全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
去垢剂在膜蛋白研究中的应用
谢浩 1 陈艳可 2 孙恩杰 1 王宏炜2
( 1 武汉理工大学生物科学与技术系,武汉 430070; 2 武汉理工大学资源与环境工程学院,武汉 430070)
摘 要: 去垢剂是同时具有亲水极性基团和疏水非极性基团的双极性分子, 能够使脂膜解体释放膜蛋白, 并在溶液中
为去膜状态下的膜蛋白提供疏水环境,维持和保护膜蛋白的疏水跨膜结构 ,在膜蛋白的结构和功能研究中有重要的意义。去
垢剂的双极性和理化特性,如临界胶束浓度能够极大影响去垢剂和膜蛋白间的相互作用。在膜蛋白研究中, 需要充分利用去
垢剂的结构和特性: 一方面,需要利用去垢剂代替脂质分子支持和稳定去膜状态下膜蛋白的结构和功能;另一方面, 需要控制
去垢剂和膜蛋白的相互作用,以满足膜蛋白结构研究如蛋白质结晶试验的要求。简要介绍了去垢剂在膜蛋白研究中的最新
应用进展, 涉及去垢剂在膜蛋白离体表达、分离和纯化、以及结构研究中的应用。
关键词: 去垢剂 膜蛋白 离体表达 纯化 蛋白质结构
Applications of Detergents inM embrane Proteins Research
X ieH ao
1
Chen Yanke
2
Sun En jie
1
W angH ongwe i
2
(
1
D epartment of B io logical Science and Biotechno logy, Wuhan University of T echnology, W uhan 430070;
2
Schoo l of R esources and
EnvironmentalEngineering, W uhan University of T echnology, Wuhan 430070)
Abstrac:t De tergents are amphiphilicm o lecules and able to so lub ilisem em brane proteins from lip id m em branes and prov ide hy
drophobic pro tection fo r m embrane pro teins in hydroph ilic so lutions. Resu ltant dete rgentso lubilized m em brane pro te ins can m aintain
the ir native transm embrane structure in lip idfree env ironments. The re fo re, dete rgents a re va luable in struc tura l and functional charac
ter iza tions ofm embrane prote ins. In terac tions between detergents and membrane prote ins are affec ted by the amph iphilic features tog eth
e rw ith the physica l and the chem ical proper ties of de tergents, such as criticalM ice lle concentration. The resea rch on membrane prote ins
requ ires investig ators to m ake fu ll use of these special cha racte ristics o f de tergents. On the one hand, one can use dete rgents instead of
lip id m o lecules to stab ilize and m a inta in the structure and activ ity o f lip idfree membrane proteins; on the other hand, one needs to con
trol interactions betw een de tergents and m em brane prote ins for structura l investiga tions on m embrane pro te ins us ing techniques such as
prote in crysta llization. In th is article, the la test bib liography w ere rev iew ed re lated to applications o f deterg ents to in vitro expression,
purifica tion, and structura l investig ation of m emb rane prote ins.
Key words: De tergents M embrane pro te ins in vitro expression Pur ification P rote in structure
收稿日期: 20091130
基金项目:国家自然科学基金 ( 30600004 ),教育部留学回国人员科研启动基金资助项目
作者简介:谢浩,博士,教授,研究方向:生物化学与分子生物学; Em ai:l drx iehao@ 126. com
在基因组中编码膜蛋白的基因约占基因总数的
三分之一,使膜蛋白成为功能和结构蛋白质组学研
究的一个重要的知识增长点。膜蛋白的显著特点为
具有非极性的疏水结构域,定位于脂膜之上时,通过
跨膜区或者共价键与磷脂双分子层相连, 部分或全
部嵌入膜内, 有的则是跨膜分布, 具有多个跨膜螺
旋。膜脂质分子的脂肪链为维持和稳定膜蛋白的跨
膜结构提供了必要的疏水环境。
去垢剂 ( detergent), 又称为表面活性剂,是一类
同时具有亲水极性基团和疏水非极性基团的双极性
分子,可以利用薄层色谱法或气相色谱法进行定量
分析 [ 1, 2]。在膜蛋白的研究过程中, 可以利用去垢
剂使脂膜解体释放膜蛋白, 并维持去膜状态下膜蛋
白结构和功能的稳定性。去垢剂在溶液中的状态和
行为同去垢剂的浓度、纯度、非极性疏水基团、溶液
的 pH和离子强度、温度、以及溶液中其它有机物有
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
关。在溶液中去垢剂的存在形式与其浓度和环境温
度有关,能够单体、晶体、胶束 (胶囊 ) 3种形式存
在 [ 3]。以胶束形式存在时, 去垢剂分子的亲水基团
同水分子以氢键相互作用, 疏水链因疏水作用而聚
集,从而几个去垢剂分子形成外部亲水,内部疏水的
胶束 (胶囊 )结构溶于水中。形成一个去垢剂胶束
的分子数称为此去垢剂的聚集数 ( aggregation num
ber) ,其总分子量为胶束分子量 (即去垢剂的分子量
与聚集数的乘积 )。去垢剂形成胶束的最低浓度称为
临界胶束浓度 ( crit ical m ice lle concentration, CMC )。
低于临界胶束浓度时,去垢剂以单体分子形式存在。
当温度降低,去垢剂分子会从溶液析出而形成晶体。
当温度升高,去垢剂分子会从晶体进入溶液。在一
定温度时,如果进入溶液的去垢剂分子能够而形成
胶束, 此时的温度称为临界胶束温度 ( criticalm icelle
temperature, CMT)。在特定温度和特定浓度时, 去
垢剂的单体、晶体、胶束 (胶囊 ) 3种形式同时存在并
处于平衡状态, 此时的温度称为克氏温度 ( K rafft
temperature)。
将简要介绍去垢剂的种类和特点及其在膜蛋白
研究中的应用进展, 主要涉及去垢剂在膜蛋白离体
表达、分离和纯化、以及结构研究中的应用。
1 去垢剂的种类及特点
根据去垢剂极性基团的特点, 一般分为离子型
去垢剂 ( ion ic detergents)、非离子型去垢剂 ( nonion
ic detergents)、以及两性离子型去垢剂 ( zw itterion ic
detergents)
[ 3, 4]
(表 1)。离子型去垢剂含有带电荷
的极性基团,又可以分为阳离子去垢剂和阴离子去
垢剂, 容易受到溶液离子成分的影响,可能会与离子
交换柱相互作用, 干扰蛋白质的纯化。所以利用离
子交换柱纯化膜蛋白时, 需要使用非离子型或者两
性离子型的去垢剂。非离子型去垢剂含有不带电荷
的亲水极性基团,基本不受溶液中离子成分影响,能
够破坏脂质分子间以及脂质分子与膜蛋白间的相互
作用, 但是不会破坏蛋白质与蛋白质间的相互作用,
因而常用于膜蛋白的活性分离和纯化。两性离子型
去垢剂同时具有离子型和非离子型去垢剂的一些特
点:一方面, 两性离子型去垢剂的极性基团不带电
荷,不会同离子交换介质相互作用; 另一方面, 两性
离子型去垢剂又能破坏蛋白质与蛋白质间的相互作
用。此外,研究人员还发展了脂肽类去垢剂 ( lipopep
tide detergents, LPDs),其极性端为多肽, 在水溶液中
形成 a lpha螺旋, 为非极性端的脂肪链提供支架, 形
成环状胶束结构, 以类似于膜脂的方式围绕游离膜
蛋白 [ 5- 7]。
表 1 几种去垢剂的基本特征 [ 35]
去垢剂种类 分子量 CMC
( mM )
聚集数 胶束分子量
非离子型去垢剂
DDM ( nDodecylbetaDm alto
sid e)
511 01- 06 98 50 000
Triton X100 625 02- 09 100- 155 80 000
Triton X114 537 035
NP40 005- 03
OG ( nOctylb etaDglu copyr
anos ide)
292 20- 25 84 25 000
C12E8 539 0110 123 66 000
nO ctylbetaDth iog lucopyr
anos ide
308 9
离子型去垢剂
SDS ( Sod ium ndodecy l su l
fate)
288 7- 10 62 18 000
两性离子型去垢剂
CHAPS 615 6- 10 4- 14 6 150
LDAO ( Lauryld im ethylam in e
oxid e)
229 2 69- 73
脂肽类去垢剂
LPD12 2 839 < 0001 81 23 100
当去垢剂与含有膜蛋白的脂膜作用时, 通过
竞争和削弱膜蛋白与膜脂质分子间的疏水结合,
使膜蛋白从膜脂中释放出来。对膜蛋白细胞色素
c的研究表明, 在膜蛋白表面存在许多脂质分子特
异结合的位点 [ 8] , 去垢剂分子可以取代脂质分子
结合在膜蛋白分子表面的这些位点, 维持膜蛋白
的疏水结构。去垢剂对膜蛋白的增溶效率与去垢
剂的结构和临界胶束浓度有关, 可以通过改变去
垢剂的种类和浓度来优化。图 1显示了几种去垢
剂在不同浓度下对大肠杆菌核苷酸转运蛋白
NupC的增溶效率。在一定浓度下, DDM 和 LDAO
对 NupC的增溶效率最高, 因而, 在亲和纯化试验
中可以采用 DDM和 LDAO来溶解 NupC。当高于
临界胶束浓度时, 去垢剂分子能够形成围绕膜蛋
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2010年第 2期 谢浩等:去垢剂在膜蛋白研究中的应用
白疏水部位的胶束结构, 使膜蛋白保持原有构象,
形成溶于水的去垢剂 膜蛋白复合物。
用不同浓度的去垢剂处理含有 NupC的大肠杆菌细胞膜
并进行电泳分析,通过对电泳凝胶的光密度分析计算
NupC的增溶百分比。 DDM. nDodecylDm altoside;
LDAO. Lau ryld im ethy lam ine oxide; TX100. T riton X100;
OG. nO ctylDglu copyranosid e
图 1 几种去垢剂在不同浓度下对大肠杆菌核
苷酸转运蛋白 NupC的增溶效率
选择去垢剂用于膜蛋白研究时, 不仅需要提
高去垢剂的增溶效率, 还需要考虑将去垢剂浓度
降低到低于其临界胶束浓度, 使膜蛋白脱离去垢
剂的作用, 重新组装到脂膜上以进行结构和功能
研究。常用的去除去垢剂或降低去垢剂浓度方法
有稀释法、凝胶过滤法、透析法、离子交换层析法、
疏水吸附层析法等。去除去垢剂的效率和难度受
临界胶束浓度和胶束分子量影响: 去垢剂的临界
胶束浓度越高,去垢剂疏水结合能力越弱; 去垢剂
胶束分子量越低, 去垢剂胶束体积越小。这两类
去垢剂都较容易去除。
去垢剂能够同很多染料相互作用,例如很多去
垢剂的疏水链同考马斯亮蓝 G250结合而呈现稳定
的蓝色。因而,考马斯亮蓝 G250会对溶液中存在
去垢剂和膜蛋白同时染色, 从而干扰基于染料对蛋
白质染色的蛋白质定量方法如 Bradford法。因此,
对于膜蛋白的定量试验,一方面,可以将干扰严重的
去垢剂换成干扰小的去垢剂;另一方面,可以在蛋白
质定量过程中去除去垢剂, 以避免去垢剂对定量结
果的干扰 [ 9]。
2 去垢剂在膜蛋白离体表达中的应用
膜蛋白虽然种类多,但表达量低,仅占细胞蛋白
质总量的极小部分, 成为膜蛋白研究的瓶颈之一。
异源活体高效表达系统能够改善和提高膜蛋白的表
达, 但是表达效率受很多因素影响。例如,所表达的
膜蛋白对宿主细胞有毒性作用、缺少有效的折叠机
制导致形成包涵体、宿主细胞蛋白酶的降解作用等。
这时可以考虑利用离体系统表达膜蛋白 [ 10- 15]。离
体表达系统还能经济有效地标记目标蛋白, 满足一
些特殊研究的需要,如 NMR研究 [ 10, 16]。
直接利用离体系统表达膜蛋白的研究表明, 高
度疏水的膜蛋白在表达后以聚集状态存在, 但是与
利用活体表达系统,如大肠杆菌所得到的位于包涵
体中的蛋白质有明显不同的特性 [ 16]。对于包涵体
中的蛋白质,需要利用蛋白质变性剂尿素或盐酸胍
处理,破坏蛋白质结构中氢键、盐键、疏水相互作用、
范德华力等次级键,使多肽伸展, 增加非极性分子包
括氨基酸侧链的溶解度,使蛋白质溶解,然后通过透
析等方式除去变性剂,才有可能使蛋白质重新折叠
并恢复到天然构象。而利用离体表达系统得到的膜
蛋白聚集体,可以较容易地利用温和的去垢剂溶解
后直接得到具有适当折叠结构和活性的膜蛋白。例
如, K lamm t等 [ 10]利用大肠杆菌离体表达系统成功
地表达了以聚集状态存在的多药转运蛋白 EmrE、
SugE、TehA和半胱氨酸转运蛋白 Y fiK。加入去垢剂
后大多数膜蛋白可以溶解, 经 CD光谱检测显示其
二级结构以 alpha螺旋为主, 而且溶解的 EmrE、
SugE和 TehA能够被重组到人工脂膜上。对 EmrE
重组膜蛋白脂质体的转运活性检测表明,离体表达
的 Em rE具有转运活性。
另外,一些研究者在离体系统中为膜蛋白的表达
提供非极性的稳定因素如脂质分子或去垢剂,也得到
了具有适当折叠结构和活性的目标膜蛋白 [ 12, 15, 17, 18 ]。
在离体表达系统加入去垢剂, 可以与所合成的膜蛋
白通过非极性相互作用, 形成含有膜蛋白的胶束
(胶囊 )结构, 不仅能够维持和稳定膜蛋白疏水结
构, 而且不用为膜蛋白的合成提供额外的运输和插
入脂膜的机制, 从而显著提高膜蛋白的合成效率。
例如,利用含有去垢剂的离体表达系统所合成的机
械敏感性通道蛋白 M scL, 可以直接用于构建重组膜
蛋白脂质体,并具有同活体表达的膜蛋白相似的活
性 [ 19]。大多数去垢剂的临界胶束浓度很低, 只需要
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
很低的浓度就能达到稳定膜蛋白所需要的临界胶束
浓度。但是一些去垢剂如 OG或 CHAPS具有较高
的临界胶束浓度,必须在离体表达系统中加入高浓
度的去垢剂才能达到其临界胶束浓度, 从而有可能
影响离体表达系统中其它成分的活性, 抑制蛋白质
的合成 [ 20]。
3 去垢剂在膜蛋白分离和纯化中的应用
在膜蛋白质组学研究中,可以利用去垢剂将膜
蛋白从细胞膜上溶解, 经过处理后用于质谱分析。
例如, N agaraj等 [ 21]分别利用去垢剂 T riton X100、
CHAPS、或 SDS将鼠的组织细胞膜蛋白溶解并结合
于层析柱,将去垢剂交换成尿素后再利用蛋白酶消
化膜蛋白,通过对酶切产物的质谱分析,可以识别出
数百种膜蛋白。基于去垢剂 Triton X114在不同温
度下的溶解特性,研究人员还建立了双相萃取技术
( tw o phase part ition ing )分离膜蛋白用于蛋白质组学
分析, 其原理为室温下溶解于水的 T riton X114在
温度升至 30! 以上时会从水相分离, 而与去垢剂结
合的膜蛋白会一起从水相分离出来。利用基于
Triton X114的双相萃取技术, Donoghue等 [ 22, 23]分
别分离了人心脏细胞膜蛋白组和酵母线粒体膜蛋白
组,并进行了相应的质谱学研究。
对于利用活体系统或离体系统表达的特定膜蛋
白的分离和纯化,去垢剂的选择也是极其重要的环
节。利用活体表达系统, 重组膜蛋白常会表达于质
膜上或者包涵体内。膜蛋白表达于质膜上时的纯化
技术较为成熟,例如, 对于含有融合亲和标签的重组
膜蛋白的纯化,在使用了合适的去垢剂将膜蛋白从
质膜上溶解后,就可以利用亲和层析柱或亲和介质
吸附游离的膜蛋白来进行亲和纯化试验, 纯化步骤
同可溶蛋白质的亲和纯化步骤基本相似, 但是需要
溶液中的去垢剂保持在临界胶束浓度之上, 以维持
和稳定膜蛋白的结构。对于利用离体系统表达的膜
蛋白, 如果体系中不含脂质分子或去垢剂,膜蛋白会
以聚集体形式存在。由于膜蛋白在不同去垢剂中的
增溶效率不同,在纯化目标膜蛋白时,利用不同的去
垢剂预处理蛋白聚集体, 可以在一定程度上去除和
降低杂蛋白的污染 [ 16]。膜蛋白分离和纯化效果有
时也会受到一些去垢剂的影响,例如含有麦芽糖结
合蛋白 ( maltose bing protein, MBP)融合标签的重组
膜蛋白的亲和纯化过程中, 含有麦芽糖基的去垢剂
如 DDM会与亲和介质竞争 MBP蛋白上的麦芽糖结
合位点,降低纯化效率。另外,一些去垢剂也会影响
膜蛋白的功能活性。Qu ick等 [ 24]在对转运蛋白 Tyt1
的研究中发现,不同去垢剂能够显著影响 Tyt1的活
性: 对于具有麦芽吡喃糖苷 (m altopyranoside)极性基
团的不同去垢剂而言, Tyt1的活性与去垢剂的非极
性碳氢链长度相关;而其它去垢剂如 LDAO、C12E8、
或具有吡喃葡萄糖苷 ( g lucopy ranoside)极性基团的
去垢剂能够抑制 Ty t1的活性; T riton X100是唯一
不含有麦芽吡喃糖苷极性基团并能维持一定程度
Tyt1活性的去垢剂。
异源膜蛋白表达于包涵体中时, 可以避免宿主
蛋白酶的降解作用, 容易达到较高的表达量。纯化
后的蛋白质重新折叠恢复原有构象的过程涉及多种
影响蛋白质结构稳定的因素, 如去垢剂和膜脂的成
分和比例、缓冲液离子强度、温度、作用时间,关键在
于如何利用去垢剂和膜脂分子去处理彻底变性的膜
蛋白,使其重新折叠恢复构象并重组到脂膜中。包
涵体中膜蛋白的复性步骤通常为用合适去垢剂将膜
蛋白从包涵体中溶解;加入一定比例的去垢剂 /脂质
分子混合物以替换原有的去垢剂;移出所有去垢剂,
使膜蛋白重组到脂膜中并恢复构象 [ 25]。利用这种
复性策略,多种膜蛋白已从大肠杆菌所表达的包涵
体中纯化并重新折叠恢复原有构象。例如来源于
H IV病毒的嵌膜蛋白 Vpu蛋白质从包涵体中纯化
后, 重组到脂膜上能够显示离子通道活性 [ 26] ; 表达
于包涵体的植物叶绿体的通道蛋白 Toc75和光吸收
复合体 II及流感病毒的质子通道 M2蛋白质在不同
去垢剂的作用下, 也成功地重新折叠并恢复构
象 [ 27, 28]。一些生物公司提供的膜蛋白复性试剂盒
也能用来使表达于包涵体的膜蛋白在纯化后恢复构
象, 例如, 美国 ProFo ldin公司开发的膜蛋白复性
试剂盒,提供了两种方式 (柱结合方式和稀释方式 )
和 20种条件来帮助研究者选择膜蛋白最佳复性
条件 [ 29]。
4 去垢剂在膜蛋白结构研究中的应用
膜蛋白的结构研究是最具挑战性的研究课题之
一。根据所表达和纯化的膜蛋白的生理状态和存在
形式,可以有不同的策略和方法研究膜蛋白的结构
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2010年第 2期 谢浩等:去垢剂在膜蛋白研究中的应用
和功能。对于纯化后重新组装到脂膜上的膜蛋白的
结构研究,去垢剂的作用仅仅体现在纯化和重组过
程中。而对处于溶液中被去垢剂环绕的游离膜蛋白
的结构研究,需要充分利用去垢剂维持膜蛋白的溶
解状态,使膜蛋白分子之间保持相互分离和独立。
否则, 膜蛋白之间会由于相互之间的疏水作用或其
它性质的相互作用发生聚集,形成多聚体或发生沉
淀,影响溶液中膜蛋白分子的均一性,妨碍对膜蛋白
的结构和功能分析。R igos等 [ 30]的研究表明, 去垢
剂 C12E8的浓度能够明显影响膜蛋白复合体钠钾
ATP酶的结构和功能活性。在低于去垢剂临界胶束
浓度时,随着去垢剂浓度的升高, 钠钾 ATP酶的功
能活性以及膜蛋白二级结构会受到影响, 表明去垢
剂随浓度升高逐步破坏钠钾 ATP酶各亚基之间的
结合。当去垢剂高于临界胶束浓度时, 钠钾 ATP酶
失去活性,同时膜蛋白二级结构也不再发生变化,表
明钠钾 ATP酶各亚基发生彻底解离, 在去垢剂作用
下形成独立的游离蛋白质分子。Vo igt等 [ 31]对聚光
复合体 II的研究也表明, 只有去垢剂达到临界胶束
浓度的 10倍以上时,才有可能使溶液中膜蛋白保持
稳定的结构。
在利用 NMR技术研究蛋白质三维结构时, 尤
其需要维持体系中膜蛋白相互独立和游离的单体状
态,此时要求体系中去垢剂高于临界胶束浓度,促使
去垢剂形成围绕膜蛋白单体的胶束结构, 否者溶液
中膜蛋白单体会相互作用发生沉淀或者形成同源多
聚体, 影响 NMR分析效果 [ 4]。许多利用 NMR技术
对膜蛋白结构的研究中都使用了较高浓度的去垢
剂,以保证体系中膜蛋白单体的分子均一性 [ 32- 34 ]。
另外, 一些研究者则充分利用去垢剂的双极性来维
持膜蛋白结构在研究过程中的稳定性。他们将纯化
后的膜蛋白置于疏水性有机溶剂中, 利用去垢剂的
亲水基团环绕在膜蛋白的亲水部位周围并与其相互
作用, 去垢剂的疏水基团则朝外,形成翻转的胶束结
构,从而保护和维持疏水环境中膜蛋白的亲水结构,
有机溶剂中的溶剂分子则围绕并维持膜蛋白的疏水
结构。利用这种去垢剂翻转胶束策略, K ie lec等 [ 35]
成功地获取了钾离子通道蛋白 K csA在有机溶剂中
NMR谱图,并进行了结构解析。
膜蛋白结构研究的另一种策略是获取膜蛋白二
维晶体或三维晶体,再利用电子显微镜技术或 X射
线晶体衍射技术来计算和分析其结构。蛋白质晶体
的形成依赖于蛋白质分子之间的亲水相互作用。可
溶蛋白具有较大的亲水表面, 在溶液中通过相互作
用形成晶体的可能性较大。多数膜蛋白只具有相对
较小的亲水区域, 而且纯化后膜蛋白的疏水表面被
去垢剂所环绕,不利于膜蛋白亲水相互作用而形成
晶体。因而必须采取一定的策略, 如扩大和延伸膜
蛋白的亲水区域,在稳定膜蛋白结构的同时,降低去
垢剂的影响。
膜蛋白二维结晶试验的实质是控制膜蛋白重
新组装到脂膜的过程, 使膜蛋白有序排列形成二
维晶体。在重组结晶试验过程中, 一方面需要利
用去垢剂稳定和维持目标膜蛋白结构; 另一方面
需要利用去垢剂使脂质分子去稳定, 容易同膜蛋
白相互作用。然后通过逐步去除体系中的去垢
剂,使脂质分子与膜蛋白分子发生重组而形成膜
蛋白二维晶体。二维结晶过程中需要优化的试验
条件包括脂质分子 /去垢剂 /膜蛋白的比例、去垢
剂及脂质分子种类、缓冲液成分、温度等 [ 36 - 38 ]。
就去垢剂而言, 可以改变去垢剂的种类和改善去
除去垢剂的方法来提高膜蛋白二维晶体的形成效
率和质量。例如, 去垢剂 nO cty lbetaDth iog luco
py ranoside不仅能够提高膜蛋白形成二维晶体的效
率,还能提高膜蛋白二维晶体的尺寸 [ 39]。膜蛋白
二维结晶中去除去垢剂的策略主要有透析法和吸
收法。利用透析法去除去垢剂耗时比较长, 如果
在透析过程中能够避免膜蛋白发生沉淀、降解、或
者微生物污染等意外事件, 可以获得较好的结果,
V ink等 [ 40]甚至建立了利用透析法获取膜蛋白二
维结晶的高通量技术。利用吸收法能够在较短时
间内去除去垢剂, 可以克服透析法耗时过长的不
足,降低结晶过程中的风险。例如, 利用 B ioBeads
或甲基 beta环状糊精吸附体系中的去垢剂, 可以
获得用于结构分析的膜蛋白二维晶体 [ 41 - 43 ]。
膜蛋白的三维结晶试验同可溶蛋白基本相同,
只是在结晶过程中必须考虑去垢剂的影响, 通过控
制和减少去垢剂与膜蛋白的相互作用,在一定温度
和试验条件下,使膜蛋白分子亲水区域之间能够发
生相互作用,形成有序的三维膜蛋白晶体。膜蛋白
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
晶体中暴露于亲水环境中的膜蛋白疏水区域, 仍然
需要合适的去垢剂维持和稳定其结构, 并保证膜蛋
白分子之间不会因为相互的疏水作用而发生沉淀。
因此, 膜蛋白三维晶体生长条件的筛选,不仅包括对
沉淀剂、盐、缓冲液体系、有机溶剂、以及各种添加剂
的筛选, 还包括对各种去垢剂的筛选 [ 7]。例如,
Screpanti等 [ 44]对膜蛋白 N haA的研究, 他们将膜蛋
白溶于不同的去垢剂进行结晶试验, 获得了膜蛋白
晶体; 而 Sh im izu等 [ 45]则在膜蛋白琥珀酸泛醌氧化
还原酶结晶试验中, 利用不同去垢剂作为结晶添加
剂,改善膜蛋白分子间的相互作用,从而获得膜蛋白
晶体。在膜蛋白结晶试验中,去垢剂在稳定膜蛋白
的结构同时,也在一定程度上妨碍膜蛋白相互作用
而形成晶体。Li等 [ 46]利用甲基beta环状糊精吸附
体系中的去垢剂,通过控制和克服去垢剂的影响,也
获得了膜蛋白晶体。
5 小结
去垢剂具有双极性, 能为去膜状态的膜蛋白
提供疏水保护环境,在膜蛋白的离体表达、分离纯
化、以及结构研究中有着重要的作用。去垢剂的
主要理化性质如临界胶束浓度、亲水基团和疏水
基团性质等, 能够影响所溶解的膜蛋白的结构和
功能,因此必须根据试验目的选择合适的去垢剂。
对于膜蛋白的离体表达试验而言, 在利用去垢剂
溶解和提高膜蛋白的表达效率的同时, 需要避免
去垢剂抑制离体表达系统中其它成分的活性。值
得注意的是, 一些溶解性能较弱的去垢剂对位于
细胞膜上的膜蛋白的增溶效率较低, 不能用于活
体表达的膜蛋白的分离纯化, 却能够用于维持离
体表达膜蛋白的结构, 并且与溶解性能强的去垢
剂相比,抑制离体表达系统中其它活性成分的可
能性较低, 因而在膜蛋白的离体表达中有着特殊
的意义。对于膜蛋白的分离和表达实验而言, 必
须选择增溶效率高的去垢剂, 同时又要避免去垢
剂影响纯化及结构功能研究, 并在纯化过程中保
持去垢剂高于临界胶束浓度, 形成围绕和保护膜
蛋白的胶束结构。对于膜蛋白的结构研究而言,
一方面,需要充分利用去垢剂保持溶液中膜蛋白
单体分子的存在和均一性, 避免膜蛋白沉淀和多
聚体形成, 利于应用 NMR技术研究膜蛋白结构;
另一方面, 需要通过控制去垢剂和膜蛋白的相互
作用, 促使膜蛋白之间或者膜蛋白与脂质分子间
相互作用,形成二维或三维晶体, 利于应用电子显
微镜技术或 X射线晶体衍射技术研究膜蛋白结
构。随着新技术例如 NMR研究中的去垢剂翻转
胶束策略的应用 [ 35] , 以及新型去垢剂如脂肽类去
垢剂的出现 [ 7 ] , 去垢剂必将在膜蛋白研究中发挥
更为重要的作用。
参 考 文 献
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科学出版社新书
中国特有金线 属鱼类 物种多样性、
洞穴适应、系统演化和动物地理
赵亚辉 张春光 著
9787030258137 95. 00 2009年 12月 出版
内容简介: 本书记述了中国硬骨鱼纲鲤形目鲤科金线鲃属鱼类的物种多样性、洞穴适应
性、系统演化和动物地理,按总论和各论两个部分论述。总论部分讨论了洞穴鱼类的概念、
多样性和相关研究, 金线鲃属鱼类研究的回顾与展望, 形态与适应, 分类和物种多样性,分布
格局, 种间关系和系统发生,物种分演机制、演化过程和分布格局的形成, 生物学特性及资源
保护等; 各论部分对已知种进行了分类学厘定, 共记述了 49种, 每种均含同物异名、形态描
述、形态特征图和分布图。书后附有参考文献。本书是研究中国特有属 金线鲃属鱼类
的专著, 可供国内外鱼类学、水产学专家及水产工作者、环境保护和渔业监理人员、水产系统
大专院校以及综合性大学生物学专业师生参考使用。
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