全 文 ： 药理
蛇葡萄素的血管生成抑制作用
罗高琴 ,曾　飒 ,刘德育*
(中山大学药学院 ,广东广州 510089)
　　摘要　目的:探讨蛇葡萄素对内皮细胞及肿瘤细胞的生长及其血管生成的影响。方法:体外用 MTT法对牛主
动脉内皮细胞进行增殖抑制实验;用 ELISA法 、免疫组化染色法以及流式细胞仪观察蛇葡萄素对人肝癌细胞 Be l-
7402分泌 VEGF、 bFGF的抑制作用;体内观察蛇葡萄素对人肝癌 Bel-7402裸鼠移植瘤的抑制作用。结果:蛇葡萄
素对牛主动脉内皮细胞的增殖在 6.4 ～ 51. 2 μg /m l呈现浓度依赖性抑制作用 , IC
50
=22. 0±4. 0 μg /m l。 ELISA法
测定结果显示 , 12. 8μg /m l、25. 6 μg /m l、38.4 μg /m l蛇葡萄素对肝癌 Be l-7402细胞分泌 VEGF的抑制率分别为
14.2%、40. 0%及 49. 6%。免疫组化染色结果显示 , 12. 8 μg /m l以上的蛇葡萄素能使细胞体积缩小 , 分泌 VEGF、
bFGF明显减少。流式细胞仪检测 VEGF、bFGF结果 , 25. 6μg /m l及 38.4μg /m l蛇葡萄素对 VGEF的抑制率分别为
32.2%及 57. 4%, 对 bFGF的抑制率分别为 54. 9%及 62.6%。蛇葡萄素浓度为 100、150、200 m g /kg时对人肝癌
Bel-7402裸鼠移植瘤的抑制率分别可达 24.3%、41.4%及 45.7%。结论:蛇葡萄素在体外能有效抑制内皮细胞增
殖及人肝癌 Be l-7402细胞分泌 VEGF和 bFGF,具有抑制血管生成的作用;体内能有效抑制人肝癌 Bel-7402裸鼠移
植瘤的生长 , 提示蛇葡萄素也许可作为一个肿瘤血管生成抑制剂用于肿瘤防治。
关键词　蛇葡萄素;内皮细胞;人肝癌 Be l-7402细胞;血管生成;VEGF;bFGF
中图分类号:285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2006)02-0146-05
基金项目:广东省自然科学基金(20010762);广东省科技计划项目(2003C104033)
　　*通讯作者:刘德育 ,教授 , E-m ail:liudy@gzsum s. edu. cn
　　在肿瘤发生侵袭转移的多步骤过程中 ,无论肿
瘤转移的起始或终末阶段 ,血管生成均发挥重要作
用 〔1、 2〕。血管内皮生长因子 (VEGF)是目前已知活
性最强 、专属性最高的血管生成因子 ,它在肿瘤血管
生成过程中发挥关键调节作用 〔3〕。肿瘤细胞过度
分泌 VEGF、肿瘤血管内皮过度表达其受体 (VEG-
FR),都是肿瘤血管生成和肿瘤转移的前提 。阻断
VEGF与 VEGFR的相互作用 ,可抑制肿瘤内皮细胞
生长和血管生成 ,阻止肿瘤的生长和转移 。碱性成
纤维细胞生长因子(bFGF)也能促进 VEGF的表达 。
针对 VEGF及其受体而开发的小分子药物具有专属
性高 、副作用少 、不易产生耐药性的优点 ,是目前抗
血管生成药物研究的焦点 〔3〕。
蛇葡萄素是一种小分子化合物 ,可由蛇葡萄属
民间药用植物粤蛇葡萄 (又名无莿根)或显齿蛇葡
萄 (又名藤茶 )提取得到〔4〕。已经发现 ,蛇葡萄素对
小鼠 B16黑色素瘤具有显著的抗肿瘤侵袭和转移
作用〔5〕。为了进一步揭示蛇葡萄素的抗侵袭 、转移
机制 ,本文采用 MTT法观察了蛇葡萄素对牛主动脉
内皮细胞增殖的影响 ,采用 ELISA法 、免疫组化染
色法以及流式细胞仪观察蛇葡萄素对人肝癌细胞
Be l-7402分泌 VEGF、bFGF的影响 ,并在体内观察
了蛇葡萄素对人肝癌 Bel-7402裸鼠移植瘤的抑制
作用。
1　实验材料
1.1　药品与试剂　蛇葡萄素:本研究室提供 ,纯度
95%以上 ,临用时先用 20%DMSO溶解 ,再用培养基
稀释成 DMSO终浓度为 0.2%的使用液;注射用环
磷酰胺:江苏恒瑞医药股份有 限公司 , 批号
02061421,临用时用生理盐水配制;MTT、台盼蓝染
色剂:S igm a公司;M199培养基 、RPM I-1640培养基:
G ibico公司;固定剂 ( IC fixation Bu ffer)、破膜剂
(Pe rm eab iliza tion buffe r):美国 Ebioscience公司;人
VEGF ELISA试剂盒:北京晶美生物工程有限公司;
免疫组化 SABC染色试剂盒 、DBA显色试剂盒 、兔抗
人 VEGF /bFGF多克隆抗体浓缩型一抗 、羊抗兔 IgG
浓缩型二抗:武汉博士德公司;胰蛋白酶:上海生工
(Amresco分装);小牛血清:杭州四季青生物工程材
料产品研究所;其余试剂为国产分析纯 。
1.2　细胞株　人肝癌 Bel-7402细胞 ,中山大学基
础医学院生物化学教研室提供。
1.3　动物及瘤源　裸鼠:BALB /C裸鼠 , SPF级 , 4
～ 6周龄 ,雌雄兼用 ,体重 18 ～ 29 g,中山大学实验
动物中心提供 ,按 SPF条件饲养(合格证号:医动字
第 26-00A005号 ,粤检证字 2000A003号 );瘤源:裸
鼠移植性人肝癌 Be l-7402瘤块 ,中山大学实验动物
中心提供 。
2　实验方法
146 中药材第 29卷第 2期 2006年 2月
DOI牶牨牥牣牨牫牳牰牫牤j牣issn牨牥牥牨牠牬牬牭牬牣牪牥牥牰牣牥牪牣牥牪牨
2.1 　牛主动脉内皮细胞增殖的作用
2.1.1　新生牛主动脉内皮细胞的分离培养:参考
文献〔6〕方法稍作改进 。取新生健康乳牛 (雄性 ,广
州市奶牛研究所提供),颈动脉放血处死 ,无菌条件
下分离主动脉 ,长 12 ～ 15 cm ,装入加双抗的 PBS中
(青霉素 、链霉素各 100 U /m l)。取出动脉 ,清除动
脉外壁的筋膜和脂肪 ,用 pH7.4的无菌 PBS(mmo l /
L:N aC l 130, KC l 2.5 , Na2HPO4 10, KH2 PO 4 1.5)反复
冲洗 3 ～ 5次 。在动脉内壁滴上一层 0.25%胰酶 ,
10 ～ 20 s后立即用含 10%小牛血清的 M199培养基
终止消化。轻轻刮下动脉内层细胞 ,加入适量 M 199
完全培养基 , 5%CO 2饱和湿度培养箱中 37℃培养
20 ～ 30m in后 ,将未贴壁的细胞转入细胞培养瓶 ,加
适量培养基培养 。 24 h后吸去上清 ,加入新鲜培养
基继续培养 。在相差显微镜下见成片的鹅卵石样内
皮细胞 ,并有接触抑制现象 。免疫组化实验观察到
内皮细胞第 Ⅷ因子相关抗原反应阳性 。继续用含
10%小牛血清 、100 U /m l青霉素和链霉素的 M199
培养基培养 ,每 3天换液一次 ,长满后用 0.25%胰
蛋白酶消化传代 。
2.1.2　对新生牛主动脉内皮细胞增殖的作用:按
文献〔7〕方法稍作改进 。将传代培养的内皮细胞以
0.25%胰酶消化 、吹打成单细胞悬液 , 1%台盼蓝染
色 ,细胞活力 >95%,显微镜下计数 ,用培养基稀释
后以 5×104 /孔 (200μl)接种于 96孔板。培养 12 h
后分组 ,每组 6复孔 ,分别加入含不同浓度蛇葡萄素
的培养基 ,并设阴性对照组和溶剂对照组 ,继续培养
48 h。在实验结束前 4 h吸去培养基 ,用 PBS洗 ,每
孔加入用 PBS配制的 0.5 mg /m lM TT200 μl,继续
培养至实验结束 。小心吸去上清 ,加入 DMSO 150
μl,震荡 10m in充分溶解细胞沉淀 ,在 1 h内用酶标
仪于 490 /570 nm处测吸光度(A)值 ,减去零孔 A值
后 ,按下式计算增殖抑制率:
抑制率 =溶剂组平均 A值 -给药组平均 A值阴性对照组平均 A值 ×100%
用插值法计算 IC50。实验重复共 3次。
2.2 　对肝癌细胞分泌 VEGF、bFGF的作用
2.2.1 　细胞培养:人肝癌 Be l-7402细胞 , 用含
10%小牛血清 、100 U /m l青霉素和链霉素的 RPM I-
1640培养基 ,在 37℃饱和湿度的 5%CO2中培养 ,用
0.25%胰蛋白酶消化传代。
2.2.2　ELISA法和免疫组化染色法:ELISA法:将
传代培养的 7402细胞以 0.25%胰酶消化 、吹打成
单细胞悬液 , 1%台盼蓝染色 ,细胞活力 >95%,显微
镜下计数 ,用培养基稀释后以 5×104 /孔 (1m l)接种
于 24孔板 。培养 12 h后分组 ,每组 4复孔 ,分别加
入含不同浓度蛇葡萄素的培养基 ,并设阴性对照组
和溶剂对照组 ,继续培养 72 h。每孔吸出 100 μl上
清 , 2000 ～ 3000 rpm离心 20m in,以 4%多聚甲醛固
定 20 ～ 30 m in,置于 4℃中 。分别将不同浓度样品
或 VEGF标准品以 100 μl /孔加入到相应孔中 ,每样
2复孔 ,用封板胶纸封住 , 37℃孵育 90 m in。用洗涤
液洗板 4 ～ 5次 , 350 μl /孔 ,静止 30 s;除空白板外 ,
加入生物素化抗体工作液 100 μl /孔 ,封孔 , 37℃孵
育 60m in。同前洗板 4 ～ 5次 。除空白板外 ,加入酶
结合物工作液 100 μl /孔 ,封板 , 37℃孵育 30 m in。
洗板 4 ～ 5次。加入底物显色剂 100 μl /孔 , 37℃避
光孵育 10 ～ 15m in。加入终止液 100μl /孔 ,低频振
荡器混匀后立即用酶标仪测量 A值(450 nm , 5 m in
内)。每个标准品和样品的 A值减去零孔 A值 ,绘
制标准曲线。通过标准曲线查出样品浓度。按下式
计算抑制率:
抑制率 =溶剂组浓度 -药物组浓度阴性对照组浓度 ×100%
　　免疫组化染色法:取出已固定细胞的 24孔板 ,
每孔加入新鲜配制的 3%H 2O 2 200μl,室温放置 10
～ 20m in灭活剩余的过氧化物酶 ,用蒸馏水洗 3次 ,
每次 5 m in。吸干 ,加入正常山羊血清封闭液 ,室温
放置 20 m in, 吸去多余液体后加稀释的兔抗人
VEGF多克隆抗体一抗 4℃孵育过夜;其中 VEGF或
bFGF浓缩型一抗以含 0.1%Triton PBS (pH 7.2 ～
7.6)按 1∶300稀释后使用 。次日于 37℃孵育 60
m in, 0.1%T riton PBS洗 3次 ,每次 5m in。加生物素
化羊抗兔 IgG二抗 , 37℃孵育 20 m in, PBS同前洗
去。然后滴加试剂 SABC ,室温孵育 10 ～ 20 m in,
PBS洗 3次 ,每次 5 m in。 1 m l蒸馏水加显色剂 A、
B、C各 1滴 ,混匀 ,加至标本上 ,显色至出现背景色。
用 PBS充分洗涤以终止反应并于相差显微镜下拍
照。
2.2.3 　流式细胞仪法:收集对数生长期的人肝癌
Bel-7402细胞 ,胰酶消化后吹打成单细胞悬液 , 1%
台盼蓝染色 ,细胞活力 >95%,显微镜下计数 。用培
养基稀释后以 3×105 /瓶接种于 18个 50 m l玻璃培
养瓶 ,培养 12 h后吸去上清 。加入含不同浓度蛇葡
萄素的培养基 ,同时设阴性对照组和溶剂对照组 ,每
浓度组 3瓶细胞 ,继续培养 72 h。收集培养的细胞 ,
每浓度组为一个样本 ,每样本分 2管 。每管各加入
100 μl细胞 (含 106个细胞)及 100 μl固定剂室温
固定 1 h。加入破膜剂 500μl,离心去上清。再加入
300 μl破膜剂 ,室温 10m in后离心去上清 。其中实
147中药材第 29卷第 2期 2006年 2月
验管用破膜剂 1∶100稀释一抗 ,每管加 50 μl,室温
孵育 30m in。然后加 500 μl无 Triton PBS洗 2次 。
最后所有管都加入 1∶60二抗 100 μl,室温孵育 30
m in,加 500μl PBS洗 2次 。流式细胞仪测定。以对
照管作空白 ,计算 10000个细胞 ,记录标本的平均荧
光强度 ,按下式计算抑制率:
抑制率 =溶剂组荧光灰度 -药物组荧光灰度阴性对照组荧光灰度 ×100%
2.3 　裸鼠移植性人肝癌 Be l-7402增殖抑制实验　
取肿瘤组织人肝癌 Bel-7402瘤块置于无菌 Hank’ s
液中 ,去除包膜 ,剪碎 ,取 BALB /C裸鼠称重后背部
皮下套种瘤块 1 ～ 2 mm3 ,继续饲养 10天后长出肿
瘤 ,大小不等 。称重 、测量瘤体后随机分成 6组 ,即
蛇葡萄素高剂量组 (200 mg /kg)、中剂量组 (150
mg /kg)及低剂量组 (100 mg /kg),环磷酰胺组 (20
mg /kg)、阴性对照组 (生理盐水 )和溶剂对照组
(25%DMSO),每组均按 0.1m l /10 g体重给药 。每
周称体重 、测量瘤体 1次。
接种裸鼠给药共 21天 ,停药 48小时后断颈处
死称重 ,并取出瘤块称重 ,按下式计算抑制率:
抑制率 =对照组平均瘤重 -给药组平均瘤重对照组平均瘤重 ×100%
2.4 　统计学处理　应用 SAS v 6.12统计软件对实
验结果进行单因素方差分析。
3 　实验结果
3.1 　蛇葡萄素对新生牛主动脉内皮细胞的增殖抑
制作用　内皮细胞经不同浓度的药物处理后的结果
见表 1,可以看出蛇葡萄素 19.2 μg /m l以上各浓度
组内皮细胞增殖抑制明显 , 在浓度为 6.4 ～ 51.2
μg /m l范围内 , 浓度与抑制率呈线性相关 ( r =
0.9718, P <0.01), IC50 =22.0±4.0μg /m l。经单因
素方差分析 , 19.2 μg /m l以上浓度组与溶剂组之间
存在显著性差异 (P<0.05)。
　表 1　 MTT法牛主动脉内皮细胞增殖抑制实验(n=6)
蛇葡萄素(μg /m l) 吸光度( X ±S) 抑制率%
51.2 0. 044±0. 021 88. 1
38.4 0. 119±0. 034 74. 0
25.6 0. 217±0. 041 55. 6
19.2 0. 286±0. 026 42. 6
12.8 0. 420±0. 041 17. 3
6.4 0. 501±0. 049 2. 1
溶剂对照 0. 512±0. 086 /
阴性对照 0. 531±0. 089 /
零孔 0. 019±0. 008 /
3.2　ELISA法和免疫组化染色法测定结果　表 2
为 ELISA法测定结果。 12.8 μg /m l、25.6 μg /m l、
38.4 μg /m l蛇葡萄素对肝癌 Bel-7402细胞分泌
VEGF的抑制率分别为 14.2%、40.0%及 49.6%,与
溶剂组比较均有显著性差异 (P <0.05)。图 1、2照
片所示免疫组化染色结果 ,可见 12.8 μg /m l、25.6
μg /m l、38.4μg /m l各药物组均能使细胞体积缩小 ,
染色面积表示分泌 VEGF、bFGF明显减少。
　表 2　ELISA法测定各药物组 VEGF分泌抑制率(n=3)
组别 VEGF(ng /mL) 抑制率(%)
蛇葡萄素 38. 4μg /m L 　4. 4±0.5** 49.6
蛇葡萄素 25. 6μg /m L 18. 6±2. 5* 40.0
蛇葡萄素 12. 8μg /m L 56. 6±12.5* 14.2
溶剂组 77. 5±18.4 /
阴性组 147. 4±18.0 /
　　与溶剂组比较:**P<0. 01, * P<0. 05
3.3　流式细胞仪测定结果　表 3所示为流式细胞
仪 VEGF、bFGF灰度检测结果 ,蛇葡葡素各浓度组
的灰度值均比溶剂组降低。 25.6 μg /m l、38.4 μg /
m l蛇葡萄素对 VEGF的抑制率分别为 32.2%及
57.4%,对 bFGF的抑制率分别为 54.9%及 62.6%,
两浓度组与溶剂组之间均存在显著性差异 (P <
0.05),而且 12.8 μg /m l浓度组的 bFGF抑制率也
达到了 35.0%(P <0.05)。
　表 3　　流式细胞仪法测定 VEGF、bFGF结果(n=3)
组别
VEGF
灰度 抑制率%
bFGF
灰度 抑制率%
蛇葡萄素 38.4μg /mL 2. 03±0.78** 57.4 1.34±0.11* 62. 6
蛇葡萄素 25.6μg /mL 3. 85±0.81* 32.2 1.54±0.06* 54. 9
蛇葡萄素 12.8μg /mL 5. 78±1.16 5.5 2.05±0.46* 35. 0
溶剂 6. 18±1.04 / 2.95±0.60 /
阴性 7. 23±0.37 / 2.57±0.88 /
　　与溶剂组比较:**P<0. 01, * P<0. 05
　　以上实验结果表明 , 25.6 μg /m l及 38.4 μg /m l
蛇葡萄素能有效地抑制人肝癌 Bel-7402细胞合成
VEGF和 bFGF。
3.4　蛇葡萄素对人肝癌 Be l-7402裸鼠移植瘤增殖
的抑制实验 　蛇葡萄素对裸鼠移植性人肝癌 Bel-
7402增殖的抑制实验结果见表 4,蛇葡萄素剂量为
100、150及 200 mg /kg时对人肝癌 Be l-7402裸鼠移
植瘤的抑制率分别可达 24.3%、41.4%及 45.7%,
三组与溶剂对照组比较均有显著性差异 (P <
0.05),提示蛇葡萄素能有效抑制人肝癌 Be l-7402
裸鼠移植瘤的增殖 。
148 中药材第 29卷第 2期 2006年 2月
图 1　免疫组化染色法测定人 Bel-7402肝癌细胞分泌的 VEGF(×100)
A.溶剂对照组　B、C、D. 分别为蛇葡萄素 12. 8μg /m l、25. 6 μg /m l、38.4 μg /m l浓度组
图 2　免疫组化染色法测定人 Bel-7402肝癌细胞分泌的 bFGF(×100)
A.溶剂对照组　B、C、D. 分别为蛇葡萄素 12. 8μg /m l、25. 6 μg /m l、38.4 μg /m l浓度组
　表 4　　　　　蛇葡萄素对裸鼠移植性人肝癌
Bel-7402增殖的抑制实验
分组 动物数实验前 /实验后 体重变化(g) 瘤重(g) 抑瘤率%
阴性对照组 15 /15 　 1.99±2. 42 0. 61±0. 19 /
溶剂对照组 12 /12 　 1.88±1. 19 0. 70±0. 31 /
环磷酰胺组 12 /12 - 0.12±3. 48 0. 43±0. 22 29. 5
高剂量组(200 m g /kg) 13 /13 　 0.32±2. 88 0. 38±0. 17 45. 7
中剂量组(150 m g /kg) 17 /17 　 1.30±1. 12 0. 41±0. 18 41. 4
低剂量组(100 m g /kg) 16 /16 　 0.14±3. 93 0. 53±0. 33 24. 3
4　讨论
血管生成是实体瘤生长和转移过程中的特性表
现 ,内皮细胞的生长在血管生成的过程中起着最直
接的作用 。抑制血管内皮细胞增殖 、促进其凋亡 /死
亡是所有抑血管生成药物的最终治疗目的〔1、2〕。血
管内皮细胞是进行抗血管生成药物筛选的主要细
胞 ,常用的有人脐静脉血管内皮细胞 ECV304和牛
主动脉内皮细胞(BAEC)等 。内皮细胞和肿瘤细胞
共培养可以在体外较好地模拟体内内皮细胞和肿瘤
细胞的相互作用 。本实验采用 MTT法观察了蛇葡
萄素对 BAEC增殖的影响 ,发现蛇葡萄素可有效抑
149中药材第 29卷第 2期 2006年 2月
制 BAEC的增殖 ,抑制率可高达 88.1%。提示蛇葡
萄素也许能有效抑制肿瘤血管生成。
VEGF和 bFGF在许多肿瘤细胞中都高度表达 。
通过检测物质对肿瘤细胞血管生成因子分泌的影响
可推测出该物质能否抑制血管生成。体外培养的肿
瘤细胞加入受试物作用后 ,可通过应用免疫组化法 、
蛋白质印迹法等技术检测细胞血管生成因子表达的
变化;应用 ELISA法 、同位素标记法等检测培养细
胞上清液中血管生成因子的含量;应用 RT-PCR法 、
N orthern印迹法等检测细胞血管生成因子及其受体
mRNA的表达变化 。本实验选择分泌 VEGF和 bF-
GF均比较高的肝癌细胞作为实验对象 ,先用免疫组
化法检测 ,发现所有细胞均合成这 2种因子 ,而蛇葡
萄素组的合成量明显减少。为了进一步确定抑制
率 ,我们选择了 ELISA法测定细胞上清液中生成因
子的分泌 ,又选择流式细胞仪测定细胞内生成因子
的合成。实验结果表明 25.6 μg /m l蛇葡萄素能有
效地抑制人肝癌 Bel-7402细胞合成 VEGF和 bFGF。
本实验室以前的实验结果证实蛇葡萄素具有显
著抑制肿瘤细胞侵袭与转移的作用〔2〕 ,本实验还观
察到蛇葡萄素可有效抑制人肝癌 Be l-7402裸鼠移
植瘤的增殖 ,蛇葡萄素的这些作用可能与其能有效
抑制内皮细胞的增殖 、抑制人肝癌 Bel-7402细胞
VEGF及 bFGF的表达 ,从而抑制肿瘤血管生成密切
相关 ,提示蛇葡萄素也许可作为一个肿瘤血管生成
抑制剂用于肿瘤防治 ,但其体内抑血管生成作用还
有待于进一步的证实。
参 考 文 献
[ 1] Neri D, B ickne ll R. Tum ou r vascular ta rge ting. Na t Rev
Cance r, 2005, 5(6):436-446.
[ 2] Toze r GM , Kan thou C , Bagu ley BC. D isrupting tum our
blood vessels. Nat Rev C ancer, 2005, 5(6):423-435.
[ 3] Imu ra S, M iyakeH , Izum i K, et a l. Co rre la tion o f vascu-
lar endo the lia l ce ll p ro life ra tion w ith m ic rovesse l density
and expre ssion o f vascu lar endo thelia l g row th factor and
basic fibrob last g row th factor in hepa toce llular ca rc inom a. J
M ed Invest, 2004, 51(3-4):202-209.
[ 4] 刘培育 , 丘明祈 ,梁婷韵 .无莿根中蛇葡萄素的提取及
其对黑色素瘤的抑制作用 .中山医科大学学报 , 1999,
20(2):127-129.
[ 5] 刘德育 , 郑宏强 ,罗高琴 .蛇葡萄素体内外侵袭和转移
的抑制作用 .中国中药杂志 , 2003, 28(10):957-961.
[ 6] 柴伟栋 , 范萍 ,沈捷 , 等 .胎牛主动脉内皮细胞的培养 .
南京医科大学学报 , 2000, 20(3):173-175.
[ 7] Xin L, Xu R, Zhang Q, e t a l. K ring le 1 o f hum an hepa to-
cy te grow th fac to r inhibits bov ine ao rtic endothelia l cell
p ro life ra tion stim ula ted by basic fib roblast g row th fac to r and
causes ce ll apop to sis. B iochem Biophy s Res C omm un,
2000, 277:186-190.
(2005 - 08 -15收稿)
Inhib itory Effects ofAmpe lopsin on Angiogenesis
LUO Gao-qin, ZENG Sa, L IU De-yu
(Schoo l of Pharm aceu tical S ciences, Sun Ya t-sen University, Guangzhou 510089, China)
Abstrac t　Objective:To study the e ffec t of am pe lopsin on ang iogene sis. M ethods:The an ti-ang iogenic e ffec t w as eva luated by
M TT assay fo r pro liferation of endo the lia l cells. The concentra tion o f va scu la r endo the lial g row th fac to r (VEGF) and basic-fib roblast
g row th facto r(bFGF) from human hepatocellu la r ca rc inom a Bel-7402 cells w ere de te cted by enzym e linked immunoso rban t assay
(ELISA). Immunohistochem ical staining w as conduc ted to detec t the expression of VEGF and bFGF. The VEGF and bFGF in the
cance r cellsw ere exam ined by flow cy tom e try. The inhib itory e ffect of am pe lopsin on the g row th of hum an hepatoce llular carc inom a Be l-
7402 in nudem ice was studied. Resu lts:Ampe lopsin w as shown to inh ibit the p ro life ra tion o f p rim ary cultured bov ine aortic endothe lia l
ce lls in a concen tra tion dependen tm anner in range of 6.4 ～ 51. 2 μg /m l. The IC50(50% inhibition concentration) va lue was 22.0 ±
4. 0μg /m l. ELISA assay w as show n tha t trea tm entw ith 12. 8μl /m l, 25.6μl /m l and 38.4 μg /m l of ampelopsin resu lted in an inh ibi-
tion o f VEGF production re leased by Be l-7402, and the inbibtito ry ra te w as 14. 2%, 40. 0% and 49. 6%, respec tively. A fter exposure
to 12. 8μg /m l o f ampe lopsin, a decrease in the expression and ac tivity o fVEGF and bFGF w as obse rved by imm unoh istochem ica l stai-
ning. The concen tra tion of VEGF and bFGF secre tion by Be l-7402 ce llsw ere low er fo llow ing ampe lopsin treatm ent as shown by flow cy-
tom e try. T rea tm entw ith 25.6 μg /mL and 38. 4 μg /m l o f ampe lopsin, the inbib itory ra te s w ere 32.2% and 57. 4% fo rVEGF, and
54.9% and 62.6% for bFGF, re spective ly. The inhibito ry ra te o f am pe lopsin to the grow th of the transp lant tum o r in nudem ice w ere
24.3%、41.4% and 45.75 respective ly a t the do se o f 100 m g /kg、150 mg /kg and 200 mg /kg. Conc lusion:Ampe lopsin is a po ten t in-
hibito r of VEGF and bFGF exp ression and p roduction in hum an hepatocellu la r carcinoma Be l-7402 ce ll, and m ay be a prom ising angio-
gene sis inh ibito r.
K ey words　Am pe lopsin;Endothe lia ce ll;H um an hepatocellu la r ca rcinom a Be l-7402 ce ll;Ang iogenesis;VEGF;bFGF
150 中药材第 29卷第 2期 2006年 2月