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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
不同昆虫泛素基因部分序列的生物信息学分析
强承魁1  杜予州 2  凤舞剑 1  王胜永 1  周保亚 1  胡忍 3  崔亚东 4
( 1徐州生物工程职业技术学院农林工程系,徐州 221006; 2扬州大学应用昆虫研究所,扬州 225009;
3徐州生物工程职业技术学院科技产业处,徐州 221006; 4阜阳师范学院生命科学学院,阜阳 236032 )
  摘  要:  采用比较基因组学和生物信息学方法系统分析了 NCBI中已公布的二化螟、棉卷叶螟和草地贪夜蛾等 13种
昆虫 Ub基因及其氨基酸序列的结构特点、差异和遗传多样性及进化关系。结果表明, Ieu、Thr、Ile和 Lys作为 13种昆虫 U b
的主要氨基酸 ,多呈碱性, 无前导肽、信号肽和跨膜结构域 , 延伸带和无规则卷曲为主要结构元件, 第 57和 22位点分别发
生 Se r和 Thr磷酸化, 总体呈亲水性。同时检测出 96个多态位点, 共生成 13个单倍型, 昆虫种间该基因具较丰富的遗传多
样性。
关键词:  昆虫  泛素基因  生物信息学  遗传变异
Bioinformatics Analysis of Partial Sequences ofUbiquitin
Gene Among Different Insects
Q iang Chengkui
1  Du Yuzhou2  FengWujian1  W ang Shengyong1
Zhou Baoya
1  Hu Ren3  CuiYadong4
(
1
D epartm ent of Agr iculture and Landscape Engineering, Xuzhou Bioengineering TechnicalCollege, Xuzhou 221006;
2
Institute of App lied Entomology, Yangzhou University, Yangzhou 225009;
3
D epar tment of Science and T echnology,
Xuzhou Bioeng ineering Technical College, Xuzhou 221006;
4
College of L ife Sciences, Fuyang TeachersCollege, Fuyang 236032)
  Abstrac:t  Based on the published sequences o f ubiquitin gene ofCh ilo supp ressalis, Haritalodesd erogata and Spodop tera frugiper

da and so forth in NCB I, the structure characters, d iffe rences and gene tic d iversity w ere ana ly zed using the m ethod o f com para tive ge

nom ics and b io inform atics. The results show ed that them ain am ino acids w ere Ieu, Thr, I le and Lys, and m ost o f basic am ino ac ids. P re

propeptide, signa l peptide and transm em brane dom a in w ere not found. Them a in structural elem ent was ex tended strand and random co il
in the pred ic ted secondary structure. Phosphory la tion sites o f Ser and Thr occurred in the am ino ac id residue 57 and 22, respectively.
The to tal o f 96 po lym orphic sites were de tected from 13 sequences and 13 hapolotypesw ere sorted. M ore nucleo tide d iversity and am ino
acid d iversity of ubiquitin gene ex isted am ong 13 insec ts.
Key words:  Insect Ub iqu itin g ene B ioinform atics Genetic var iation
收稿日期: 2010
05
07
基金项目:徐州生物工程高等职业学校校长基金项目 ( 200901) ,安徽省农业科学院院长青年创新基金项目 ( 2009A0908) ,国家重点基础研究发
展规划 ( 973!计划 )项目 ( 2006CB102002 )
作者简介:强承魁,男,博士,副研究员,研究方向:昆虫生理生化及分子生物学; E
m ai:l xzqck@ yahoo. com. cn
通讯作者:杜予州,教授,博士生导师, E
m ai:l yzdu@ yzu. edu. cn
泛素 (Ub iqu it in, U b)是首次从牛胸腺中分离出
的一种由 76个氨基酸残基组成的小分子热休克蛋
白,相对分子质量约为 8. 6 kD [ 1]。后续研究发现其
广布于真核生物且极其保守, 一级结构仅相差 1- 5
个氨基酸残基, N端和 C端分别为较紧密的球状和
松散的伸展结构,三维结构也基本一致 [ 2]。作为一
个多基因家族且都以融合基因形式存在的 Ub可分
两类:其一是多聚 Ub基因 ( polyubiquitin genes) , 多
在分生组织、微管组织和衰老组织中被热激和创伤
等诱导表达; 其二是 C
末端延伸 Ub基因 ( C
term i

nal extension genes) ,可在分生组织中被创伤和干旱
等诱导活跃表达。目前已发现 Ub参与细胞中大多
2010年第 10期       强承魁等:不同昆虫泛素基因部分序列的生物信息学分析
数短周期寿命蛋白降解的级联反应, 即通过调节细
胞内蛋白周转来调控细胞多种生命过程, 如参与热
休克反应、DNA损伤修复、核糖体生物发生、细胞内
吞、炎症调节、免疫应答、信号转导、转录调控、组蛋
白和受体修饰等 [ 3, 4]。此外,还可参与离子通道、分
泌调控及神经网络、细胞器的形成及人类疾病的病
理调控过程等。因此, 该蛋白的生理功能与昆虫免
疫性调控的关系及其分子机制方面的研究已成为近
年来的研究热点。
目前国内外已陆续报道了草地贪夜蛾 Spodop tera
f rugip erda
[ 5]、烟草天蛾 Manduca sex ta [ 6]、黑腹果蝇
D rosophila melanogaster
[ 7]、斜纹夜蛾 Spodop tera litu

ra
[ 8]、德国小蠊 B lattella germanica [ 9]、甜菜夜蛾 Spo

dop tera ex igua
[ 10]、棉铃虫H elicoverpa arm igera[ 11]、野
桑蚕 Bombyx mandarina[ 12]、家蝇 Musca domestica[ 13]
和棉卷叶野螟 H aritalod es d erogata [ 14]等昆虫 Ub基
因编码区序列, 且证实在昆虫中肠、脂肪体、马氏管
和飞行肌等组织中高水平表达,可见其在调控昆虫生
命活动过程中具重要作用 [ 7]。到目前为止, 有关昆虫
Ub在生物信息学方面的系统研究尚未见报道,故本
研究采用比较基因组学和生物信息学方法分析该基
因及其相应氨基酸序列的理化性质,结构特征、功能
及其变异等,旨在为研究该基因在不同昆虫种间的遗
传分化及其生物防治新思路方面提供基础资料。
1 材料与方法
1. 1 序列来源
序列资料来源于 NCB I网站 GenBank数据库中
已注册的昆虫 Ub核苷酸序列及其对应的氨基酸序
列:二化螟 Chilo supp ressalis( GU238420)、棉卷叶野螟
Haritalodes derogata( EU580145)、草地贪夜蛾 Spodopt

era f rug ip erda (M 30306)、果蝇 D rosophila melanogaster
(M 22428)、斜纹夜蛾 Spodop tera litura( AF436066)、德
国小蠊 B lattella germanica ( AY501003)、美洲大蠊
Perip laneta americana ( EF101563)、甜菜夜蛾 Spodopt

era ex igua ( AY149883)、烟草天蛾 Tobacco hawkmoth
(X53524)、野桑蚕 Bombyx mandarina (DQ839401)、棉
铃虫 H elicoverpa arm igera ( AY456195)、家蚕 Bombyx
mori(AF308163)和家蝇Musca domestica( DQ115796)。
1. 2 方法
不同昆虫 Ub氨基酸残基数、分子量、理论等电
点和氨基酸序列采用 DNAStar软件分析, DNAMAN
5. 2 Server进行序列比对, TargetP 1. 1 Server分析前
导肽, S igna lP 3. 0 Server分析信号肽, TMHMM 2. 0
Server分析跨膜结构域, NetPhos 2. 0 Server分析翻译
后磷酸化修饰位点, NCBI链接的 CDD分析保守结构
域, SOPMA程序分析二级结构, DanSP 4. 0 Server和
MEGA 3. 1Server分别进行遗传多样性和聚类分析。
2 结果
2. 1 昆虫 Ub基因核酸序列及其推导的氨基酸序
列组分和理化性质分析
采用 DNAStar软件 Editseq和 Protean程序分析
GenBank中已注册的二化螟、棉卷叶野螟和草地贪
夜蛾等 13种昆虫 U b核酸序列及其推导的氨基酸
序列组分和理化性质 (表 1)表明, 推导的氨基酸残
基数多为 76个, 分子量和理论等电点分别介于 847
- 17. 85和 5. 19- 9. 85之间,说明除二化螟和德国小
蠊 Ub外均呈碱性;烟草夜蛾、甜菜夜蛾、家蚕和黑腹
果蝇 Ub中碱性氨基酸比例均超 20%,二化螟和家蚕
Ub中酸性氨基酸和亲水氨基酸比例均最高, 分别为
15. 79%和 27. 13%, 德国小蠊、美洲大蠊和野桑蚕
Ub中疏水氨基酸比例均高达 32. 89% ,烟草夜蛾 Ub
中带电氨基酸比例最高 ( 43. 87% ); Ieu、Thr、Ile和
Lys属于这 13种昆虫 Ub的主要氨基酸。
2. 2 昆虫 Ub氨基酸序列的前导肽、信号肽和磷酸
化修饰位点分析
采用 TargetP1. 1 Server和 S igna lP 3. 0 Server均
未预测出 GenBank中已注册的二化螟、棉卷叶野螟
和草地贪夜蛾等 13种昆虫 Ub具前导肽和信号肽。
采用 N etPhos 2. 0 Server分析出家蝇泛素第 57氨基
酸位点发生 1个 Ser磷酸化, 第 22和 66氨基酸位
点各发生 1个 Thr磷酸化 (图 1) ,其余 12种昆虫泛
素第 57和 22氨基酸位点分别发生 1个 Ser和 1个
Thr磷酸化。
2. 3 昆虫 Ub氨基酸序列疏水性 /亲水性分析
采用 ProtSca le程序预测出二化螟 Ub疏水性
最大值和最小值分别为 1. 544和 - 1. 956 (图 2) ,
其多肽链 C、N端均表现出较强的疏水性即疏水性
头部,但总体呈亲水性更强,此与 G enBank中已注
册的其它 12种昆虫 Ub疏水性 /亲水性情况基本
一致。
189
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 10期
表 1 不同昆虫 U b基因的核酸序列及其氨基酸序列组分和理化性质分析
物种 推导的氨基酸残基数
分子量
( kD)
理论等
电点
氨基酸残基比例
酸性 aa. 碱性 aa. 亲水 aa. 疏水 aa. 带电 aa.
主要
氨基酸
二化螟 76 8. 50 5. 19 15. 79 13. 16 25. 00 31. 58 31. 58 L, T, I, K
棉卷叶蛾 76 8. 56 7. 16 14. 47 14. 47 25. 00 31. 58 31. 58 L, T, K, I
草地贪夜蛾 76 8. 53 8. 51 13. 16 14. 47 25. 00 31. 58 30. 26 L, G, K, I, T
黑腹果蝇 128 14. 73 9. 85 10. 16 21. 09 26. 56 28. 12 39. 84 K, L, R, T
斜纹夜蛾 76 8. 56 7. 16 14. 47 14. 07 25. 00 31. 58 31. 58 L, K, I, T
德国小蠊 76 8. 47 5. 83 14. 47 13. 16 26. 32 32. 89 30. 26 L, K, I, T
美洲大蠊 76 8. 54 7. 16 14. 47 14. 47 25. 00 32. 89 31. 58 L, K, I, T
甜菜夜蛾 129 14. 75 9. 71 10. 85 20. 16 26. 36 28. 68 39. 53 L, K, I, R, T
烟草夜蛾 155 17. 85 9. 75 12. 90 22. 58 21. 94 27. 10 43. 87 K, G, L
野蚕蛾 76 8. 52 7. 16 14. 47 14. 47 25. 00 32. 89 31. 58 L, K, I, T
棉铃虫 76 8. 56 7. 16 14. 47 14. 47 25. 00 31. 58 31. 58 L, K, I, T
家蚕 129 14. 80 9. 71 10. 85 20. 16 27. 13 27. 91 39. 53 L, K, I, T
家蝇 76 8. 59 7. 16 14. 47 14. 47 25. 00 31. 58 31. 58 L, T, K, G, E, Q
图 1 家蝇 Ub氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰预测
图 2 二化螟 Ub氨基酸序列疏水性 /亲水性预测
2. 4 昆虫 Ub氨基酸序列跨膜结构域、保守结构域
和二级结构分析
采用 TMHMM 2. 0 Server均未预测出 G enB ank
中已注册的二化螟、棉卷叶野螟和草地贪夜蛾等
13种昆虫 Ub氨基酸序列具跨膜结构域 (图 3)。
经 NCB I链接的 CDD程序分析出上述 13种昆虫
Ub氨基酸序列具一致的保守结构域 (图 4) , 即属
于 Ub家族蛋白。采用 SOPMA程序预测出此 13
种昆虫 Ub氨基酸序列具相同的二级结构,如二化
螟 Ub氨基酸序列中

螺旋、延伸带、无规则卷曲
和 
转角分别为 12、25、28和 11个, 依次占该蛋
白的 15. 79%、32. 89%、36. 84%和 14. 47% ,可见
延伸带和无规则卷曲属于该 Ub蛋白的主要结构
元件 (图 5)。
图 3 二化螟泛 U b基酸序列跨膜结构域预测
图 4 二化螟 Ub氨基酸序列保守结构域预测
190
2010年第 10期       强承魁等:不同昆虫泛素基因部分序列的生物信息学分析
图 5 二化螟 Ub氨基酸序列二级结构预测
2. 5 昆虫 Ub基因核苷酸多样性分析
采用 B ioEd it软件比对分析出 13种昆虫 Ub核
苷酸共有片段长度, 经 DnaSP4. 0软件检测出 96个
多态位点,突变总数 153个, 不变位点、可变位点和
缺失位点分别为 132、96和 0个,其中单一多态位点
11个 (占 4. 82% )和简约多态位点 85个 (占 37.
28% )。另发现 13条昆虫 Ub基因序列中具 13种
单倍型,单倍型多样性为 1. 000 ∀ 0. 030, 平均核苷
酸差异数 ( K)及其多样性 ( )分别为 48. 308和 0.
21188 ∀ 0. 21624,可见该基因单倍型多样表明物种
间遗传变异较丰富, 且物种间个体分化程度居较高
水平。所有突变位点经 Tajima和 Fu and L i检验,其
Tajima# s D和 Fu and L i# s D分别为 - 0. 09251和
0. 52030, 差异不显著 (P > 0. 10) , 说明全部变异符
合选择中性。所截选的 13种昆虫 Ub基因序列中
密码子有效值 ( ENC )为 46. 542 ( < 61) , 偏爱指标
( CBI)为 0. 542( > 0) , !2检验计算出未校正的 !2值
为 0. 316,说明该基因具较强的密码子偏爱性。 13
种昆虫泛素同义替换位点数 ( SS)和非同义替换位
点数 (NSS)分别为 51. 67- 54. 33和 173. 67- 176.
33,同义替换核苷酸多样性均值 ( ( s) )和非同义替
换核苷酸多样性均值 ( ( a) )分别为 0. 840488和
0. 03226, 可见果蝇 Ub ( s)和野桑蚕 Ub ( a)均最
大,说明其同义替换和非同义替换分别较其它 12种
昆虫高 (表 2)。
2. 6 昆虫 Ub基因单倍型聚类分析
根据 13种昆虫 U b基因单倍型间的遗传距离
( Gst) ,采用 MEGA3. 1软件中 UPGMA法构建的系
统发育树见图 6。除双翅目果蝇和家蝇外, 其它昆
虫系统进化地位基本同目先聚集, 如蜚蠊目的德国
小蠊和美洲大蠊先聚集于一枝, 此与 N J法和 ME法
构建结果相似,总体基本符合昆虫形态学分类,推测
表 2 不同昆虫 Ub基因同义替换和非同义替换分析
物种 同义替换位点数 ( SS ) 非同义替换位点数 ( NSS)
二化螟 52. 50 175. 50
棉卷叶蛾 52. 67 175. 33
草地贪夜蛾 54. 17 173. 84
黑腹果蝇 54. 33 173. 67
斜纹夜蛾 52. 83 175. 17
德国小蠊 52. 67 175. 33
美洲大蠊 54. 17 173. 83
甜菜夜蛾 52. 50 175. 50
烟草夜蛾 53. 83 174. 17
野桑蚕 51. 67 176. 33
棉铃虫 53. 83 174. 17
家蚕 52. 33 175. 67
家蝇 51. 83 176. 17
平均 53. 03 174. 97
昆虫 Ub可能起源于共同祖先。其中果蝇和家蝇未
能很好聚集可能与试验分析序列过少或 Ub基因本
身保守性较强有关。
图 6 UPGMA法构建的不同昆虫 Ub基因
单倍型间遗传距离的系统发育树
191
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 10期
3 讨论
诸多研究报道 U b基因在昆虫中肠、体壁、脂肪
体、马氏管和飞行肌等组织中均呈高水平表达,说明
其在昆虫生命过程中具重要作用 [ 7]。因此本研究
基于生物信息学的方法将 GenBank检索到的 13种
昆虫 Ub基因进行比较分析, 发现推导的氨基酸残
基数多为 76个,除二化螟和德国小蠊泛素外均呈碱
性, Ieu、Thr、Ile和 Lys作为这 13种昆虫 Ub的主要
氨基酸,均无前导肽和信号肽,除家蝇泛素外第 57
和 22氨基酸位点都分别发生 1个 Ser和 1个 Thr磷
酸化, 以延伸带和无规则卷曲作为该蛋白主要结构
元件的二级结构基本相同, 总体亲水性趋强且同源
性高达 93%以上, 此与 G lickman等 [ 15]报道不同种
属的真核生物中 Ub一级结构具高度相似性一致,
推测这些昆虫 Ub可能起源于共同的祖先。
特定基因高度多态性的内因一般为自然选择,
而本研究发现不同昆虫 Ub基因的核苷酸序列均具
高度多态性和特定的单倍型, 推测这与其借助 ATP
依赖性 Ub
蛋白酶复合体通路来参与昆虫免疫性调
控等方面的较强遗传适应性有关, 但需进一步研究
证实 [ 16]。金丰良等 [ 13]报道家蝇 U b抗体不仅可与
家蝇 Ub融合蛋白呈阳性反应, 而且能与斜纹夜蛾
Ub蛋白呈阳性反应, 说明该表达的蛋白质保持原有
Ub的免疫原性。Khush等 [ 17]提出果蝇体内 U b
蛋
白酶体途径通过降解免疫缺失的 Relish蛋白可促进
机体内抗菌肽基因激活和表达。结合本研究的 13
种昆虫 Ub多态位点数、核苷酸多样性、单倍型多样
性、密码子偏爱性、同义替换和非同义替换来看,泛
素基因表现出较丰富的遗传多样性, 故推测其有可
能成为调控昆虫免疫细胞信号转导方面研究的候选
标记基因。
Ub作为昆虫免疫系统中与抗原发生阳性反应
的一个基因群, 主要生理功能是经 ATP依赖性 Ub

蛋白酶复合体通路途径来高效且高度选择性降解细
胞质和细胞核内某些特定蛋白质。本研究发现 13
种昆虫 Ub非同义替换位点数均高于 3倍以上的同
义替换位点数, 尤其是野桑蚕进化地位相对最远
(图 6) ,说明其进化过程中可能受到正选择影响,因
非同义突变利于编码蛋白生理功能发挥而逐渐被固
定于物种 [ 18]。另本研究结果显示昆虫 Ub密码子使
用上呈现较强的偏爱性, 此与 Ghosh[ 19]报道源于不
同物种或同一物种的基因在编码特定蛋白质过程中
均具密码子偏爱性影响一致, 但有关密码子偏爱性
现象在物种进化中的作用机制尚无定论。
最后本研究发现所分析的 13种昆虫 Ub基因
突变总数达 153个, 诸多的突变位点是否与昆虫
Ub
蛋白酶复合体通路途径介导的蛋白选择性降解
及其细胞免疫性调控机制等方面相关,另泛素在昆
虫不同发育阶段、不同组织或器官中表达机理等亟
待进一步探究,以期为开辟重要农业害虫生物防治
新途径提供思路。
致谢: 本研究在软件分析方面承蒙河北农业大
学动物科技学院李祥龙教授和周荣艳博士的热情帮
助, 特致谢意!
参 考 文 献
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(下转第 197页 )
192
2010年第 10期     龚桂花等: RNA i技术降低头孢菌素 C工业生产菌株中 cefG基因的转录
本试验使用 RNA i的方法较同源重组法不仅较
快地获得了正确的转化子, 而且转化子对目的基因
的转录水平发挥了较好的沉默作用。对转化子的发
酵产物 CPC的分析也显示其产量发生了下降, 这与
cefG基因的转录水平下降是相对应的。通过研究,
我们进一步发现了 RNA i较同源重组在沉默基因水
平上的优势,同时也确认了 RNA i技术在顶头孢霉
工业菌株中应用的可行性。因此, RNA i不失为一个
迅速有效的基因工程手段并有望成为工业生产菌株
基因改造的新方法。
参 考 文 献
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