全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
胡麻专化型尖孢镰刀菌 ISSR-PCR最佳
反应体系的建立
苑琳1，2 刘姗姗2 路福平1 李子钦3 张辉3
(1天津科技大学生物工程学院 工业微生物重点实验室，天津 300222;
2内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021;3内蒙古农牧业科学院，呼和浩特 010031)
摘 要: 采用正交试验设计原理，对尖孢镰刀菌 ISSR-PCR反应体系中的 5 种主要因素进行优化筛选，确立了适合尖孢
镰刀菌 ISSR分析的反应体系，即 25 μL PCR 反应体积中含有 20 ng 模板 DNA、1 U Taq 酶、0. 4 μmol /L 引物、0. 2 mmol /L
dNTPs、4. 0 mmol /L Mg2 +和 2. 5 μL 10 × buffer。PCR反应最佳退火温度根据引物而定，在此基础上筛选出 12 条扩增稳定、多
态性丰富的 ISSR引物。此研究为今后利用 ISSR技术分析尖孢镰刀菌遗传多样性和群体结构奠定了基础。
关键词: 尖孢镰刀菌 ISSR 正交设计 反应体系 优化 引物筛选
Optimization of ISSR-PCR Reaction System for
Fusarium oxysporum Schl．
Yuan Lin1，2 Liu Shanshan2 Lu Fuping1 Li Ziqin3 Zhang Hui3
(1Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Bioengineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300222;
2College of Life Sciences of Inner Mongolia University，Hohhot 010021;
3 Inner Mongolia Academy of Agricultural ＆ Animal Husbandry Sciences，Hohhot 010031)
Abstract: An Orthogonal design is applied to the optimization of ISSR-PCR reaction system for Fusarium oxysporum Schl． The
effect of the five main factors was tested． A most suitable ISSR-PCR reaction system for Fusarium oxysporum Schl． was established． The
optimized reaction system consists of 20 ng template DNA，1 U Taq DNA polymerase，0. 4 μmol /L primer，0. 2 mmol /L dNTPs，4. 0
mmol /L Mg2 + and 2. 5 μL 10 × buffer． Optimal annealing temperature was decided by different primers. 12 primers with stable amplifi-
cation and rich polymorphism for ISSR were selected． This study laid the foundation for the analysis of diversity and group structure by
using ISSR technique for Fusarium oxysporum Schl． in the future．
Key words: Fusarium oxysporum Schl． ISSR Orthogonal design Reaction system Optimization Primer selection
收稿日期:2010-12-21
基金项目:国家油用胡麻产业技术体系项目
作者简介:苑琳，女，讲师，博士研究生，研究方向:酶工程;E-mail:yuan0079@ 163． com
通讯作者:路福平，男，教授，博士，研究方向:酶工程;E-mail:lfp@ tust． edu． cn
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schl．)是重要
的植物维管束病原真菌，可以导致多种植株枯死，是
一种世界性的真菌土传病害，在植株的全生育期均
可发生［1］。和其他植物病原菌一样，尖孢镰刀菌存
在着种下分化，可侵染许多植物寄主，具有多种专化
型。枯萎病病原菌是一种极易变异的菌种，会因地
区的不同有很大的致病性差异［2］，我国引起胡麻枯
萎病的主要病原菌是尖孢镰刀菌胡麻专化型，分布
在河北、山西、内蒙古、黑龙江、新疆、甘肃和宁夏，发
生面积广，危害大。为此，研究尖孢镰刀菌胡麻专化
型病菌的生物学特性及其菌种类群的划分非常
重要。
简单序列重复区间(inter-simple sequence re-
peat，ISSR)技术是 Zietkiewiez 等［3］在 1994 年提出
的，是在微卫星分子标记基础上发展起来的一种新
型分子标记技术。ISSR技术具有多态性高、不需预
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
知基因序列、引物序列较长、退火温度较高、重复性
好、安全性高、DNA用量少、成本低、技术要求低、操
作过程更简单等特点［4］，已被广泛用于遗传多样性
分析［5］、遗传图谱构建［6］、品种鉴定［7］和物种种质
资源［8］等研究领域。ISSR 分子标记技术虽已得到
广泛应用，但国内外将其应用于尖孢镰刀菌的报道
很少。Bayraktar 等［9］从土耳其不同地区的鹰嘴豆
病株中分离获得 108 株 Fusarium oxysporun f． sp． ci-
ceris菌株，利用 30 个 RAPD引物和 29 个 ISSR引物
鉴定了 74 种菌株，并对其遗传多样性和种群结构进
行了分析。李蕊倩等［10］建立了不同寄主尖孢镰刀
菌 ISSR反应体系并应用 ISSR分子标记技术对尖孢
镰刀菌的遗传多样性进行分析，为该分子标记技术
在镰刀菌遗传多样性的分析研究等方面的应用提供
了重要的参考。
虽然 ISSR分子标记技术操作简单、稳定性好，
但 ISSR标记技术是基于 PCR 反应的分子标记，易
受多种因素的干扰，其最佳扩增条件在不同物种的
应用中各不相同。目前有关尖孢镰刀菌 ISSR-PCR
反应体系建立的报道较少，因此，建立稳定可靠的
尖孢镰刀菌 ISSR-PCR 反应体系具有重要意义。
为了获得可靠性好、重复性高的结果，本试验采用
正交试验设计方法，对胡麻专化型尖孢镰刀菌
ISSR反应体系进行优化，同时对 PCR 反应的引物
和退火温度进行优化，为进一步利用 ISSR 分子标
记技术研究胡麻专化型尖孢镰刀菌遗传多样性奠
定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 供试菌株 本试验所用菌株分离自采集于
河北省张北县、宁夏回族自治区固原县、新疆维吾尔
族自治区伊犁州胡麻枯萎病病株，采集地点如表 1
所示。纯化的各菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基
(PDA)上 28℃培养 7 d，用牙签刮取菌丝放入 1. 5
mL离心管中置于 － 80℃备用。
1. 1. 2 试剂 Taq 酶、MgCl2、10 × buffer 等 PCR 扩
增所用试剂均购自上海生工生物工程公司，dNTPs、
250 bp ladder Marker 购自宝生物工程(大连)有限
公司。引物采用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布
表 1 供试尖孢镰刀菌菌株及其来源
编号 采集地 编号 采集地
1 宁夏固原西吉县 16 宁夏固原隆德县
2 新疆伊犁昭苏县 17 宁夏固原西吉县
3 宁夏固原西吉县 18 宁夏固原隆德县
4 新疆伊犁昭苏县 19 宁夏固原隆德县
5 新疆伊犁新源县 20 宁夏固原原州区
6 新疆伊犁新源县 21 河北张北东房子
7 新疆伊犁特克斯县 22 河北张北康保
8 新疆伊犁特克斯县 23 河北张北大洪沟
9 新疆伊犁特克斯县 24 河北张北草碾坡
10 新疆伊犁尼勒克县 25 河北张北油篓沟
11 新疆伊犁尼勒克县 26 河北张北病圃
12 新疆伊犁尼勒克县 27 新疆伊犁特克斯县
13 新疆伊犁尼勒克县 28 河北张北病圃
14 宁夏固原西吉县 29 新疆伊犁新源县
15 宁夏固原西吉县 30 新疆伊犁昭苏县
的引物［11］，由上海生工生物工程公司合成。
1. 1. 3 仪器 高速冷冻台式离心机(Sorvall Biofuge
Fresco D-37520 型，德国) ;凝胶成像仪(UVI pro，英
国) ;蛋白核酸分析仪(Beckman DU640 型，美国) ;
PCR仪(Biometra，德国) ;电泳仪(DYY-12 型，北京
六一仪器公司)。
1. 2 方法
1. 2. 1 基因组 DNA的提取 参照 Fernando［12，13］所
述方法并略做改进提取镰刀菌基因组 DNA。具体
步骤:将预冷至 － 80℃的菌丝体放入研钵中，加入液
氮研磨;加入 600 μL TES(100 mmol /L Tris，10
mmol /L EDTA，2% SDS)缓冲液、140 μL 5 mol /L
NaCl、70 μL 10% CTAB 裂解液，混匀，放入 65℃水
浴 30 min。加入 600 μL氯仿异戊醇(24∶ 1) ，混匀，
10 000 r /min 离心 15 min，取上清液，重复该步骤
2 － 3 次。加 80 μL 5 mol /L NaCl 和 1 000 μL 无水
乙醇沉淀 DNA，静置 5 min，13 000 r /min 离心 5
min;弃去上清液，加 200 μL 预冷至 － 20℃的 80%
乙醇洗涤沉淀，13 000 r /min 离心 5 min。风干沉
淀，加入适量无菌 ddH2O(37℃)回溶 DNA。用 1%
琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量，DNA 浓度与纯度
用 DU640 蛋白核酸分析仪进行测定，并将 DNA 浓
602
2011 年第 7 期 苑琳等:胡麻专化型尖孢镰刀菌 ISSR-PCR最佳反应体系的建立
度稀释调整至 20 ng /μL，放入 － 20℃冰箱中贮存
备用。
1. 2. 2 ISSR-PCR扩增反应程序［9］ PCR扩增条件
为 94℃预变性 5 min;94℃变性 30 s，退火 30 s，72℃
延伸 2 min，共 35 个循环;72℃延伸 10 min。ISSR-
PCR扩增产物采用 1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1. 2. 3 ISSR-PCR反应体系正交优化试验设计 采
用 L16(4
5)正交试验设计［14］，对影响 ISSR-PCR 的 5
个主要因素:Taq DNA 聚合酶、Mg2 +、dNTPs、模板
DNA和引物添加量进行 5 因素 4 水平的筛选分析，
共 16个处理(表2，表3)。反应体系总体积为25 μL，
10 × buffer 2. 5 μL，其他成分按照表 3加样，不足体积
用 ddH2O补足至 25 μL。每个处理设 3次重复。
表 2 PCR反应的因素水平
因素
水平(终浓度)
1 2 3 4
Taq酶(U) 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0
Mg2 +(mmol /L) 2. 5 3. 0 3. 5 4. 0
dNTPs(mmol /L) 0. 10 0. 15 0. 20 0. 25
引物(μmol /L) 0. 20 0. 40 0. 60 0. 80
模板 DNA(ng) 20 40 60 80
表 3 L16(4
5)正交试验表
序号
Taq酶
(U)
Mg2 +
(mmol /L)
dNTPs
(mmol /L)
引物
(μmol /L)
模板 DNA
(ng)
1 0. 5 2. 5 0. 10 0. 20 20
2 0. 5 3. 0 0. 15 0. 40 40
3 0. 5 3. 5 0. 20 0. 60 60
4 0. 5 4. 0 0. 25 0. 80 80
5 1. 0 2. 5 0. 15 0. 60 80
6 1. 0 3. 0 0. 10 0. 80 60
7 1. 0 3. 5 0. 25 0. 20 40
8 1. 0 4. 0 0. 20 0. 40 20
9 1. 5 2. 5 0. 20 0. 80 40
10 1. 5 3. 0 0. 25 0. 60 20
11 1. 5 3. 5 0. 10 0. 40 80
12 1. 5 4. 0 0. 15 0. 20 60
13 2. 0 2. 5 0. 25 0. 40 60
14 2. 0 3. 0 0. 20 0. 20 80
15 2. 0 3. 5 0. 15 0. 80 20
16 2. 0 4. 0 0. 10 0. 60 40
2 结果与分析
2. 1 正交优化试验结果的直观分析
按表 3 设计的 16 个处理分别进行 PCR 反应，
将得到的产物进行电泳，结果见图 1。参照何正文
等［15］的方法，对电泳条带的强弱和杂带的多少做
直接分析。不同处理间由于 Taq DNA聚合酶、dNTPs、
引物、Mg2 +和模板 DNA 等因素的浓度组合不同，
因此其扩增结果存在明显差异。体系 1、4、7、13
和 14 只能扩增出较弱的条带，甚至有些组合几乎
扩增不出条带;体系 2、3、5、9、15 和 16 虽然能扩
增出条带，谱带多态性也较高，但谱带强度和主带
较差;体系 10、11 和 12 虽然条带多态性高，但由
于组合中 Mg2 +含量较高，背景弥散;体系 6、8 的扩
增条带数多且清晰，主带明显、背景清晰，特别是
体系 8 扩增效果非常好，因此，试验选取体系 8 为
最优扩增体系。
1 －16．体系 1 －16 PCR产物;M． DNA Marker(250 bp ladder Marker)
图 1 ISSR-PCR反应体系正交优化结果
2. 2 引物的筛选
采用优化后的 PCR 体系，分别以 UBC 公布的
100 条引物对 30 株供试菌株基因组 DNA 进行扩
增，部分结果见图 2。对扩增结果进行比较分析，共
有 12 条引物扩增后条带丰富、清晰，条带间距离均
匀，因此，确定这 12 条引物为胡麻专化型尖孢镰刀
菌 ISSR-PCR扩增引物。
2. 3 退火温度的确定
采用优化后的 PCR反应体系，在 45 － 60℃之间
选取 12 个温度梯度进行 PCR扩增，引物 UBC856 的
扩增结果见图 3。由图 3 可见，退火温度较低时(泳
道 1 － 3) ，非特异性条带较多，扩增特异性差;随着
702
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
退火温度的升高(泳道 4 － 10) ，非特异性条带不断
减少，扩增特异性增强，弥散背景逐渐降低;当退火
温度过高时(泳道 11、12) ，引物与模板的特异性结
合增强，但扩增条带减少，电泳条带较弱，不适合遗
传多样性分析。从整个扩增图谱来看，泳道 7 的扩
增效果最好，条带数量适中，主带较亮，背景清晰，表
明引物 UBC856 的最适退火温度应为 53℃。
1. UBC808;2. UBC809;3. UBC816;4. UBC817;5. UBC821;
6. UBC825;7. UBC828;8. UBC830;9. UBC832;10. UBC835;
11. UBC841;12. UBC847;13. UBC848;14. UBC850;15. UBC851;
16. UBC855;17. UBC856;18. UBC857;19. UBC858;20. UBC859;
21. UBC861;22. UBC862;23. UBC881;24. UBC883;25. UBC884;
26. UBC885;27. UBC887;28. UBC890;29. UBC891;30. UBC895;
M. DNA marker(250 bp ladder Marker)
图 2 不同引物的 PCR扩增结果
1. 45. 0℃;2. 45. 3℃;3. 46. 4℃;4. 48. 0℃;5. 49. 8℃;6． 51. 6℃;
7. 53. 4℃;8. 55. 2℃;9. 56. 9℃;10. 58. 6℃;11. 59. 6℃;
12. 60. 0℃;M． DNA marker(250 bp ladder Marker)
图 3 退火温度对 PCR扩增结果的影响
以同样的方法分别对筛选确定的 12 条引物的
退火温度进行了优化(结果略) ，最终确定了各引物
的最佳退火温度，结果见表 4。
表 4 筛选引物、序列及其退火温度
引物 序列 退火温度(℃)
UBC811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 52
UBC812 GAG AGA GAG AGA GAG AA 52
UBC835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 55
UBC841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC 54
UBC855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT 52
UBC856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA 53
UBC857 ACA CAC ACA CAC ACA CYG 50
UBC862 AGC AGC AGC AGC AGC AGC 52
UBC881 GGG TGG GGT GGG GTG 55
UBC884 HBH AGA GAG AGA GAG AG 52
UBC891 HVH TGT GTG TGT GTG TG 54
UBC895 AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC 52
B = T /G /C，H = A /T /C，Y = T /C，R = A /G，V = G /A /C
2. 4 ISSR-PCR反应体系的稳定性
采用优化确定的 PCR 扩增体系，以确定的 12
条引物对供试的 30 株胡麻专化型尖孢镰刀菌菌株
进行扩增体系稳定性检测，部分结果见图 4 和图 5。
由图 4 和图 5 可见，该体系对于不同的胡麻专化型
尖孢镰刀菌菌株基因组 DNA 和不同引物的扩增效
果均比较稳定，扩增条带清晰，完全可以应用于该致
病菌遗传多样性分析的研究。
1 － 30． 菌株 1 － 30 PCR扩增产物;M． DNA marker(250
bp ladder Marker)
图 4 引物 UBC812 扩增结果
802
2011 年第 7 期 苑琳等:胡麻专化型尖孢镰刀菌 ISSR-PCR最佳反应体系的建立
1 － 30． 菌株 1 － 30 PCR扩增产物;M． DNA marker(250
bp ladder Marker)
图 5 引物 UBC855 扩增结果
3 结论
ISSR 分子标记为显性标记，呈孟德尔式遗传，
具有较好的稳定性和多态性，DNA 用量少、成本低。
ISSR技术是基于 PCR反应的分子标记，反应条件的
差异对 ISSR扩增结果会产生一定的影响。其中引
物浓度、Mg2 +浓度、模板浓度与纯度、引物的退火温
度等是 PCR 扩增的几个主要反应参数。申洁等［16］
认为各因素对 PCR 试验的影响从大到小依次为
Mg2 +、dNTPs、Taq 酶、引物浓度。而吴根土等［17］认
为引物浓度对 PCR反应结果影响最大，同时体系中
各因素之间相互作用，任何一种因素发生变化都会
影响扩增结果。本试验采用正交设计法试验，最终
建立了胡麻专化型尖孢镰刀菌 ISSR-PCR 扩增反应
优化体系，可以避免单因子试验结果的不足。结果
显示，胡麻专化型尖孢镰刀菌最适宜的扩增条件为
25 μL PCR 反应体系中含有 2. 5 μL 10 × buffer、20
ng模板、1 U Taq 酶、0. 4 μmol /L 引物、0. 2 mmol /L
dNTPs和 4. 0 mmol /L Mg2 +。本试验确定的尖孢镰
刀菌 ISSR-PCR 反应条件，可以很好地保持扩增结
果的可重复性与稳定性，为今后利用 ISSR-PCR 技
术对尖孢镰刀菌种群结构研究提供了可靠依据。
参 考 文 献
［1］郝晓娟，刘波，谢关林．植物枯萎病生物防治研究进展．中国农学
通报，2005，21(7) :319-322．
［2］王海平，李心文，李景欣，等．胡麻枯萎病病原尖孢镰刀菌生态生
物型的划分研究．华北农学报，2004，19(2) :115-118．
［3］Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D． Genome fingerprinting by sim-
ple sequence repeat(SSR)anchored polymerase chain reaction am-
plification． Genomics，1994，20(2) :176-183．
［4］陈龙，王家良，杨贤松． ISSR分子标记及其在植物分子生物学中
的应用．种子，2007，26(10) :49-52．
［5］李挺丹，彭世文，王宗华，等．应用 ISSR-PCR 分析福建水稻纹枯
菌的遗传多样性．植物病理学报，2010，40(2) :186-194．
［6］宋培玲，杨家荣，毛岚．正交设计优化棉花黄萎病菌 ISSR-PCR反
应体系．西北农业学报，2009，18(1) :194-197．
［7］Nagaoka T，Ogihara Y． Applicability of Inter-simple sequence repeat
markers in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP
and RAPD markers． Theor App Genet，1997，94:597-602．
［8］唐丽．湖南主要南天竹种质资源遗传多样性的 ISSR 分析． 北方
园艺，2009，(1) :166-170．
［9］Bayraktar H，Dolar FS，Maden S． Use of RAPD and ISSR markers in
detection of genetic variation and population structure among Fusari-
um oxysporum f． sp． ciceris isolates on chickpea in Turkey． Phytopa-
thology，2008，146-154．
［10］李蕊倩，何瑞，张跃兵，等．镰刀菌 ISSR 标记体系的建立及遗
传多样性分析．中国农业科学，2009，42(9) :3139-3146．
［11］周延青． DNA分子标记技术在植物研究中的应用［M］． 北京:
化学工业出版社，2005，143-161．
［12］Fernando WGD，Zhang JX，et al． Genetic diversity of Gibberella zeae
isolates from Manitoba． Plant Disease，2006，90:1337-1342．
［13］Guo XW，Fernando WGD，Seow-Brock HY． Population structure，
chemotype diversity，and potential chemotype shifting of Fusarium
graminearum in wheat fields of Manitoba． Plant Disease，2008，92
(5) :756-762．
［14］盖钧镒．试验统计方法［M］．北京:中国农业出版社，2000．
［15］何正文，刘运生，陈立华，等．正交设计直观分析法优化 PCR条
件．湖南医科大学学报，1998，23(4) :403-404．
［16］申洁，侯思宇，孙朝霞，等．正交优化枣树 ISSR-PCR反应体系的
研究．华北农学报，2010，25(2) :116-120．
［17］吴根土，师桂英，徐秉良，等．裸仁美洲南瓜 ISSR-PCR反应体系
的正交优化．西北农业学报，2010，19(4) :155-159．
(责任编辑 李楠)
902