全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
盐芥 ICE1转录因子的克隆及生物信息学分析
轩春雷1 肖向文 2 李晓波 2 祝建波 1
( 1石河子大学生命科学学院,石河子 832003; 2中国科学院新疆理化技术研究所,乌鲁木齐 830023)
摘 要: ICE1基因编码一个 MYB类型的碱性螺旋 -环 -螺旋 ( bHLH )转录因子,在冷胁迫条件下调节 CBF基因的表
达, 能够提高植物抗寒性。利用盐芥 5 EST序列和拟南芥 ICE1 3 UTR保守序列设计引物,从盐芥基因组中克隆得到了 1个
2 525 bp的基因 xhICE。生物信息学分析, 表明该基因具有 4个外显子, 4个内含子,外显子 /内含子边界符合经典的 GTAG规
则。由此推导的 cDNA包含一个 1 500 bp的开放阅读框, 编码 500个氨基酸。与拟南芥 ICE1相比, 二者的内含子具有相同的
类型和相对保守的位置,在核酸水平与氨基酸水平高度同源, 并且具有相同的 bHLH 结构域。以上分析都表明, xhICE基因可
能是盐芥 ICE1基因, 涉及抗寒相关的 CBF转录调控途径。
关键词: 转录因子 表达序列标签 生物信息学 ICE1
C loning and Bioinformatics Analysis of a Transcription
Factor ICE1 from Thellungiella halophila
Xuan Chunlei
1
X iao X iangwen
2
L iX iaobo
2
Zhu Jianbo
1
(
1
Co llege of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi 832003;
2
TheX injiang T echnical Institute of Phy sics& Chem istry, CAS, Urumqi 830023)
Abstrac:t ICE1 encodes aMYCtype ba sic he lixloophe lix transcr iption facto r that regu lates the transcr iption of CBF genes un
der co ld stress, w h ich can im prove the ch illing to lerance o f p lants. In th is study, w em ake use of the 5 EST sequence o fThellung iella
halophila and the 3 UTR sequence ofA rabidop sis thaliana ICE1 to des ign prim er and clone the ICE1 gene from Thellungiella ha lo
ph ila. The b io in form atics ana ly sis showed that this g ene consists o f four exons and four introns, and the intronexon boundaries con
form to the! GTAG∀ rule. It fo llow s that th is predicted cDNA has an open reading fram e ( ORF ) of 1 500 bp in leng th, encod ing a
prote in o f 500 am ino acids. In compar ison to the genom e sequence o fA rab idop s is thaliana ICE1, bo th in trons have the sam e type and
re lativ ely conservative pos ition, h igh ly hom ogene ity at am ino ac id and nuc le ic ac id leve l and have a potentia l basic he lixloophe lix.
A ll results ind ica te tha t xhICE genem igh t beThellung iella ha lophila ICE1 gene, that can be invo lved in the CBF transcriptional regu
lato ry paths.
Key words: T ranscr iption facto r Expressed sequence tags B io inform atics ICE1
收稿日期: 20100412
基金项目:国家转基因重大专项 ( 2008ZX005004) ,国家 ! 863∀重点项目 ( 2007AA021401)
作者简介:轩春雷,男,研究生,研究方向:基因工程; Ema i:l xcl80225@ sina. com
通讯作者:祝建波, Em ai:l z jbsh z@ 126. com
低温是植物经常遭受的一种逆境胁迫, 它限制
作物的产量,影响植物的自然分布。剖析植物对低
温的应答机制、提高其抗低温能力在农业生产上有
重要意义。随着分子生物学的发展与应用, 以拟南
芥作为模式植物,已经克隆了许多冷反应基因及冷
调节的转录因子基因, 明确了这些基因的抗寒功能
及多种低温调控的信号传导途径, 植物通过激活特
异信号传导途径来改变基因的时空表达, 从而增强
植株的逆境生存能力。逆境应答信号途径依据
ABA ( abscisic acid)的参与与否分为 ABA依赖和非
ABA依赖两大类。
作为冷应答反应主效途径的 CBF /DREB信号
通路属于非 ABA依赖, 当植物受低温驯化, 转录因
子 ICE1( inducer of CBF expression 1)被激活, 需要
经过冷诱导的构型变化调节活性从而激活下游基因
的表达。它首先与位于 CBF基因上游启动子结合,
2010年第 11期 轩春雷等:盐芥 ICE1转录因子的克隆及生物信息学分析
诱导 CBF基因表达,而后 CBF基因表达产物与下游
一系列 COR基因启动子中的 CRT /DRE元件结合,
从而激活下游 COR基因的转录表达,并在植物体内
产生一系列与低温胁迫有关的生理生化反应, 包括
多种 LEA蛋白或亲水多肽的编码产生、脯氨酸和多
种糖类的合成积累, 从而提高植物抗冷性。HOS1
蛋白通过泛素化介导的蛋白降解负调控 ICE1。
本研究以盐芥中的 ICE1转录因子为研究对象,
利用盐芥 5 EST序列 ( BY821140)和拟南芥 3 UTR
序列 (NM 001035699)设计引物, 从盐芥基因组中克
隆得到了盐芥 ICE1转录因子, 完成了全序列测定。
将该序列提交 GenBank(登录号为 HM044323)。利
用生物信息学方法和比较基因组学的方法对其核酸
序列和氨基酸序列的组成成分、理化性质、疏水性、
序列比对、系统发生树、磷酸化位点、结构域和无序
化特性等方面进行了较为全面的分析。这对于探明
同源基因在盐芥耐寒性形成过程中的可能功能和作
用机制提供了参考依据。
1 材料与方法
11 数据库的来源
数据库来源于 NCBI ( http: / /www. ncb.i n lm.
nih. gov / ) 。
12 ICE1转录因子的分子克隆
加拿大盐芥的种子经过 1% ( V /V ) NaOC l消
毒后种植在黑土 #珍珠岩 #蛭石 ( 1#1#1)中, 22∃ ,
16 h光照培养生长 25 d。取生长健壮的盐芥嫩叶,
采用 CTAB法抽提盐芥嫩叶的总 DNA。利用盐芥
5 EST序列和拟南芥 3 UTR保守序列设计特异性引
物,从盐芥基因组中克隆得到了盐芥 ICE1转录因
子,设计特异性引物, 引物两端分别引入 BamH I和
Sal I的酶切位点。上游游引物 ICX0031: GATC
CAGTGACGGTGAGACGACG ( BamH I) , 下游引物
ICX1807: GTCGACCCAACAACAACAACCTCAAGTT
CTC (Sal I)。基因组 PCR扩增,在 20 L的体系中
进行 PCR反应,反应参数: 94∃ 变性 30 s, 595∃ 退
火 30 s, 72∃ 延伸 3 m in,共扩增 30个循环, 扩增的
产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后克隆到
pMD18T载体上进行克隆鉴定和序列测定, DNA序
列测定由上海生工完成。
13 生物信息学分析
序列均使用 V ectorNTI Su ite 10 3软件和 B last
进行分析, ORF ( open read ing frame)的查找和核苷
酸翻译在 NCBI的 ORF F inder上完成 ( http: / /
www. ncb.i nlm. nih. gov /gorf /gor.f htm l) 。蛋白质
和核苷酸的多重序列比对使用 V ector NTI Su ite程
序完成, 比对报告利用 V ector NT I Suite 8 0生成。
分子系统进化树的构建使用软件 Vector NT I Su ite
对序列进行多重比对后, 然后使用 MEGA4对系统
发生树进行测试和编辑, 生成报告图形。蛋白质基
本性质的分析使用 ExPASy ( http: / /www. expasy.
org / too ls)网站的相关生物信息学分析软件进行。
2 结果与分析
21 盐芥 ICE1转录因子的核酸序列与内含子的
分析
核苷酸序列测定结果 (图 1)表明, 盐芥 xhICE
基因序列全长为为 2 525 bp, 凝胶电泳图如图 2所
示。将该序列提交 GenBank (登录号为 HM0443
23)。通过 NCB I b last核酸序列相似比对的结果主
要集中的是拟南芥基因 ICE1基因组序列。利用生
物信息学与比较基因组学的方法, 推测出 4个内含
子和 4个外显子 (图 3A )。其中,内含子都是以 GT
开始并以 AG结尾的序列,并且 3 端富含嘧啶核苷
酸, 这些都符合 GUAG类型内含子的特征。通过
G + C含量的分析,这些内含子区域的 G + C含量明
显偏低,而外显子区域 G + C含量较高。从已测序
的盐芥 ICE1(图 3B )基因组序列中切除 4个预测
的内含子序列,得到 xhICE基因 cDNA预测序列, 该
序列包含 1个 1 500 bp的 ORF,编码 500个氨基酸。
盐芥 ICE1 CDS与拟南芥 ICE1 CDS进行同源性比
对, 它们的一致性为 863%。盐芥 xhICE、拟南芥
ICE1、荠菜 ICE1在 3 UTR区存在高度保守区域, 具
有潜在的 m icroRNA靶点。
将 xhICE基因组序列与拟南芥 ICE1 ( AT3G26
7442)基因组序列对比分析后表明, 二者内含子具
有相同的类型和相对保守的位置, 其中二者的第一
个内含子都位于 5 端非编码区域内。前者内含子
的长度都大于后者。二者内含子的异化程度大于二
者外显子,这是由于编码蛋白质的外显子通常处于
较大的选择压力之下,而相应的内含子通常处于较
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
小的选择压力之下的缘故所造成的。二者外显子具
有很高的相似性,尤其二者的后 3个外显子完全相
同。以上分析表明所克隆的基因不是一个无功能的
假基因,可能是盐芥 ICE1基因。
内含子可能通过不同的机制来提高基因表达效
率, 因此, 分析基因内部内含子的组成结构, 对进一
步了解基因功能和表达的分子机制具有重要的意
义。内含子也是一种非常有用的研究物种进化的分
子标记,对内含子序列的比较研究,可以为我们研究
近缘种的进化提供线索。
图 1 盐芥 xhICE基因组序列
M. m ark er III; 1.盐芥 xhICE
图 2 xhICE基因组序列凝胶电泳图
22 xhICE转录因子的氨基酸组成及理化性质分析
xhICE基因的蛋白质序列长度为 500 aa, 理论
分子量为 536 kD,理论等电点为 565。 xhICE编码
的氨基酸序列中, G ly含量最高, 达 l160%, Leu含
量其次 (为 1120% ), Ser含量居第三 ( 1060% ),含
量最低的是 T rp (为 060% )。与拟南芥 ICE1的氨
基酸组成相似。
23 xh ICE转录因子推导的氨基酸序列疏水性 /亲
水性分析
疏水性 /亲水性是氨基酸固有的特性,蛋白质结
构的特征是疏水 /亲水间的平衡, 其结构的稳定在很
大程度上有赖于分子内的疏水作用。疏水性 /亲水
性预测和分析对于蛋白质次级结构的预测及功能分
析都有较为重要的参考意义。疏水性分析结果 (图
4)显示, 盐芥 xhICE编码的氨基酸序列中, 具有有
多个明显的亲水区域, 大部分的氨基酸属于亲水
性氨基酸。因此, 盐芥 xhICE转录因子属于亲水
性蛋白。
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图 3 拟南芥 ( A)与盐芥 xhICE(B )基因组结构示意图
图 4 盐芥 xhICE氨基酸序列疏水性分析
24 xhICE转录因子推导的氨基酸序列二级结构
预测
二级结构预测分析结果 (图 5 )表明, 盐芥
xhICE由 121个 螺旋, 71个延伸链, 22个 转角,
286个自由卷曲连接。与拟南芥 122个 螺旋, 75
个延伸链, 25个 转角 286个自由卷曲和荠菜 128
个 螺旋, 75个延伸链, 25个 转角 264个自由卷
较为相似。以上分析说明盐芥 xhICE 与拟南芥
ICE1可能具有相似的功能。
25 相关转录因子氨基酸序列比对及系统发生树
分析
首先用 C lusterW 对 xhICE、拟南芥 ICE1、荠菜
ICE1、大豆 ICE1、拟南芥 CBF3和油菜 CBF3基因的
蛋白序列进行多重比对 (图 6), 并使用 MEGA进行
系统发生树的分析,为了确保所构造的进化树真实
性, 分别采用了 N J, M P算法进行系统发生树构建,
结果表明所构建的树是一致的。
系统发生树 (图 7)的分析表明, 盐芥 xhICE、拟
南芥 ICE1、荠菜 ICE1、大豆 ICE1被聚为一类, 其中
拟南芥 ICE1与荠菜 ICE1的亲缘关系最近, 盐芥
xhICE与拟南芥 ICE1、荠菜 ICE1处于同一分支上,
而大豆 ICE1的亲缘关系相对较远。拟南芥 CBF3和
油菜 CBF3被聚为一类。由此我们推断盐芥 xhICE
基因与拟南芥 ICE1基因属于同源基因,可能具有相
似的功能。
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a螺旋, 转角,延伸链和卷曲分别用依次减少的竖线表示
图 5 盐芥 xhICE、拟南芥 ICE1和荠菜 ICE1二级结构预比较
图 6 盐芥 xhICE、拟南芥 ICE1、荠菜 ICE1和大豆 ICE1氨基酸序列比对
26 xhICE磷酸化位点和结构域的分析
用 DNAMAN和 TMHMM分析, 表明 xhICE无
跨膜结构, 这与亲水分析的结果是一致的, 因此
xhICE在膜上没有功能, 可能在细胞质或核内起作
用。通过网站 ExPASy( http: / /www. expasy. o rg )分
析显示,在靠近 xhICE蛋白质序列 C端处有 1个
bHLH结构域, 具有核定位信号; 在 N端处具有 1
个酸性结构域, 这与 bHLH转录因子家族的特征一
致。与拟南芥和荠菜比较分析表明, 三者 bHLH结
构域的氨基酸序列是一致的。以上分析证明了
xhICE可能是一个 bHLH转录因子, 并定位到细胞
核内。
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通过 ExPASy分析表明, xhICE存在 5种结构位
点: 3个 N糖基化位点, 1个依赖 cAMP和 cGMP的
蛋白激酶磷酸化位点 ( cAMPand cGMPdependent
pro tein kinase phosphory la tion site) , 5个蛋白激酶 C
磷酸化位点 ( P rote in k inase C phospho ry lation site) , 3
个酪蛋白激酶 II磷酸化位点 ( Casein kinase II phos
pho ry lation site), 2个酪氨酸激酶磷酸化位点 ( Tyro
sine kinase phosphory lation site) , 17个 N十四烷基化
图 7 盐芥 xhICE系统发生树分析
位点 (Nmyristoy lat ion site) , 2个氨基化位点 ( Am id
ation site)。蛋白质可逆磷酸化是最普遍、最重要的
一种蛋白质翻译后修饰, 起到活性转换的作用。在
拟南芥的研究中发现, 冷驯化会使一些蛋白质磷酸
化,而去冷驯化会使这些蛋白质相应地去磷酸化。
在冷驯化过程中, Ca2+信号被蛋白激酶和磷酸酶传
导,蛋白激酶的磷酸化,可能会起到调控抗寒基因表
达的效果。这说明盐芥 xhICE的磷酸化位点对于冷
讯号的传导起着重要的作用。
bHLH ( basic He lixLoopH elix,碱性螺旋 - 环 -
螺旋 )转录因子构成了真核生物蛋白质中的一个大
家族, 其成员在生物的生长发育调控过程中起着重
要的作用。具有高度保守的 bHLH结构域能够引起
特异性的二聚化作用, 能够从无活性的单体变为有
活性的二聚体。在拟南芥的研究中发现, 拟南芥在
常温条件下,转录因子 ICE所编码的蛋白属于无活
性的单体, 不能与 DNA结合, 从而不能诱导下游
CBF基因的表达。在低温下条件下, 信号转导途径
被激活,转录因子 ICE所编码的蛋白质被磷酸化,变
为有活性的二聚体, 可作为转录激活因子诱导下游
CBF基因的表达。我们得到的 xhICE也编码含有
bHLH结构域的蛋白质, 因此它可能和拟南芥一样
涉及 CBF基因的激活。
上述磷酸化位点与结构域的分析结果都有力地
表明, xhICE的作用同拟南芥中的相关转录因子的
功能一致,参与多个信号转导途径,在冷响应应答中
起着重要的作用。
27 xhICE转录因子的蛋白质固有无序化分析
蛋白质固有无序化特性 ( in trinsica lly disordered
prote in)是反映蛋白质功能的一个重要指标。本研
究利用程序 Fo ld Index( http: / /b ioporta.l w e izm ann.
ac. il / fldb in / findex )对 xhICE、荠菜 ICE1和拟南芥
ICE1转录因子氨基酸序列进行了固有的无序化分
析。固有无序化分析 (图 8)表明,盐芥的无序化区
域为 6个, 最长的无序化区域为 94个氨基酸, 无序
化氨基酸的数目为 184。拟南芥的无序化区域为 4
个, 最长的无序化区域为 99个氨基酸,无序化氨基
酸的数目为 207。荠菜的无序化区域为 5个, 最长
的无序化区域为 93个氨基酸,无序化氨基酸的数目
为 206。三者的有序化区域的长度及位置相似, 因
此, 它们可能具有相似功能。
3 讨论
分离和克隆基因是研究基因结构、功能以及表
达调控的基础,随着分子生物学技术的迅速发展,寻
找新基因、克隆新基因的方法也不断得到发展和完
善, 传统克隆基因的方法已不能满足当前高速发展
的生物经济时代,广泛的 DNA和蛋白质数据库的创
建为新基因的克隆提供了可利用资源。本研究利用
盐芥 ICE1 5 EST序列和拟南芥 ICE1 3 UTR保守序
列设计引物, 克隆得到了盐芥 ICE1基因, 相比于
RACE等传统的基因克隆手段,更为简便, 并对其相
关核苷酸、氨基酸序列和蛋白质等特性进行了较为
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全面的分析,为开展盐芥抗逆调控研究提供了一个
新的途径,也为转基因改良所需的基因资源获得提
供了一个有效途径。
数值的正负分别表示蛋白的有序和无序状态
图 8 盐芥 xhICE、拟南芥 ICE1和荠菜
ICE1蛋白质固有无序化分析
参 考 文 献
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