全 文 ：收稿日期:2007-11-16
作者简介:程远:女(1981-),硕士研究生,研究方向:生物医学信息学,E-mail:chengyuan2001@163.com
通讯作者:曾照芳,教授,电话:023-68485009,E-mail:zeng000@126.com
牙周病是口腔两大类主要疾病之一。在牙周组织伤口愈合的4种来源细胞中,只有牙周膜细胞(periodontal
ligamentcels,PDLCs)具有牙周组织再生的能力[1]。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对牙周膜细胞具有多
种生物学作用,它可以促进牙周膜细胞的增殖,促进透明质酸的合成,提高层粘连蛋白的 mRNA水平,抑制
I型胶原纤维、碱性磷酸酶和弹性蛋白原的合成[2]。
1 材料与方法
1.1 人正常牙周膜细胞的取材、培养和扩增
1.1.1 原代培养[3] 在口腔外科门诊收集正畸拔除的 12~18岁青少年健康前磨牙,立即投入装有无菌 D-
Hanks溶液的青霉素包装瓶中,轻轻晃动瓶子大约 5~10min,将牙根面的血迹冲洗干净,然后用无菌镊子将
牙齿夹出至另一个装有无菌 D-Hanks溶液的青霉素包装瓶中,冰浴下带到实验室。
1.1.2 传代培养 当细胞达到 80%~90%汇合时,吸去培养液,0.25%胰蛋白酶:0.02%EDTA(1∶1)的混和消
化液消化细胞 2~5min,至镜下观察细胞突起回缩,细胞变圆时终止消化,吸管轻柔反复吹打形成均匀的细
胞悬液,不要遗留有细胞团。细胞悬液以 1∶2的比例接种于 25cm2一次性无菌培养瓶中继续培养,以后每
3d更换一次培养液。
碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜细胞内核心蛋白
多糖基因表达的影响
程远 1 曾照芳 1 朱俊 2
(1重庆医科大学生物医学工程系,重庆 400016;2西南交通大学土木工程学院,成都 610031)
摘 要: 利用外源性碱性成纤维细胞生长因子(BasicFibroblastGrowthFactor,bFGF)刺激体外培养的人正常牙周
膜细胞。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞内decorin的基因表达的变化,研究bFGF对体外培养的人牙
周膜细胞内核心蛋白多糖(decorin)的作用,进一步探讨bFGF抑制I型胶原的作用机制。发现bFGF刺激牙周膜细胞后能
促进牙周膜细胞的增殖,bFGF抑制decorin的合成是bFGF促进牙周膜细胞增殖的重要调节因素之一。
关键词: 牙周组织再生 bFGF 核心蛋白多糖
EfectofBasicFibroblastGrowthFactorontheGene
ExpressionofDecorinbyPeriodontalLigamentCelsinCulture
ChengYuan1 ZengZhaofang1 ZhuJun2
(1DepartmentofBiomedicalEngineering,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016;2SchoolofCivilEng.,Southwest
JiaotongUniversity,Chengdu610031)
Abstract: ThisstudywastofindouttheefectsofExogenousbasicfibroblastgrowthFactor(bFGF)ondecorinof
periodontalligamentcels(PDLC).GeneexpresionlevelswereanalyzedbyRT-PCR,toevaluatetheprincipleofbFGF
oninhibitingtypeIcolagen.TheresearchshowsthatbFGFenhacetheproliferationofPDLC,whichismainlycaused
bybFGFinhibitingcompositionofdecorin.
Keywords: Periodontalregeneration bFGF Decorin
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
生物技术通报Biotechnology Bulletin2008年第3期
表 1 人牙周膜细胞免疫组化鉴定结果
图 1 人正常牙周膜细胞角蛋白染色(X100)
图 2 人正常牙周膜细胞波形丝蛋白染色(X100) 图 3 人正常牙周膜细胞鉴定阴性对照(X100)
1.1.3细胞冻存 取第 3代对数生长期的细胞,冻存前 1d更换一次培养液。用 0.25%胰蛋白酶将单层生
长的细胞消化下来,用弯头吸管轻柔地将细胞吹打成细胞悬液。将细胞悬液移入 50m1的无菌离心管中,
800r/min离心 10min。小心吸去上清液,加入 1.5ml的细胞冻存液,冻存液的成分是含有 10%DMSO和 20%
FBS的 DMEM培养液。用吸管轻轻吹打形成均匀的细胞悬液,移入准备好的无菌 1.5m1冻存管中,标记好
细胞名称、冻存时间后放入冻存盒中,-80℃过夜,第二天移入液氮中保存。
1.2人正常牙周膜细胞的鉴定
1.2.1制备细胞爬片 按照细胞培养玻璃器皿要求清洗盖玻片,高压蒸汽灭菌后分别置于一次性无菌六
孔板的 6个孔中,将细胞悬液分别加入到 6个孔中培养,待细胞贴壁后常规培养。细胞长至孔底面积的
70%~80%时,吸去培养液,PBS清洗 3次,每次 30s。加入 4g/L多聚甲醛固定 30min。再用 PBS清洗 3次,每
次 3min。晾干后,用树胶将盖玻片无细胞面粘在载玻片上,室温晾干备用。
1.2.2免疫组织化学方法进行抗波形丝蛋白、角蛋白染色:按照 SP试剂盒说明书进行操作。
1.3外源性 bFGF刺激体外培养的人牙周膜细胞
取第 6代人牙周膜细胞,分为实验组和空白组,每组 3瓶细胞。实验组分别用含终浓度为 0.1、、10ng/
ml的 bFGF的 DMEM培养液标准条件下培养 24h;空白组用 DMEM培养液标准条件下培养 24h。
1.4 RT-PCR法检测核心蛋白多糖(decorin)的 mRNA水平[4]
decorin的引物序列为:
上游引物:5-GTCTGGACAAAGTGCCAAAGGA-3
下游引物:5-ATCAGCAATGCGGATGTAGGAG-3
β-actin的引物序列为:
上游引物:5-GGCATCGTGATGGACTCCC-3
下游引物:5-TCGCTGTCCACCTTCCAGC-3
电泳条带的光密度和面积测量:使用 GIS凝胶分析系统测量每条电泳条带的光密度值和面积值,记
录。
1.5统计分析数值
用 SPSS13.0软件包进行分析。计量资料用士 s表示。采用方差分析。P<0.05时有统计学意义。
2 结果
2.1人正常 PDLCs的鉴定结果。见表 1及图 1、图 2和图 3。
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2008年第3期
表 2 RT-PCR法检测人牙周膜细胞内 decorin基因表达结果
2.2 外源性 bFGF刺激正常人 PDLCs
空白对照组镜下观察未见明显变化,实验组可见细胞增殖,刺激前瓶底细胞较稀疏的区域变得密集
了。
2.3 RT-PCR结果
PCR产物电泳分析各组在约 416bp和 613bp处均有 1条电泳条带,而且实验组目的片段的条带亮度
与空白对照组目的片段相比有明显的降低,与预期结果一致。
将测量后的各个电泳条带的光密度值和面积值带入公式:比值=decorin(光密度值×面积值)/β-actin(光
密度值×面积值)计算,结果如表 2所示。
发现用bFGF刺激牙周膜细胞后,decorin
的 mRNA表达水平下降了(P=0.019),而且
bFGF对 decorin基因表达的抑制作用随着
浓度的升高而降低,在 0.1ng/ml时抑制作用
最强,在 10ng/ml时抑制作用最弱。
3 讨论
牙周炎是一种以牙周组织丧失为主要表现的慢性进行性疾病,临床表现为牙龈的炎症、牙周袋的形
成、牙槽骨的吸收和牙齿松动、移位。经过牙周基础治疗和手术治疗辅助药物治疗和牙合治疗后牙周组织
的炎症可得到控制,但牙周组织丧失却是不可逆的。实验的目的是重建丧失的牙周组织。目前临床常用的
再生性手术主要有引导组织再生术(guidedtissueregeneration,GTR)和植骨术,单一的牙周组织再生治疗方
法都有其各自的优点,但也有其局限性。
3.1 成纤维细胞
成纤维细胞(又称为牙周膜细胞,periodontalligamentcels,PDLCs)是牙周膜中最常见的细胞,其主要功
能是合成胶原,同时具有吞噬降解陈旧胶原纤维的能力[1]。牙周膜细胞具有的功能决定了它在牙周组织再
生中的重要性。
实验中,牙周膜细胞来源于正畸拔除的青少年健康前磨牙的牙周膜组织,组织来源容易,牙周膜组织
新鲜。虽然牙周膜细胞在牙周膜中数量不多,但原代培养和体外扩增容易,没有其他细胞株的污染,生物学
性状稳定,培养技术成熟,并且细胞培养技术用于科学研究具有许多优点。因此,牙周膜细胞的体外培养用
于研究 bFGF对牙周膜细胞的作用是一种较好的方法。
3.2 bFGF对牙周膜细胞的作用
免疫组化染色显示 bFGF存在于牙周膜成纤维细胞、内皮细胞和一些纤维细胞中,纤维细胞自身能合
成和分泌 bFGF或者从成纤维细胞阶段就开始贮存 bFGF。在牙周膜细胞中 bFGF分布于胞浆和细胞核内。
碱性成纤维细胞生长因子对 PDLCs的增殖是有促进作用的,它可以诱导牙周组织的生长[5]。bFGF对人牙
龈成纤维细胞(gingivalfibroblasts,GF)、人牙周膜成纤维细胞(periodontalligamentfibroblasts,PDLF)及人牙
槽骨细胞(alveolarbonecels,ABC)3种细胞的增殖也均有促进作用,只是最佳效应浓度有所差异[6]。
bFGF对很多与牙周组织再生有关的物质,例如碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALPase),透明质酸
Chyaluronan,HA)等,都有促进或者抑制的作用。研究表明,在加入 bFGF的条件培养基中培养的牙周膜细
胞中 HA的分子数量较未加入 bFGF的培养基中,培养的牙周膜细胞中 HA的分子数量多。RT-PCR检测到
透明质酸合成酶 1和 2的 mRNA表达水平提高 (这两者都参与 HA的合成)。这些结果说明 bFGF在参与
HA合成的调节及它在维持内环境稳定和牙周组织再生中发挥了作用[7]。
bFGF还对 I型胶原和金属蛋白酶-1的基因表达有相反的时间和剂量依赖性,它同时下调 I型胶原的
基因表达和上调金属蛋白酶-1的基因表达。但是它对Ⅲ型胶原的基因表达没有这种作用。bFGF对这 3种
程远等:碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜细胞内核心蛋白多糖基因表达的影响 93
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
(上接第90页)
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5 SominaraSB,HayesFJ,CrowleyWF.EndocrineRev,1998,19:521~9.
6 WenderPA,HoA,PatabiramanK,PelkeyET.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97:13003~8.
7 FawelS.ProcNatlAcadSciUSA,1994,91:664~8.
8 金元昌,刘利,苏晓艳,等.中国生物制品学杂志,2006,19(3):272~4.
9 金元昌,陈春岚,苏晓艳,等.西北农业学报,2006,15(4):173~6.
10 GreeM,LoewensteinPM.Cel,1988,55:1179~88.
11 FrankelAD,BredtDS,PaboCO.Science,1988,240(4848):70~3.
基因表达的影响可以由加有 bFGF培养基的培养时间来调节。这些结果提示 bFGF是牙周膜中 I型胶原有
效重构的重要调节因子之一,也可能对其他结缔组织来说同样如此。
3.3 bFGF对核心蛋白多糖(decorin)的影响
decorin是牙周组织中的一种主要的蛋白多糖,分布在牙龈上皮基底膜区以及牙龈和牙周连接组织的
胶原纤维束中,在牙龈上皮下区域比牙周深部区域有更强的免疫表达。decorin的核心蛋白呈马蹄形,可以
通过核心蛋白结合不同类型的胶原纤维,比如 I型胶原和 VI型胶原[8]。因此,它被认为影响胶原的合成和
胶原纤维最终的直径。
实验表明,加入 bFGF的牙周膜细胞内 decorin的 mRNA表达水平明显下降了,而且随着 bFGF浓度的
增加,抑制作用逐渐减弱,在 0.1ng/ml时抑制作用最强,在 10ng/ml时抑制作用最弱。现通过以下几点来讨
论其意义:①bFGF对 decorin的抑制作用改变了细胞外基质的内环境稳定,使得 I型胶原的合成下降了。
decorin还是调节胶原降解的重要因子,bFGF也可能通过这个途径来调节胶原的合成。②在牙和牙周组织
中,小的间质蛋白多糖表达于牙本质和牙骨质的非矿化区,特别是软硬组织交界处插入牙骨质、牙槽骨的
胶原纤维以及牙槽骨内侧的成骨细胞显示强阳性免疫特性,表明小的间质蛋白多糖可能影响牙本质、牙骨
质及牙槽骨的矿化。③decorin调解细胞的增殖,在细胞休眠期它的表达升高,而在细胞活跃增殖的时候它
的表达水平却很低。④decorin在生长、发育和损伤修复过程中发挥重要作用,还参与组织的自身稳定和损
伤修复。bFGF对 decorin的抑制作用提示我们 bFGF也很可能参与牙周病的炎症过程。这表明 bFGF对牙周
膜细胞内 decorin基因表达具有较大影响,为牙周膜细胞在牙周组织再生中更好地发挥其多能细胞的功
能,促进牙周组织再生提供了一定的理论基础。
总之,牙周组织再生是一个十分复杂的过程,而 bFGF抑制 decorin的合成是 bFGF促进牙周膜细胞增
殖的重要调节因素之一。应用 bFGF能有效诱导牙周组织再生,不仅诱导结缔组织再生,还能诱导骨质再
生和牙槽骨再生,其应用前景是很广泛的。
参考 文献
1 曹采芳主编.临床牙周病学[M].北京:北京大学医学出版社,2006,3.
2 钱虹.国外医学口腔医学分册,2004,31(2):107~109.
3 司徒镇强主编.细胞培养[M].北京:世界图书出版公司,2004,3.
4 [美]J萨姆布鲁克,DW拉塞尔著,黄培堂,等译.分子克隆实验指南[M](第 3版).北京:科学出版社,2005,3.
5 ShimabukuroY,IchikawaT,TakayamaS,etal.JCelPhysiol,2005,203(3):557~563.
6 张韶君,梁益慧,杨王山.上海口腔医学,2001,10(2):135~137.
7 ShimabukuroY,IchikawaT,TakayamaS,etal.JCelPhysiol,2005,203(3):557~563.
8 NareyeckG,SeidlerDG,TroyerD,etal.EurJBiochem,2004,271(16):3389~3398.
94