信号肽、几丁质结合域( chi t i n-b indi ng
doma in，CBD)、可变交联区(va r iab le hinge
domain，VHD)和催化区(catalytic domain，CD)四
图 1 从西伯利亚蓼中提取的总RNA
Fig.1 Total RNA extracted from P. sibiricum
1 和 2 为 2 次提取的总 RN A。
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部分构成，将成熟蛋白定位于液泡的C端延伸区，
前体等电点(IEP)为 8.5，分子量(MW)为 28.7 kDa；
N端 1~22氨基酸区段具有典型的信号肽特征：带
正电荷，疏水性很强。第 22 (Ala)和第 23 (Gln)
氨基酸处为最有可能的信号肽切割位点，推定为
信号肽部分。
成熟蛋白缺少信号肽部分，其第一个氨基酸
为Gln，这与已知的 class IV成熟蛋白第一个氨基
酸一致。成熟蛋白呈碱性，理论 IEP为 8.3，理
论MW为 26.4 kDa。Motif Scan程序分析显示成
熟 PSCHI1的Gln23~Ser57氨基酸区段为 CBD部
图 3 PsCHI1 的 5 RACE扩增产物
Fig.3 The 5 RACE product of PsCHI1 cDNA
M：DL2000分子量对照；1：5 RACE扩增的产物。
图 4 PsCHI1具完整编码区 cDNA序列和推定的氨基酸序列
Fig.4 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PsCHI1 cDNA from P. sibiricum
下划线部分 2 2 个氨基酸为信号肽；虚线部分氨基酸为 C BD；双下划线部分氨基酸为 V H D；其它部分为 C D。阴影部分核
苷酸为由 SSH 库中获得长度为 129 bp的 PsCHI1 部分序列；阴影加粗部分核苷酸(529~554 bp)为引物 CHI-S；其后面核苷酸部分
为 3 RACE获得的片段序列。加粗核苷酸部分 950~978 bp和 931~959 bp分别为引物 CHI-A1和 CHI-A2。方框表示起始密码子；
E n d 表示终止子。
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分，IEP=5.8，MW=3.5 kDa，含有高度保守的
氨基酸和较高的极性氨基酸比率，具显著的植物
CBD (编号 PS00026) “C-x(4,5)-C-C-S-x(2)-G-x-C-
G-x (3,4)-[FYW]-C”序列特征(图 5)，8个位置基
本固定的半胱氨酸(Cys)是PsCHI1极为保守的4个
二硫键的形成位点。另外，一些较为保守的亲水
性残基涉及与底物的结合，如芳香族氨基酸－这
里为酪氨酸(Y) (图 5)。Asn58~Ser71区段为VHD
部分，负责连接CBD与CD，其氨基酸组成单一，
富含 Ser和Gly，无 Pro残基，呈酸性，IEP=3.8，
MW=1.2 kDa。C端Val72~Cys270为 CD部分，
呈碱性，带正电荷，IEP=8.8，MW=21.8 kDa，
Cys89~ Gly111区段具CHI家族19_1标签(chitinases
family 19_1 signature，PS00773) “C-X(4,5)-F-Y-
[ST]-X(3)-[FY]-[LIVMF]-X-A-X(3)-[YF]-X(2)-F-
[GSA]”序列特征，Val203~Lys213区段与 CHI家
族 19_2标签 (PS00774)“[LIVM]-[GSA]-F-X-
[STAG](2)-[LIVMFY]-W-[FY]-W-[LIVM]”序列基
本一致，但在最后的一个氨基酸位置上有差异，
前者为 K ，而后者应是 L I V M 之一。
Thr229~Arg231和Asn267~Cys270区段分别为蛋白
激酶C磷酸化糖基化位点(PKC phosphorylation site)
和 N-糖基化位点(ASN glycosylation site)。
TargetP 1.1、TMHMM和 big-PI Plant Predic-
tor预测表明，PsCHI1被分泌到细胞外，无明显
的跨膜区，在C端序列Arg249位置具一个潜在的
糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，
GPI)修饰位点。根据日本水稻(Oryza Sativa L.
Japonica) CHI (pdb2DKV)晶体结构作为CHI的CBD
和 CD的同源模型模板构建了 PsCHI1的晶体结构
模型(图 8)。另外，又根据Garcia-Casado等(1998)
对核果种子 CHI保守位点突变的研究，推测出与
PsCHI1相对应的涉及底物结合及催化活性氨基酸
残基位点(图 6)。
4 PsCHI1与其它类型CHI的同源性比较
选择 8个 class IV　(红藜、甜菜、薯蓣、日
本薯蓣、水稻、葡萄、拟南芥、胡萝卜 ) 、2
个 class I (湖南烤烟、日本水稻)、2个 class II
(大麦、刀豆)和 1个 Class III (热紫链霉菌)共 13
个 CHI建立本地 CHI蛋白数据库，应用 Bioeditor
软件将PsCHI1所编码的蛋白序列与所建立的蛋白
数据库进行多序列比对(图 6)，经 BLASTP分析，
发现分子克隆到的PsCHI1所编码的蛋白与class IV
CHI的氨基酸序列具有较高的同源性(53%~69%)。
PsCHI与其它类型的CHI氨基酸序列有较低的同源
性，分别为湖南烤烟 42%、日本水稻 40%，栽
培二稜大麦 44%、刀豆 38%；而与 class III (热
紫链霉菌)的同源性为 38%。说明 PsCHI1与 class
IV有较近的亲缘关系，同时发现 PsCHI1和其它
class IV CHI在 CD处都有大量的缺失(图 6)，因
此显示出具有明显的 class IV CHI特征。另外，
从一种藜属植物中分离得到4个CHI (Nakamura等
1997)，其编码的 class IV CHI与本文的PsCHI1序
列同源性为 66%~69%。因此从氨基酸序列同源性
上来看，PsCHI1应属于 class IV CHI。
选择以上蛋白绘制出系统进化树(图7)。从图
7可见，PsCHI1与其它物种 class IV CHI在进化
关系上较近，特别是与红藜和甜菜亲缘关系最
近；而与其它类型的 CHI亲缘关系较远。序列比
对结果以及进化树分析都表明PsCHI1应为编码西
伯利亚蓼几丁质酶蛋白一类的基因，且属于 class
IV CHI。
讨　　论
本文采用 RACE的方法从西伯利亚蓼中克隆
了几丁质酶基因 PsCHI1，通过同源性比对发现
PsCHI1编码蛋白与植物中已经克隆的class IV CHI
具有非常高的同源性，而与其它类型的 CHI同源
性较低，具有明显的 class IV CHI特征；进化树
分析也表明 PsCHI1编码蛋白与植物 class IV CHI
的同源关系较近，处在同一分支上。推定PsCHI1
编码蛋白属 class IV CHI。
class IV CHI受真菌侵染诱导，与植物的抗
性相关(Lange等1996；Nielsen等1994；Rasmussen
图 5 PSCHI1的CBD与其它植物 class IV CBD
保守的氨基酸序列比较
Fig.5 Comparison on the conserved amino acid sequences of
class IV CHI CBD between P. sibiricum and other plants
a：植物 cla ss IV CBD 保守的氨基酸序列；b：PSCH I1
的 C B D 氨基酸序列。
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图 6 PsCHI1与其他 13种CHI氨基酸序列的比较
Fig.6 Comparison on the amino acid sequences of PsCHI1 between other plants
根据 class I/II CHI的结构在 PsCHI1 序列上标注了 4个删除(del 1~4)；SP表示信号肽；CBD表示几丁质结合域(PS00026)；
Start of CD表示 CD 的开始；黑色的横线标记为 CD；C-terminal extension表示 C端延伸区。(1)为 CHI家族 19_1标签(PS00773)；
(2 )为 CHI 家族 19 _2 标签(PS0 07 74 )。序列上方字母加粗的残基是催化活性所必需的氨基酸；标记有星号的是对于催化活性重要
的氨基酸；带方框的氨基酸残基是推定的与底物结合位点；序列下面有线条标记的是活性位点(Ga rcia -Ca sa do 等 1 9 98 )。
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等 1992)，在植物的防御反应中起作用(de Gerhardt
等1997)。其赋予植物较强的抗病功能与易于亲合
和水解几丁质的结构密不可分。CBD是结合几丁
质所必需的(Iseli等 1993)，在不同CHI的CBD内
部，Tyr、Trp、Phe 残基是高度保守的，因而
认为是直接与几丁质的N-乙酰氨基葡萄糖的吡喃
糖环结合位点(Lee等 2007)，据此推断在 PsCHI1
的 CBD内部 Tyr38和 Tyr45是结合几丁质的必需
氨基酸；CD一般由 300个氨基酸组成，负责催
化功能，其活性中心的质子受体一般为谷氨酸残
基，根据烟草( Isel i -Gamboni 等 1998)、大麦
(Andersen等 1997)、核果种子、芸苔(Tang 等
2004) CHI CD内部两个极为保守的Glu残基(与
PsCHI1等位的是 Glu133、Glu142)突变中的结
果，推测它是两个催化所必需氨基酸。据此我们
也推测 PsCHI1是利用 CD 中保守的 Glu133和
Glu142分别作为质子供体和亲核试剂直接参与几
丁质的催化水解反应，从而起到抵抗病原微生物
的作用。因此，认为 PsCHI1在结构上具备结合
和水解真菌细胞壁主要成分几丁质的活性位点。
为了构建和推测PsCHI1的三维结构模型，必
须寻找与目的蛋白同源性较高且已测定的 CHI晶
体结构。但目前尚无与其同源性较高的 class IV
图 7 PsCHI1与其它 13种CHI的进化树
Fig.7 Phylogenetic tree between of PsCHI1 and other CHI
CHI晶体结构，可以获得的只有来自于大麦(Hart
等 1995；Song和 Suh 1996)和刀豆(Hahn 等 2000)
class II CHI (只有 CD)的X射线结构。虽然它们
与PsCHI1的CD氨基酸序列有一定的同源性(分别
为 45%和 38%)，但它们没有 CBD结构，只能作
为 CD三维结构模型。由于水稻 class I CHI (包括
CBD和CD) X射线结构刚刚得到测定，且这两个
蛋白的 CBD和 CD氨基酸序列具有较高的同源性
(分别为 56%和 40%)，因此，用其晶体结构作为
CHI的CBD和CD的同源模型模板构建PsCHI1晶
体结构模型(图 8)表明，PsCHI1三维结构CD中两
个保守的Glu催化残基之间的距离与水稻 class I
CHI相比较短，之间有一个更窄的裂缝，且因为
与其它 class IV CHI一样，PsCHI1属于内切几丁
质酶，可从几丁质的内部将其切断，根据这一结
构分析PsCHI1可能易识别较短的几丁质链，也就
是说在病原微生物侵袭植物时PsCHI1能够极易抓
住暴露的几丁质的一小部分而进行水解作用，它
很可能与class IV CHI充分有效水解真菌细胞壁直
接相关(Karasuda等 2003)。
虽然 PsCHI1具备水解真菌细胞壁的有利结
构，在植物的防御反应中起作用，今后仍需考虑
的是，PsCHI1片段来自于盐碱胁迫下西伯利亚蓼
地下茎的 SSH文库，其过量表达表明它可能参与
植物抗盐碱的过程，但其作用机制还不清楚，有
待进一步研究。
另外，为了进一步确证 PsCHI1在细胞内或
外的定位，在此序列中获得可能的 C端糖基磷脂
酰肌醇(GPI)锚定信息，这对今后设计突变实验是
重要的，随后此可置换某一氨基酸对其产生的影
响。GPI作为一种普通的翻译后修饰，由于其自
身能够决定蛋白质的细胞内定位并且限定蛋白的功
能范围，所以，了解一个蛋白的GPI脂质修饰是
有意义的(Kinoshita和 Inoue 2000)。本文采用 big-
PI Plant Predictor推测 PsCHI1前体蛋白GPI修饰
位点，发现C端序列Arg249位置具一个潜在的GPI
修饰位点，因此推测 P s C H I 1 的分泌途径为：
PsCHI1在粗面内质网核糖体合成，同时进入内质
网腔，而后，GPI分子的一部分与 PsCHI1多肽
C末端接合后将从前体蛋白切去 C末端前肽，最
后通过分泌泡转移并定位到细胞外侧质膜，因此
成熟PsCHI1不但是其前体蛋白去除信号肽，而且
植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月 483
也可能会失去一部分 C末端前肽，这一结果对今
后进一步研究 PsCHI1 CD特别是 C末端保守氨基
酸功能来说是有一定意义的。不久以前，Xu等
(2007)曾应用Big-Pi Predictor对水稻和拟南芥中所
有已知的不同类型的CHI中潜在的GPI位点进行查
找，但都没有查到此结构。
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图 8 CHI的同源结构模型
Fig.8 Homology modeling of CHI
CD 为催化区；VHD 为可变交联区；CBD 为几丁质结合域。 a：基于日本水稻 CHI (pdb 2DKV)晶体结构构建的 PsCHI1 三
维分子同源结构模型，其中 Glu133 和 Glu142为推定 PsCHI1催化活性所必需的氨基酸；b：日本水稻 CHI (pdb 2DKV)晶体结构
模型，其中 Glu154 和 Glu176 为日本水稻 CHI 催化活性所必需的氨基酸。
植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月484
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