全 文 ：热带亚热带植物学报 2005，13(1)：80—84
Journo／ofTropical and SubtropicalBotany
提高外源基因在植物体内表达的策略
王 彪， 武天龙
f E海交通大学植物科学技术系， ．f=海201 101)
摘要：介绍提高外源基因在植物体内表达的方法。从外源基因的优化、整合、转录、翻译、运输以及基因间的相互作用
等方面，总结提高外源蛋白在植物宿主体内表达的常用策略。
关键词：外源蛋白；外源基因；基因表达；综述
中图分类号：Q786 文献标识码 ：A 文章编号：1005—3395(2005)01—0080—05
Strategies to Enhance Expression of Foreign Genes in Plants
WANG Biao， WU Tian—long
(Department ofPlant Science and Technology ofShanghai， ∞ Tong University，Shanghai 201 101，China)
Abstract：Strategies to achieve hi gh—level expression of foreign genes in plants are mainly introduced in this
paper．The authors summarize general ways to improve amounts of foreign proteins in plants in respect of
optimization，integration，transcript，translation，transport and interaction of genes．
Key words：Foreign proteins；Foreign genes；Gene expression；Review
在建立植物生物反应器的过程中，提高外源蛋
白在植物体内的表达水平是必须解决的首要问题。
本文对如何增强外源基因在植物宿主体内的表达
水平从以下几个方面进行综述，以期为植物转基因
·技术的应用提供参考。
1寻找在宿主体内表达效率高的启动
子和调节序列
植物种类繁多，遗传多样性丰富。植物基因的
启动子和调控序列类型也多种多样，寻找能在宿主
体内高效表达的特异性启动子是提高外源基因在
植物体内表达途径之一。植物基因工程中常用的启
动子有的来自质粒，如章鱼碱型启动子和胭脂碱型
启动子；有的来自病毒，如花椰菜花叶病毒 35S启
动子(CaNIV35S)；有的来自动物，如果蝇热激蛋白
基因启动子；但大部分启动子还是来源于植物，如
单子叶转基因植物主要使用的玉米泛素(Ubiquitin1
启动子和水稻肌动蛋白(Actin1)启动子，查尔酮合成
收稿日期 2oo3一l2一l2 接受日期：2004-03—17
基金项目：“863”重大专项油料作物转基因项目(2001AA212141)资助
通讯作者Corresponding author
酶基因启动子，1，5．二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基
因启动子，豆科植物种子凝集素基因启动子，大豆
谷氨酸合成酶基因启动子[1]，B一伴大豆球蛋白基因
仅亚单位启动子[2]等等。植物启动子类型也很多，有
双向启动子和可变启动子；环境诱导表达型启动
子：如激素、创伤、光和真菌诱导表达的启动子；植
物发育中特异表达启动子等等[31。启动子的强弱是
影响基因表达的重要因素，但启动子种类繁多，同
一 种启动子在不同宿主体内表达的效率有很大差
别，有的启动子表达还具有组织和器官特异性，同
时受到调节序列和其他启动子的影响。现在已经商
业化的转基因大豆采用CaMV35S或增强型35S启
动子，表明35S启动子在大豆中表达效率较高[4]。
Kamo[5】研究了B一葡萄糖苷酸酶(GUS)基因在花椰
菜花叶病毒基因启动子 (CaMV35S)、泛素启动子
(ubq3)、甘露碱合成酶基因启动子(， 2)和鸟氨酸环
化脱氨酶基因启动子(rolD)等控制下，GUS在烟草
愈伤组织、茎杆和根中的表达情况，发现在茎杆中
以CaMV35S宿动子为最高，根中rol1)启动子最
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第 1期 王彪等：提高外源基因在植物体内表达的策略 8l
高。比较温室和室外培养的结果发现，GUS表达量
在 CaMV35S、mas2和 ubq3三种启动子中没有区
别，但rolD启动子表现却不同，室外和室内培养的
植株茎杆中GUS表达量相差4倍，根中相差 8倍。
总的来说，GUS在茎杆中表达量比根中要低，这可
能与不同部位细胞的分生能力有关。Olga等同分别
用马铃薯的马铃薯块茎储藏蛋f~1(Patatin)启动子和
CaMV35S启动子构建单链 Fv抗体基因的表达载
体转化马铃薯，结果发现用CaMV35S启动子构建
的载体转化植株比Patatin启动子的表达量要高，重
组蛋白占可溶性总蛋白的2％，在4℃下保存 l8个
月后仍有一半抗体具有活力。
研究发现，植物基因启动子常利用其第一个
ATG作为起始密码子，ATG旁侧的保守序列与动
物基因的CCACCATG(G)保守序列不同，为TAAA
CAATGGCT啊。启动子旁侧及其上游的调节序列，
能够感受光、不同发育阶段或微生物感染引起的信
号，因而基因的表达受到信号因子的诱导和调节嘲。
起始位点上游的调节序列，也对转录的效率有很大
的影响，如 n序列等。在烟草和水稻中，以
CaMV35S为启动子，插入n序列和内含子序列，使
GUS基因的活性提高2O一7O倍[9]。秦红敏等【 0】利用
GUS基因和双增强的35S启动子，构建GUS-NOS
(胭脂碱合成酶终止子)，n。GUS-NOS，n。GUS。3 。
UTR-NOS和n。GUS。3 -UTR(3 非翻译端)组成4个
不同的表达框架，对转基因烟草 GUS活性检测表
明，前3种载体表达量有显著差异，以n。GUS。3 。
UTR-NOS表达量为最高，在整体植株上证明n序
列能提高外源基因的表达水平。在转基因植物中，
3 。UTR似乎不能起 poly(A)的作用，也不能作为转
录的终止子，但 3-UTR和 n序列共同作用，能使
外源基因的表达效果更好。甚至基因的内含子序列
对基因的转录也有影响。Xu等[1】研究发现，细胞质
磷酸丙糖异构酶基因中的第一个内含子对磷酸丙
糖异构酶基因在水稻、大麦和玉米叶子中的表达是
必须的。还有其他常见表达调控元件，如增强子、
CCAAT盒元件、G盒元件等等，都能控制下游的基
因表达。Rieping利用基因定点突变技术，删去
CCAAT元件，能使目的基因表达量降低5 。
2 构建融合基因
将外源基因与植物特异蛋白基因及其调控序
列连接起来，使重组蛋白在植物体内的表达具有器
官和组织特异性，可大大提高外源蛋白的表达量。
这种方法是利用在植物中能够高效表达基因的部
分序列、启动子和调控序列与目的基因结合，构建
融合基因，从而实现外源基因的表达和分泌，利用
融合蛋白的特性将目的蛋白富集和保护起来，免受
宿主体内蛋白水解酶的攻击，从而提高外源蛋白的
含量。Van Rooijen和Moloneyt 】将葡萄糖醛酸酶基
因与油蛋白的前800bp核苷酸序列连接，构建融合
蛋白载体，导入油菜植株，融合蛋白8O％能正确定
位于油体，提高了重组蛋白的表达量，简化了外源
蛋白的提取和纯化步骤。Hayashi等【 4]将 2S清蛋白
基因与膦丝菌素转移酶(PPT)的基因构建成一个融
合基因转入拟南芥中，发现虽然成功转入ppt基因，
但转化的拟南芥仍然对膦丝菌素敏感，进一步研究
发现是融合蛋白将PPT蛋白引向2S清蛋白前体累
积小泡，避免外源蛋白由融合蛋白中切出或释放。
Sojikul等【 5】将大豆营养贮存蛋白vspA的信号肽与
肝炎B表面抗原(HBsAg)构建成融合蛋白，使用的
是增强型花椰菜花叶病毒启动子，虽然融合蛋白没
有将信号肽正确地切除，但表达的融合蛋白稳定性
高，融合蛋白的表达量也比没有修正的HBsAg表
达水平高得多。
3利用分泌途径将外源蛋白引向特定
的部位
利用分泌途径来提高外源蛋白的含量。将外源
蛋白导向特定的部位或分泌到细胞外，避免宿主细
胞将外源蛋白视为异己蛋白而降解，从而提高了外
源蛋白的积累。真核生物分泌蛋白N端一般都有信
号肽序列，引导蛋白质定位于内质网膜，经高尔基
体加工后分送到细胞的各个部位，特别是膜蛋白和
细胞外蛋白。Sijmons等【 6】用人清蛋白(HSA)作为目
的基因，使用人的前导序列和烟草PR。S序列，用
pMOG285作对照，转化烟草，发现在积累HSA蛋
白方面有明显的差异，并推测表达的差异是由于非
分泌型HSA不稳定造成的，而这些特异的序列能
将与之相连的蛋白引向特定目标，最后这些引导序
列能被正确切除。研究表明，蛋白质C端 KDEL序
列能将蛋白质定位在内质网膜上。通过改变蛋白质
的细胞定位和分泌途径，能明显提高外源蛋白在宿
主体内的表达水平【 圳。Olga等同构建含有 KDEL
(Lys-Asp-Glu-Leu)和不含有KDEL的载体分别转化
马铃薯，ScFv抗体的表达具有明显差异。Udo等【 9】
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82 热带亚热带植物学报 第 l3卷
比较烟草叶子和种子中在有或无KDEL信号情况
下 ScFv—OX表达量的差别，结果表明：以CaMV35S
为启动子，ScFv—OX在叶子中的表达量从无 KDEL
信号时的 0．1％一0．2％提高到有KDEL信号时的
1．1％一4．0％；在种子可溶性蛋白中，以LeB4为启动
子，ScFv—OX表达量从无 KDEL信号时的 0．2％一
0．6％提高到有KDEL信号时的 1．0％一1．9％。
4反义基因技术
反义基因技术是利用某基因mRNA与其反义
基因的RNA能特异结合的特点，在翻译水平上阻
断该基因表达。反义基因技术已经在植物基因工程
中广泛应用，主要用于分析相应基因的功能，改良
农作物的品质，提高重要的有经济价值的农艺性
状，提高农作物的抗病性能等方面[加]。运用反义技术
抑制植物体内相应基因的活性，提高作物的品质特
别是种子贮存蛋白的品质。Kohno—Murase等[2 1将
napin的反义基因转入油菜，并在种子中特异表达，
发现种子中Napin蛋白含量减少，同时Cruciferin蛋
白含量增加 1．4倍以上。但在转高油作物(如油
菜)时发现，用反义基因转化的植物总蛋白和总油脂
的相对含量并没有改变。反义技术能提高外源蛋白
表达，在 1999年，Alain等人t21用拟南芥种子2S清
蛋白的反义基因和arcelin(arc)5一I基因构建载体，转
化马铃薯，结果发现 2S清蛋白在种子中累积减少，
但 ARC一5在种子中积累大大增加，表达量占种子总
蛋白量的24％，这表明反义基因对提高外源基因在
异体表达中有很大的促进作用。反义基因技术用于
大豆的研究中，Anthony等人 ]用 B一伴大豆球蛋白
的反义基因转化大豆发现，反义基因极大地抑制B一
伴大豆球蛋白的表达，种子中7S球蛋白的含量明
显增加。同时，植物种子中蛋白的累积生理代谢途
径也发生明显的改变，蛋白体的含量增加，而液泡
贮存蛋白则减少，反义基因诱导了内质网来源蛋白
体的形成。更为重要的是反义抑制并不会损伤植物
的生产能力，Staswick等[24]用反义vspA转化大豆，
营养贮存蛋白降至原来的 2％，VSPt~降至 1％，
VSPI3降至 10％。田间试验表明，种子产量、蛋白质
含量、油份和氨基酸组成在 =0．05水平上并没有
显著的差异；在开花期间，种子的含氮水平也没有
显著的变化，但叶子可溶性蛋白减少3％。
5利用叶绿体基因工程
植物细胞，特别是绿色组织细胞中，叶绿体含
量丰富。叶绿体转化具有位点专一的同源重组、高
拷贝数、母系遗传等优点。将外源基因转入细胞器
叶绿体，也是实现外源基因在植物宿主体内高效表
达的途径之一。该方法有很多优点，包括外源蛋白
表达量高，没有后生效应，转基因的叶绿体呈现出
母性遗传，转入的基因很少有机会逃逸到环境中
去，不会发生通过花粉传播而引起基因污染问题，
有利于环境的保护[251。Jefery等 用人生长素基因
转化烟草的叶绿体，表达量达到可溶性蛋白的7％，
比转入核基因组方法提高了300倍，且叶绿体表达
外源蛋白没有复杂的蛋白修饰过程，却能够正确折
叠成有生物活性的蛋白，是一种极有前途的提高外
源蛋白表达的新方法。但这种方法在非绿色组织如
果实、块茎或其他贮藏器官中的表达量较低，近年
来在这些方面的研究也取得一些进展，Ruf等 采
用一种新的质体转化系统，转化西红柿叶片中的叶
绿体，提高了外源蛋白在果实中的表达水平，表达
量达到叶绿体可溶性蛋白的50％左右。
6其他策略
提高外源蛋白在宿主体内的表达水平方法还有
很多。对这些方法的深入研究，必将推动植物基因
工程的进一步发展。
早在 l994年，Conceicao等 就发现，多拷贝
DNA表达量异常的高，但多拷贝的DNA容易引起
DNA之间的相互干扰和基因沉默。
外源基因在受体植物的基因组内插入位点不
同造成转录活性的差异，这就是所谓的“位置效
应”。为了消除位置效应，构建表达载体时通常会应
用核基质结合区以及定点整合技术。真核细胞含有
核骨架，研究发现，附着在核骨架上的染色体往往
是活跃转录的基因，将细胞核中核基质结合序列
(matrix a~ached region，MAR)置于 目的基因的两
侧，构建成MAR—Gene．MAR，可创建一个独立的结
构域，在转基因烟草中，用酵母MAR序列可使表达
量提高 12倍，如果使用烟草的MAR序列，可使表
达量提高60倍[29- 1。目前还没有找到大幅提高外源
基因与植物核基因组之间同源重组频率的方法，限
制了定点整合技术在植物基因工程中的应用。
细菌、植物、动物各有自己偏好的密码子，对已
知氨基酸序列的蛋白质来说，可以通过计算机优化
密码子，使用宿主偏好的密码子，也可以提高外源
蛋白的表达水平。Elizabeth等[321将抗生物素蛋白密
码子进行优化设计，使用玉米偏好的密码子，使抗
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第 1期 王彪等：提高外源基因在植物体内表达的策略 83
生物素蛋白在玉米种子中的表达量占可溶性总蛋
白2％以上，实现抗生物素蛋白的商业化生产。
基因的排列也影响蛋白质的表达水平。在细菌
中，利用双顺反子的结构提高重组人粒细胞一巨噬
细胞集落刺激因子(hGM．CSF)蛋白的表达水平，将
表达量从5％提高到30％[3]。对多价载体来说，基因
间的排列也会影响基因表达的效率。
Poly(A)对成熟mRNA的稳定性及促进其翻译
有重要的作用。新霉素磷酸转移酶I( ￡I)的3 末
端序列可以显著提高nptI基因在转化植物中的表
达。对马铃薯蛋白酶抑制剂I(pi—I1)研究发现，聚腺
苷酸信号的下游 100 bp左右有一段 DNA序列，它
对基因的高效表达是必须的，这段序列含有一段
8 bp的保守序列CGTGTTTT并广泛存在动植物基
因的3 末端 。
总之，外源基因在宿主体内表达受多种因素影
响，外源基因在基因组中的整合位置，外源基因的
转录、翻译、加工以及分泌等过程都会影响该蛋白
最终在宿主体内的积累，必须根据研究目的综合运
用以上的策略才会获得最佳效果。
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