全 文 ：广 西 植 物 Gujhaia 29(1)：55— 58 2OO9年 1月
杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白的细胞定位
王鹏举1，王天云2，冯英才l，刘红涛 ，薛乐勋
(1．郑州大学 细胞生物学研究室，郑州 45oo52；2．新乡医学院 生物化学与分子生物学教研室 ，河南 新乡 4530O3)
摘 要 ：为研究核基质结合区结合蛋白的功能及调控机制，PCR扩增杜氏盐藻 MBP的 cDNA全长序列及 N
端和c端序列，与绿色荧光蛋白基因融合构建真核表达载体，脂质体转染 CHO细胞，western bl。tting和荧光
显微镜检测基因表达情况和细胞定位 。结果显示：MBP及 N端和 C端融合蛋 白成功在 CHO细胞表达，MBP
和 c端部分定位于细胞核且聚集于核仁，N端部分分布整个细胞，说明MBP定位于细胞核且细胞定位信号
位于 C端，MBP可能与 rRNA前体结合发挥作用。
关键词：杜氏盐藻 ；核基质附着区；核基质结合区结合蛋白；真核表达载体 ；细胞定位
中图分类号 ：Q781 文献标识码：A 文章编号 ：1O()()一3l42(2OO9)O1一OO55一O4
Cellular l0calizati0n 0f M AR binding
pr0tein 0f D Z ZZ s Z
Ⅵ NG Pen Jul，Ⅵ NG Tian_Yun ，FENG Yin Cai ，
LIU Hon 1、a0 l，XUE Le—Xun
(1．Ln60mf0r 0_厂C B￡0Z0gj，，Z^ 鲫g 0“L z Pr ￡ ，Zhengzh0u 45OO52，China；2．DP户口r￡m鲫￡D_厂B 0 删 “r 口n
如 Pf“ 盘r B 0f0膏 ，X ，z 以ng M c＆ C0 Zeg ，Xinxiang 453OO3，China)
Abstract： R)study the function of Matrix attachment region(MAR)binding pr。tein(MBP)，fun 1ength，I terminal
and C—termina1 Of MBP gene fr。m D n eZZn s＆ 7z＆were amplified by RT—PCR，and fused to the green fluorescence
protein gene to construct the eukaryotic vector． Then，the recombinant vect。rs were transfected into Chinese hamster
ovary(CHO)ceI1s by Lipofectamine 2OOO． Flu()rescence m croscope and western bloting were perf。rmed to dete卜
mine the expressi()n of the fusion proteins and cel1ular loca1izati。n． The results shOwed that the fusi。n proteins were
expressed in CHO cels，the pr。teins of MBP and(>terminal part were localized in the nucleus and clear1y detected in
nucleoli，h。wever，the N—terminal part was dist ributed into aI1 celIs．
Kev w0r(Is：D“ n如 s“Z 口；matrix attachment regi。n；MAR binding protein；eukaryotic expression；cel1ular loca卜
izatinn
核 基 质 结 合 区 (matrix attachment reglon，
MAR)或核骨架结合 区(scaffold attachment re—
gion，SAR)是富含 AT碱基对 的非 编码序列，作为
一 种边界元件对染色体组装有重要的作用，而且将
MAR构建到外源基 因表达盒两侧时，能提高外源
基因的转录和表达水平(王天云等，2OO5；Brouwer
等，2OO2；Sid。renk0等，2003；Ascenzi等，2()O3)，但
目前关于MAR的调控机制还不清楚。序列特异性
DNA通过其结合蛋白在细胞内行使着基因表达调
控的作用，MAR作为一种顺式 DNA调控元件，必
需与反式作用蛋白因子结合才能发挥其调控作用。
因此，研究 MAR结合蛋白(MAR binding protein，
收稿日期：2。。7一o9—30 修回日期 ：2008一lO一22
基金项目：科技部国际科技合作项目(2∞7I)FAol240)；国家自然科学基金(3047。C3。)[sup1)oned by Internat1ona1 science and rechnol0gy cl舳perati0n
Pr0gram 0f the Ministry 0f Scjence and Technol0gy 0f chlna(2∞7I)FAOl24。)ithe Natinnal Natura】Science F0undation Df China(3O47D。3o)]
作者简介：王鹏举(1982一)，男 ，河南西平人 ，在读硕士，研究方向为细胞生物学，(E—mail)wang pj5O6@163·c0m。
*通讯作者(Author f0r c0rrespondence，E—ma1l：xueIx@371．net)
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MBP)对研究 MAR在基因表达 中的调节作用有着
重要的意义。目前 MBP的研究主要集 中在烟草 、
番茄、玉米、豌 豆等高 等绿色植物 ，一些研 究发 现
MBP定位于细胞核(Meier等 ，l996；Morisawa等，
2O0O)。高等植物存在器官组织分化问题，不同的分
化组织中细胞基 因表达 的方式和种类不 同，MAR
序列及其结合蛋白也可能存在差别。杜氏盐藻是一
种单细胞真核藻类，光合自养，抗逆性极强，无细胞
壁 ，是研究 MAR及其调控机制的 良好材料。前期
的研究中，我们从盐藻分离出 3个能显著提高外源
基因表达的 MAR序列(王天云等，2O07；wang等，
2O05，2OO7)，并且分离 出 MBP基 因 (GenBank ac—
cession no．：DQ124215)。本研究在前期研究基础
上 ，根据 GenBank上登 录 的杜 氏盐藻 MBP基 因
cDNA序列全长，PCR扩增序列全长序列以及 N端
和 C端序列，命名为：MBP，MBPN，MBPc，构建载
体 pEGFP—MBP、pEGFP—MBPN、pEGFP—MBPC，研
究其在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary，
CHO)中的表达水平和细胞定位，结果成功在 cHO
细胞中表达该蛋白，表达的 MBP和 c端序列定位
于细胞核，N端定位于整个细胞，说明 MBP的细胞
定位信号存在于 C端，这为进一步研究盐藻 MBP
的功能打下实验基础。
1 材料与方法
1．1材料
杜氏盐藻(D“舢Z gZ“s“z n“)(UTEX 1644)购
自美国德州大学；E． z JM1O9，pEGFP—C1质粒由
本实验室保存；CHO购自中国典型培养物保藏中
心。胎牛血清购自天津 TBD公司，Fl2／DMEM培
养基和胰酶购自Hyclone公司，pMD18一T载体，各
种工具酶 、均购 自 TaKaRa公 司；RNA 提 取试剂
TRIZ0L和 Lipofectamine 2O0O购 自 Invitrogen公
司；各种抗体购 自北京 中杉金桥生物技术有限公司。
DNA Marker、蛋白 Marker购自 Fermentas公司。
引物合成及测序由上海生工公司完成。
1．2方法
1．2．1盐藻细胞的培养 盐藻细胞以5×1O。mL 的
接种量接种在 Ben．Amotz培养基中，在 26℃条件下
光照培养(Ben_Am。tz等，1989)，光照强度 81 mol·
rr ·s- ，光暗周期各 12 h。
1．2．2 MBP基 因的克隆及 载体的构建 根据 Gen—
Bank上登录杜氏盐藻 MBP cDNA序列设计4条引
物，全 长上游 引物 P1：5 CGG AAG CTTGG ATG
GTT CTC GTC TTG TTC GAG AC一3 ，下游 引物
P2：5 一CGG GAA TTC T1、A ATG ATG ArG ArG
ATG ATG CTC AGC GGC CTT CTT( v】_ r-3 ，
C端上游引物：PC：5℃GG AAG C1vr A=rG CCC TAC
GAC AAG ACC AAG (>3 ，N端下游 引物：PN：5 一
CGG GAA TTC TTA ATG A=rG ATG AI℃ ArG
ATG GGA TCC ACG CGC GGG CTG CTC CTT 0C-
3 ，划线部分分别为引入的 HindⅢ、EcoRI酶切位点
及六个 His标签，其中 P1和 P2，P1和 PN，PC和 P2
分别构成 MBP，MBPN， PC的上下游引物。
TRIZOL试剂提取杜氏盐藻总 RNA，AMV逆转
录酶合成 cDNA第一链。因目的片段 GC含量较高，
用 2×GC bufferI(或者 2×GC buferⅡ)扩增。PCR
扩增条件：94℃ 2 min；94℃ 4O s、62℃ 30 s、72℃ 2
min，3O个循环 ，72℃ 1O min。1 的琼脂糖凝胶电泳
检测。以 HindⅢ、EcoRI双酶切目的基因片段，T4连
接酶连接到用同样双酶切的pEGFPC1载体上。转化
大肠杆菌 JM1O9，提取质粒酶切鉴定。
1．2．3转染 CHO细胞 将 2×105／mL CHO细胞
接种于 6孔板上，F12／DMEM新鲜培养基过夜培
养。按脂质体Lipofectamine 2OOO说明书分别转染
pEGFPC1、pEGFP—M BP、pEGFP—MBPN、pEGFP—
MBPC，阴性对照孔则加入 5OO L无血清培养液。
37℃、5 CO。培养 24 h后收集细胞。
1．2．4细胞定位 用日本 Nikon公司显微荧光摄像
／照相系统检测杜氏盐藻的 MBP的融合蛋白的细
胞定位。观察绿色荧光的荧光滤色块参数为：Exci—
tation Fnter 435／1O(MBE34232)，Dichtoic Mirror
DM455 (MBE3427O)， Barrier FiIter NBA48O
(MBE34535)。
1．2．5 westem b10tting检测 空转染质粒提取的
蛋白和重组蛋白经 SDS—PAGE电泳之后 ，将胶上的
蛋白通过半干转的方式转移到硝酸纤维素膜上，用
鼠抗组氨酸标签的抗体为一抗，山羊抗鼠抗体为二
抗进行 western blotting分析，并用p—actin作对照。
2 结果
2．1 MBP基因的克隆及载体的鉴定
PCR结果显示，扩增出的DNA特异条带片段
大小约在 1 6()(]、1 200、4O0 bp，与预期结果相符(图

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及 MBP，研究发现杜氏盐藻 MBP同 Nop5／Sik家
族中其他成员一样 C端含有多个 KKx基序，并且
和来 自酵母的 Nop5类蛋 白的一级序列很相似，且
其中有很多长于 10个氨基酸残基的共有模体如
LLDDLDKELNTYAMRVREWYGW H FPE模体 。
为进一步研究杜氏盐藻 MBP经过 BLAST分析 ，杜
氏盐藻 MBP含有 Nop家族的结构域。因此 ，本文
的 MBP可能属于 Nop家族 。有研究表明，Nop家
族中的组分如 Nop1p和 Nop5p(Nop58p)是小核仁
核糖蛋白复合体(snoRNP)的组分与 RNA的剪切
相关。Nop5类 MBP已经被证实和 rRNA前体结
合(Gautier等，1997)。豌豆中的 Nop58类 MBP能
结合 MAR DNA(Haton等，l999)。
为进一步研究杜氏盐藻 MBP的功能，本实验
构建 了盐藻 MBP真核表达载体并在 CHO细胞 中
进行基因表达定 位，结果显示盐藻 MBP主要在细
胞核中表达。考虑到本实验中表达的绿色荧光蛋白
融合蛋白清楚地定位于细胞核和与 Nop5类 MBP
的结构的相似性，可能杜氏盐藻 MBP也参与rRNA
的加工。作为细胞核的蛋白质分子进入细胞核通常
拥有一个单价或双价的由碱性氨基酸组成的核定位
信号(nuclear 1oca1ization signal，NLS)。它可以结
合在特定的 NLs受体 importin—a上从而进入细胞
核(Fagerlund等，2()(]2)。烟草 中的 N。p5类 MBP
在c末端含有一个由碱性氨基酸组成的核定位序
列(Fujiwara等，2OO2)，本实验显示杜 氏盐藻 MBP
定位于细胞核且 C末端也富含碱性氨基酸，且根据
http：／／cubic．bioc．columbia．edu／predictNLS／在
线预测，PKKKKKE和 KKKAEAGAADGGAAE—
EAPKKKKK为核定位信号序列。其中 PKKKKK
与第一个被确定 的病毒 sV4O的 T抗原的 NLs
(PKKKRKV)(Dingwa1l等，1982)相似。下一步实
验是缺失突变或关键碱性氨基酸残基点突变后的蛋
白突变体是否改变原有 的野生型蛋 白的定位模式，
进一步确定这个潜在核定位信号与核转运受体蛋白
交互作用的结构基础。
致谢 本工作在河南省分子医学重点学科开放
实验室完成，特此感谢 !
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