全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
含绿色荧光蛋白标记的木霉表达载体的构建
吕天晓 1, 2 　李世贵 1 　顾金刚 1 　姜瑞波 1 　牛永春 1
(1 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 中国农业微生物菌种保藏
管理中心 ,北京 100081; 2 东北农业大学资源与环境学院 ,哈尔滨 150030)
　　摘 　要 : 　ACCC 30150是由本实验室筛选的一株对黄瓜枯萎病、青椒疫病等多种土传病害具有较好防治效果的长柄木霉
生防菌 ,为研究其在蔬菜根际的定殖情况 ,本试验将含绿色荧光蛋白 ( GFP)和潮霉素 B抗性的融合基因交换整合到真核表达
骨架载体 pNOM102上。通过酶切鉴定和测序鉴定证明目的片段与载体片段连接正确 ,木霉表达载体 pNOM102 - HygEGFP构
建成功 ,为下一步进行生防木霉根际定殖研究奠定基础。
关键词 : 　载体构建 　绿色荧光蛋白 　潮霉素 B抗性 　表达载体 　木霉
The Construction of Vector Conta in ing Green Fluorescent
Prote in Marker and Expressing in Trichoderm a spp.
Lv Tianxiao1, 2 　L i Shigui1 　Gu Jingang1 　J iang Ruibo1 　N iu Yongchun1
(1 Institu te of Agricultural R esources and R egional Planning, Chinese Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100081;
2 Resources and Environm ental Sciences College, N ortheast Agricultural University, Harbin 150030)
　　Abs trac t: 　ACCC 30150 was the biocontrol strain of which could effectively control many kinds of p lant diseases by this laboratory
screening. In order to study its colonization in the vegetables rhizosphere, the fusion gene containing green fluorescence p rotein ( GFP)
and hygromycin B resistance was exchanged and conformed to frame2vector pNOM102 which could be exp ressed in eukaryote. It was
p roved that the connection between the goal fragment and the vertor fragment was correct by identification of enzyme2cutting and se2
quence2measured. The successful construction of pNOM1022HygEGFP would establish base for research on rhizosphere colonization of
Trichoderm a spp. in the future.
Key wo rds: 　Vector construction　Green fluorescence p rotein ( GFP) 　Hygromycin B resistance　Exp ression vector　Trichoder2
m a spp.
收稿日期 : 2009204208
基金项目 :中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金 (2009年度 )
作者简介 :吕天晓 (19842) ,女 ,汉族 ,黑龙江省哈尔滨人 ,硕士 ,研究方向 :农业微生物
通讯作者 :李世贵 ,研究方向 :微生物分子生物学 ; Tel: 0102821086512617, E2mail: shiguili2002@yahoo. com. cn　　作为荧光分子标记和报告基因 , GFP具有许多其他荧光蛋白所不具备的优良特性 ,因而近些年来已成为生命科学研究中广泛应用的一类分子标记。目前 ,国内外已有大量有关 GFP标记转化菌株的文献报道 [ 1～ 6 ] ,但利用 GFP对长柄木霉生防菌进行荧光标记尚未见报道。潮霉素 B 是由吸水链霉菌(S treptom yces hyg roscopicus)发酵产生的抗生素 ,对真菌有较强的抑制作用 [ 7 ] ,被广泛用于真菌转化菌株的筛选 [ 8, 9 ]。利用 GFP和潮霉素 B抗性的融合基因和真核表达载体 pNOM102 构建木霉表达载体 pNOM1022HygEGFP,为下一步转化长柄木霉生防菌 ,进行生防木霉根际定殖研究奠定基础。1　材料111　菌株与质粒真核表达载体 pNOM102,质粒 pGEMT2easy2Hy2gEGFP (携带 HygEGFP融合基因 ) ,保存在大肠杆菌中 ,由中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏。大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,购自北京全式金生物技术有限公司。112　生化试剂与试剂盒
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
限制性内切酶 B am H I、N co I、B spH I、Hind III, T4
DNA连接酶等均购自大连宝生物工程有限公司 ;试
剂盒 :质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒 (OMEGA2Gel
Extraction Kit)均购自北京博大泰克生物基因技术有
限责任公司 ; PCR SuperM ix和 DNA Marker(DL2000、1
kb Plus、1 kb DNA Ladder、精准定量 Marker Ⅲ)购自
北京全式金生物技术有限公司 ; Hygromycin B (潮霉
素 B)购自 Sigma公司 ;氨苄青霉素及其他生化试剂
均购自江晨宏伟生物科技有限责任公司。
113　培养基与溶液
11311　固 (液 )体 LB培养基 ( g /L ) 　胰蛋白胨 10;
NaCl 10;酵母抽提物 5;琼脂 20。
11312　氨苄青霉素贮存液 　配制成 100 mg/m l的
溶液 ,用 0. 22μm微孔滤膜过滤除菌 , - 20℃保存。
11313　Hygromycin B贮存液 　配制成 50 mg/m l的
溶液 , - 4℃保存。
11314　TBE缓冲液 (5 ×) 　Tris碱 54 g,硼酸 27. 5
g, 0. 5 mol/L EDTA (pH8. 0) 20 m l,加灭菌去离子水
定容至 1 L。室温保存 ,使用时稀释至 1倍。
2　方法
211　大肠杆菌的活化和质粒的提取
分别取 2 m l含有质粒 pNOM102和 pGEMT2eas2
y2HygEGFP的大肠杆菌菌液加入到 50 m l添加了
100μg/m l氨苄青霉素和 100μg/m l HmB的新鲜液
体 LB培养基中 , 37℃, 200 r/m摇床培养 10 h。参
照博大泰克质粒提取试剂盒说明书操作流程 ,分别
提取质粒 pNOM102 和 pGEMT2easy2HygEGFP。测
定所提质粒的 OD260 ,以确定其浓度。DNA 浓度
( ng/μl) =OD260 ×50 ×稀释倍数。
212　目的片段的获取
21211　PCR引物的设计与合成 　根据 2HygEGFP2
融合基因片段上、下游 DNA序列设计引物。
上游引物 LTX2F: 2CGGCGGTCATGAAAAAGC2
CTGAA2(含 B spH I酶切位点 )
下游引物 LTX2R: 2CGGCGGATCCTTACTTGTA2
CAGCT2(含 B am H I酶切位点 )
引物由上海英骏生物公司合成。由于潮霉素磷
酸转移酶基因序列内部含有一个 N co I酶切位点 ,
所以设计引物时引以 N co I的同尾酶 B spH I序列代
替 N co I序列。
21212　目的片段的 PCR扩增 　由于利用酶切回收
的方法难以获得 HygEGFP片段 ,因此采用 PCR扩
增的办法得到该目的片段。反应体系 : DNA模板 <
0. 5μg ( 2μl) ; LTX2F ( 10μM ) 2μl; LTX2R ( 10
μM ) 2μl; 2 ×Easy Taq PCR SuperM ix 25μl; ddH2 O
补至 50μl。反应条件 : 94℃预变性 6 m in; 94℃变性
30 s, 56℃退火 30 s, 72℃延伸 100 s, 33个循环 ;
72℃延伸 10 m in, 4℃保温。
21213　PCR产物酶切纯化 　将所得 PCR产物分别
用内切酶 B spH I、B am H I进行酶切 ,以得到与载体
片段相匹配的粘性末端 ,酶切产物用凝胶回收试剂
盒回收。
213　载体片段的获取
pNOM102酶切及片段纯化回收 :分两次酶切 ,
第一次酶切 100μl反应体系 : B am H I 5μl; 10 ×K
buffer 15 μl; 0. 1% BSA 10 μl; 质粒 DNA 10 μl;
ddH2 O 补至 100μl。酶切反应条件 : 37℃, 4 h。第
一次酶切 100μl反应体系 : N co I 5μl; 10 ×K buffer
15μl; 0. 1%BSA 10μl;线性 DNA (B am H I酶切后 )
10μl; ddH2 O 补至 100 μl。酶切反应条件 : 37℃,
4 h。取 5μl酶切产物进行电泳 ,电泳结束后 ,在紫
外灯下 ,用锋利洁净的手术刀片小心将所需片段
(即真核表达载体框架 )切取下来 ,放到一个干净、
已称重的 1. 5 m l离心管中 ,按照凝胶回收试剂盒说
明书进行回收操作。
214　DNA片段连接
10μl反应体系 : vector DNA 4μl; insert DNA 2
μl; L igase 10 ×Buffer 1μl; T4 DNA L igase (W eiss u2
nits) 0. 3μl; ddH2 O补至 10μl。反应条件 : 4℃过夜
连接 (约 12 h)。
215　连接产物转入大肠杆菌
取 50μl冰浴上融化的大肠杆菌 DH5α感受态
细胞 ,加入连接产物 10μl,轻轻混匀 ,在冰浴中放置
30 m in。42℃水浴中热激 45 s,然后快速将管转移
到冰浴中 2 m in,该过程不要摇动离心管。向离心管
中加入 500μl无菌的液体 LB 培养基 (不含抗生
素 ) ,混匀后置于 37℃, 200 r/m培养 1 h,使细菌复
苏。12 000 r/m in离心 1 m in,弃去上清 LB培养基 ,
剩余 100μl左右 ,以增大细胞浓度。用枪头轻轻搅
拌沉淀 ,反复吹打几次 ,将其与剩余培养基混合均
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2009年第 9期 吕天晓等 :含绿色荧光蛋白标记的木霉表达载体的构建
匀。将混合后的已转化的感受态细胞全部加到含有
100μg/m l Amp和 100μg/m l HmB双抗的 LB琼脂
培养基上 ,将细胞均匀涂开 ,将平板置于 37℃至液
体被吸收 ,倒置平板 , 37℃过夜培养。18 h后 ,在平
板上出现一定数量的、直径约为 2. 5 mm的单菌落。
培养时间不应超过 24 h,否则会在转化菌落周围长
出未被转化的、对 Amp无抗性的卫星菌落。用灭菌
牙签随机挑取平板上长势较好的阳性克隆 8个 ,分
别放到装有 5 m l 100μg/m l Amp和 100μg/m l HmB
液体 LB培养基的无菌小瓶中 , 37℃, 200 r/m in,过
夜培养 , 4℃保存。
216　重组子 pHygEGFP的酶切鉴定
先用 EcoR I对 8个阳性克隆的质粒进行酶切
鉴定。反应体系 : Eco R I 0. 5μl; 10 ×H buffer 1
μl;重组质粒 2μl; ddH2O补至 10μl。选取酶切图谱
正确且条带较亮的 2号重组质粒 ,再用 H ind III对其
进行酶切鉴定。反应体系 : Hind III 0. 5μl; 10 ×M
buffer 1μl; 2号重组质粒 2μl; ddH2O补至 10μl。
217　重组子测序鉴定
以载体片段两端上下游 100 bp左右处的两段
序列为模板合成载体引物。 F1: 2GTACTTTGCTA2
CATCCATAC2; R1: 2TCTTATCGAGATCCTGAACA2。
以 F1, R1为引物 ,对连接产物进行测序 (由英骏生
物技术有限公司完成 ) ,检验连接是否正常。
3　结果与分析
311　菌体的活化和质粒的提取
测定所提质粒的 OD260 ,以确定其浓度。测定结
果为 OD260 (pNOM102) = 0. 071,计算出 pNOM102
浓度为 350 ng/μl。OD260 ( pGEMT2easy2HygEGFP)
= 0. 039,计算出 pGEMT2easy2HygEGFP浓度为 195
ng /μl。
312　目的片段的 PCR扩增
以 LTX2F 和 LTX2R 为引物 ,以质粒 pGEMT2
easy2HygEGFP模板进行 PCR, PCR产物琼脂糖凝胶
电泳得到大小约为 1. 7 kb的条带 (图 1) ,与实际长
度相符 (HygEGFP融合基因片段长度为 1 676 bp ) ,
说明引物设计及 PCR反应程序设计均符合扩增要
求。将所得 PCR产物分别用内切酶 B spH I、B am H I
进行酶切 ,以得到与载体片段相匹配的粘性末端 ,酶
切产物的电泳图谱见图 2。
M. 1 kb Plus Ladder; 1、2. 目的片段 PCR扩增产物
图 1　PCR产物电泳图谱
M. Marker III; 1、2. 酶切片段
图 2　PCR产物酶切纯化后片段的电泳图谱
313　pNOM102酶切及片段纯化回收与重组载体的
获得
先用限制性内切酶 B am H I对 pNOM102进行
M. 1 kb Plus Ladder; 1、2. 酶切片段
图 3　载体酶切回收电泳图谱
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
酶切 ,再用 N co I酶切 ,酶切产物琼脂糖凝胶电泳后
产生 1. 8 kb和 5. 8 kb的两条条带 (图 3) ,小片段为
GUS基因 ,大片段即为真核表达载体的框架。将目
的片段的 PCR扩增产物的酶切片段与载体片段连
接成重组质粒载体 pNOM1022HygEGFP (图 4)。
图 4　pNOM 1022HygeGFP质粒图谱
314　重组子的鉴定
31411　酶切鉴定结果 　先用 EcoR I对 8个阳性克
隆的质粒进行酶切鉴定。由于 HygEGFP片段内有
一个 EcoR I酶切位点 ,而在 pNOM102载体的起始位
点处也有 1个 EcoR I酶切位点 ,故用 EcoR I内切酶
对连接后的 pNOM1022HygEGFP进行单酶切时 ,会
形成长度分别为 2. 54 kb和 5 kb的两个片段 (图
5)。又由于在质粒 pNOM1022HygEGFP内有 1个单
一的 H ind III酶切位点 ,当用 H ind III内切酶对其进
行单酶切时 ,会将其切成长度稍大于质粒长度的线
M. 1 kb DNA Ladder; 1～8. 重组子 EcoR I酶切片段
图 5　重组子的 EcoR I单酶切电泳图谱
状 DNA (图 6)。酶切图谱与理论结果一致 ,均获得
正确的条带 ,说明载体与片段连接正确。
M. 1 kb DNA Ladder; 1. 2号重组子 EcoR I酶切片段 ;
2. 2号重组子 H ind III酶切片段
图 6　2号重组子的酶切电泳图谱
31412　测序鉴定结果 　取 pNOM1022HygEGFP 2号
菌液进行测序 ,将测序结果拼接 ,去除载体片段后将
获得的剩余序列 ,用 BLAST进行比对 ,序列正确。
从上述酶切鉴定及测序鉴定结果表明 ,含 GFP
标记的木霉表达载体 pNOM1022HygEGFP已成功构
建 ,为下一步转化长柄木霉生防菌 ,进行生防木霉根
际定殖研究奠定了基础。
4　讨论
菌体活化时间不应超过 12 h,因为时间过长 ,对
氨苄青霉素具有抗性的菌体会将其β2内酰胺酶分
泌到培养基中 ,灭活周围的抗生素 ,那些对抗生素敏
感的杂菌就会大量生长。试验的过程中发现 ,在用
内切酶 B am H I和 N co I对质粒 pNOM102进行酶切
的过程中 ,虽然两种酶具有通用的缓冲液和酶切条
件 ,但还是要分两次单酶切 ,而且要先 B am H I酶切 ,
再 N co I酶切 ,顺序不能颠倒。因为 , pNOM102质粒
长度为 7 599 bp, 1～2 900 bp为启动子区域 , GPD
启动子下游的 2 300 bp处通过 N co I酶切位点与
GUS基因连接 , GUS基因的中止密码子在 4 113 bp
处通过 B am H I位点与 TrpC中止子相连。在 GUS基
因 B am H I位点的外侧也有一个 N co I酶切位点 ,该
位点与 B am H I位点紧紧相邻 ,共用一个碱基对 ,如
果不是先后分开酶切的话 ,片段的两端就会产生相
同的 N co I粘性末端 ,这样当目的片段与载体连接
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时 ,极有可能产生载体自连的现象。另外 ,由酶切及
测序结果可以得出结论 ,含 GFP标记的木霉表达载
体 pNOM1022HygEGFP构建成功 ,为下一步的原生
质体转化提供了必备的前提。
参 考 文 献
1　 B loemberg GV, Tooe GA, Lugtenberg BJ J, Kolter R. AEM, 1997,
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