全 文 ：收稿日期:2015-11-25; 修订日期:2016-05-15
基金项目:贵州省科技合作计划基金(黔科合 LH［2015］7417 号);
高等学校特色专业建设点(［2010］15 号) ;
贵州省科技计划课题(黔科合 J字［2014］2027 号);
贵州省贵阳市科技计划项目(筑科合同［20141001］48 号);
贵州省卫生计生委科学技术基金(gzwjkj2015-1-003);
贵州省社会发展科技攻关项目(黔科合 LG［2012］054 号)
作者简介:何 芸(1989-)，女(汉族)，贵州长顺人，贵阳医科大学检验技
师，学士学位，主要从事中药抗菌机制研究工作．
* 通讯作者简介:莫 非(1968-)，女(汉族)，贵州贵阳人，贵阳医科大学
教授，硕士学位，主要从事中药抗菌机制研究工作．
苗药头花蓼对幽门螺杆菌外膜蛋白
及 omp8、omp32 基因的影响
何 芸，莫 非* ，张 姝，吴 琼，赵书琴，江明礼，罗昭逊，张梦微，李 寅
(贵州医科大学，贵州 贵阳 550004)
摘要:目的 通过观察苗药头花蓼作用前后的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H． pylori)外膜蛋白(outer membrane protein，
omp)及 omp8、omp32 基因表达水平的变化，探讨头花蓼抑制 H． pylori 生长活性的机制。方法 应用 Western blot 及 Ｒeal
time PCＲ技术检测苗药头花蓼作用前后，H． pylori外膜蛋白及 omp8、omp32 mＲNA表达量的变化。结果 Western blot结果
显示，苗药头花蓼作用后 omp较对照组升高，具有统计学差异(P ＜ 0． 05);Ｒeal time PCＲ 结果显示，H． pylori 在苗药头花
蓼作用后其 omp8、omp32 mＲNA表达量分别较对照组上调 2． 339 倍和 2． 597 倍，具有统计学意义(P ＜ 0． 05)。结论 苗药
头花蓼通过上调 H． pylori外膜蛋白及 omp8、omp32 mＲNA水平，引起外膜通透性改变，从而发挥抗菌作用。
关键词:头花蓼; 幽门螺杆菌; 外膜蛋白; omp8; omp32
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2016． 08． 023
中图分类号:Ｒ969 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2016)08-1859-03
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H． pylori)感染与慢性胃炎、
消化性溃疡、胃癌及胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等发生密切相
关［1］。目前临床上常用的一线根除 H． pylori治疗方案三联疗法，
由于抗生素的不规范使用，H． pylori 日趋耐药［2，3］，研发新型抗
H． pylori药物成为研究热点。
头花蓼是贵州苗族常用的一种中药材，目前研究发现其具有
广泛的抗菌活性，对革兰氏阳性、革兰氏阴性菌均具有抑制作
用［1］。我们前期实验发现苗药头花蓼可能通过影响 H． pylori 细
胞膜的的结构，干扰细菌的生命活动，从而发挥抗 H． pylori作用。
外膜蛋白(outer membrane protein，omp)是革兰氏阴性菌外膜的
主要结构。研究发现，H． pylori 的全基因组序列中存在着一个庞
大的 omp家族，其中，omp8、omp32 基因可分别编码 H． pylori微孔
蛋白 hopX和 hopW，是渗透性外膜的主要蛋白，其在维持外膜结
构，保证物质运输等方面有着重要作用［5 ～ 8］。
本课题运用Western blot及 Ｒeal － time PCＲ技术分别检测头
花蓼对 H． pylori外膜蛋白及 omp8、omp32 基因的表达变化，为研
发抗 H． pylori新型药物提供实验依据。
1 材料与仪器
1． 1 药材 苗药头花蓼浸膏粉，批号为 13143，由王子厚研究员
(原国家药检局新药审评中心研究员)提供。
1． 2 菌株 幽门螺杆菌国际标准测序株 ATCC700392 购自购自
ATCC(美国菌种保藏中心)，由贵州医科大学临床检验教研室保
存。
1． 3 主要试剂 哥伦比亚血琼脂粉(批号 CM0331B)购于 Oxoid
公司;无菌脱纤维羊血(批号 15050701)购于南京便诊生物有限
公司。Trizol(批号 50175111)购于 Invitrogen公司;ＲNA反转录试
剂盒(批号 AK2203)、荧光定量 PCＲ 试剂盒(批号 AK5001)购于
Takara公司;细菌蛋白提取试剂盒(批号 CW0888)购自康为世纪
生物科技有限公司;BCA 蛋白定量试剂盒(批号 A045 － 1)购自
鼎国生物技术有限公司;抗 H． pylori 外膜蛋白抗体(批号
sc69935)购自 santa cruz 公司;HＲP 标记抗鼠 IgG 抗体(批号
AE043001)、兔抗 β － actin 抗体(批号 AE071755)均购自博奥森
生物有限公司。
1． 4 主要仪器 台式低温高速离心机(Sigma)，荧光定量 PCＲ仪
(德国 ＲOCHE公司)，Western Blot 电泳及转膜系统(美国 Bio －
Ｒad公司)。
2 方法
2． 1 H． pylori 复苏培养、鉴定及药物干预 从 － 80℃取出 H． py-
lori ATCC700392，室温溶解后倾倒于哥伦比亚血琼脂平板上，
37℃，微需氧(5%O2、10%CO2、85%N2、相对湿度 95%以上)培养
72h。观察细菌生长状况，稳定传代 3 次后进行氧化酶试验、触酶
试验、尿素酶试验及革兰染色鉴定。配制头花蓼浓度为 0． 5，1，
2，4，8 g /L的药平板及溶剂对照平板，刮取培养 72h的菌落，加入
预冷的无菌脑心浸液肉汤，3000g，4℃离心 5min，弃上清，重复 3
次后，调节菌液浓度为 3 × 108 cfu /L，无菌棉签沾取菌液均匀涂布
于药平板及对照平板，各涂 2 个平板，微需氧培养 72h，实验重复
3 次。
2． 2 Western blot检测 H． pylori外膜蛋白表达量
2． 2． 1 H． pylori蛋白制备 按康为世纪生物科技有限公司的细
菌蛋白提取试剂盒说明书，分别提取药物组及对照组 H． pylori蛋
白。分别收集培养 72h 的对照组及药物组 H． pylori，加入
0． 01mol /L PBS，5000g离心 10min，洗涤细菌 3 次，差量称重法收
集菌体。按照每克菌体沉淀加入 0． 02L 细菌蛋白抽提试剂盒的
比例加入抽提液，加样枪吹打直至菌体完全重悬，室温孵育
15min。15000g离心 5min，收集上清液。
2． 2． 2 BCA法测定 H． pylori 蛋白浓度 根据鼎国生物技术有限
公司 BCA蛋白定量试剂盒操作，按 A∶ B为 50∶ 1 的比例配制适
量 BCA工作液，充分混匀;将 1g /L 蛋白标准品按 0，1，2，4，6，8，
10μl加到 96 孔板的标准品孔中，标准品稀释液补足到 10μl;另
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 8 时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 8 期
取对照组及药物组制备样品 10μl加入到 96 孔板的样品孔中，每
个测定设置 3 个平行;各孔加入 200μl BCA 工作液，37℃放置
30min;于 562nm处检测吸光度。以横坐标为浓度，纵坐标为吸
光度制作标准曲线，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
2． 2． 3 Western blot 分析 H． pylori 外膜蛋白表达量 10% SDS －
PAGE电泳分离，上样量为 25μg /孔，将电泳物转移至硝酸纤维膜
上，5%脱脂奶粉室温摇床上缓慢封闭 2h，洗膜后加入抗 H． pylori
外膜蛋白抗体(1 ∶ 400 稀释)4℃孵育过夜。第 2d 洗膜后加入
HＲP标记的二抗(1∶ 4000 稀释)，室温孵育 1h。暗室曝光，显影
及定影，采用 ImageJ灰度扫描软件进行灰度扫描。
2． 3 Ｒeal － time PCＲ 检测 H． pylori 微孔蛋白基因 omp8、omp32
mＲNA表达量
2． 3． 1 H． pylori 总 ＲNA 提取 采用 TＲIZOL 法分别提取对照组
和药物组全菌总 ＲNA，用酶标仪对提取的总 ＲNA 进行测定，计
算 OD260nm /OD280nm比值和总 ＲNA浓度，并用 1． 0%琼脂糖凝胶电
泳检测 ＲNA的完整性。
2． 3． 2 逆转录 cDNA 按照 TaKaＲa 逆转录试剂盒进行操作，反
应体系为:2． 5μl 总 ＲNA，2． 0μl 5 × Prime Script Buffer，0． 5μl
Prime Script ＲT Enzyme Mix Ⅰ，0． 5μl ＲT Primer Mix，4． 5μl DEPC
水，37℃ 15min，85℃ 4s，－ 20℃保存备用。
2． 3． 3 Ｒeal － time PCＲ 引物参照 GenBank 上的 H． pylori
ATCC700392 omp8、omp32 基因序列。由宝生物工程(大连)有限
公司设计并合成引物，以 gryB作为内参基因，见表 1。20μl 反应
体系为:2． 0μl DNA 模板，0． 8μl 上、下游引物，10μl SYBＲ 
Premix Ex TaqTM II，6． 4μl 灭菌 ddH2O。反应条件:95℃ 30 sec，
95℃ 5sec，56℃ 20sec，40 个循环。采用 2 －△△CT法计算目的基因
omp8、omp32 相对表达量。
表 1 目标基因及内参基因引物序列
基因名称 引物序列(方向 5’－3’) 基因号
产物长度
/bp
omp8
上游 TTCAAATAGCGGGTAACACTTGG
下游 CGTGGGAGTGGGGTATTCTTT
AE000511 80
omp32
上游 TGACCACGCAGTTAGCTTTAGTGT
下游 TGCCTTTTGGCGATGTTTC
AE000511 123
gryB
上游 CCCTAACGAAGCCAAAATCA
下游 GCACTATCGCCCTCCACTAA
FJ711770 192
2． 4 统计学分析 用 SPSS17． 0 软件对相关数据进行统计学分
析，组间比较用 T检验，P ＜ 0． 05 为有统计学差异。
3 结果
3． 1 头花蓼对 H． pylori的抗菌活性 以溶剂对照平板生长良好
为对照，4，8g /L 头花蓼与 H． pylori 共培养 72h 后，药平板上无菌
生长，2g /L药平板上 H． pylori生长稀薄，0． 5，1g /L药平板生长良
好，提示头花蓼具有抑制 H． pylori作用，其 MIC为 4g /L。
3． 2 H． pylori蛋白浓度测定 以吸光度为纵坐标(Y)，标准品的
浓度为横坐标(X)，求得曲线方程为 Y = 0． 0024X + 0． 0016，Ｒ2 =
0． 9941(图 1)，经计算，所制备的对照组及药物组的蛋白浓度分
别为 1． 953mg /ml和 1． 503mg /ml，此提示所提取的蛋白样品可用
于 Western blot实验。
3． 3 头花蓼对 H． pylori外膜蛋白的影响 Western blot结果显示，
与对照组相比，经头花蓼作用后 H． pylori外膜蛋白水平呈高表达
状态，差异具有统计学意义，P ＜ 0． 05。见图 2。
图 1 562nm处蛋白标准品浓度与吸光度关系曲线
与空白对照比较，* P ＜ 0． 05
图 2 Western blot检测 H． pylori omp表达情况
3． 4 头花蓼对 H． pylori外膜蛋白 omp8、omp32 mＲNA的影响
3． 4． 1 待测基因融解曲线分析 融解曲线分析内参基因 gryB，目
的基因 omp8、omp32 均为特异性的单峰，无非特异性扩增产物及
引物二聚体。见图 3 ～ 5。
图 3 gryB基因的融解曲线
图 4 omp8 基因的融解曲线
3． 4． 2 头花蓼对 H． pylori 外膜蛋白 omp8、omp32 mＲNA 水平的
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时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 8 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 8
影响 通过 2 －△△CT法计算相对表达量，药物组微孔蛋白基因 omp8
和 omp32 mＲNA表达量分别上调为空白对照组的 1． 310 和 1． 732
倍，P ＜ 0． 05。见图 6。
图 5 omp32 基因的融解曲线
与对照组比较，* P ＜ 0． 05
图 6 omp8、omp32 基因的相对表达比率
4 讨论
H． pylori 与多种疾病的发生、发展有关，其长期定植于胃粘
膜可引起一系列胃部疾病，因此能否成功根除幽门螺杆菌可作为
衡量胃药治疗效果的参照依据之一［9 ～ 11］。现已明确苗药头花蓼
对部分革兰氏阴性杆菌、阳性球菌以及部分真菌及厌氧菌均有不
同程度的抑制作用。在前期的研究中已发现苗药头花蓼对 H．
pylori具有良好的抑菌效果，作为一种天然的抑菌制剂，有望成为
抗 H． pylori的新型中药。
前期实验结果提示苗药头花蓼能够影响 H． pylori 的超微结
构，改变细胞膜的通透性，发挥抗菌作用［12］。外膜蛋白是革兰氏
阴性菌外膜的主要结构，其对抗菌药物的通透性大小直接影响药
物对细菌的作用，若通透性小，药物渗透障碍，细菌产生耐药。据
报道，淋球菌外膜蛋白表达的缺失或下降，导致抗生素进入细菌
的量减少，进而引起耐药［13］。本次研究观察苗药头花蓼对 H． py-
lori外膜蛋白的影响，结果显示头花蓼作用后，H． pylori 外膜蛋白
呈高表达状态。因此，我们推测苗药头花蓼可通过上调 H． pylori
外膜蛋白表达水平，增加细菌细胞膜的通透性，使药物得以进入
菌体内部，从而发挥抗菌作用。
我们从转录水平对与通透性息息相关的微孔蛋白基因
omp8、omp32 研究发现，头花蓼可上调 H． pylori 微孔蛋白基因
omp8 和 omp32 mＲNA表达水平。推测，苗药头花蓼是通过上调
微孔蛋白基因 omp8 和 omp32mＲNA 的表达量，引起 H． pylori 外
膜通透性增强，从而增加胞内药物浓度，或者改变胞内外离子的
重新分布，导致细菌破裂，发挥抗菌作用。
综上所述，头花蓼在体外对 H． pylori 有明显的抑菌作用，引
起 H． pylori 形态发生改变［12］，可能是通过上调微孔蛋白基因
omp8和 omp32 mＲNA表达水平，影响 H． pylori 外膜蛋白的表达，
从而改变 H． pylori外膜的通透性，干扰能量代谢并影响遗传物质
的合成与代谢发挥抗菌作用。进一步证实了苗药头花蓼对 H．
pylori的抗菌机理是通过多途径、多靶点实现的，为今后选择有效
的抗 H． pylori新药提供了实验依据。
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