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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
pH值对 FO XO1、GDF28基因反义
RNA寡核苷酸吸收的影响
丛浩龙 1, 2 　刘建玲 1 　杨倬 2 　孙仑泉　刘长梅 2
(1 西北大学 ,西安 710069; 2 中国科学院微生物研究所 ,北京 100101)
　　摘 　要 : 　研究不同 pH值下 ,口服靶向 FOXO1与 GDF28基因反义 RNA寡核苷酸药物对药效的影响。化学合成靶向
FOXO1与 GDF28基因的有效反义 RNA寡核苷酸片段 ,调节药物 PH值 ,通过灌胃方式给药 ,给药 20 d后处死小鼠 ,进行体重 ,
腿部肌肉增长情况分析。提取腿部肌肉组织总 RNA,用 real time PCR检测 FOXO1与 GDF28基因的表达。结果表明 ,服用
RNA oligos的试验组小鼠腿部肌肉重量均比对照组肌肉重量增长快。其中 pH为 710的 RNA oligos的效果比 pH为 510的效
果好 , pH910的 RNA oligos的作用效果最弱。与小鼠体重变化结果一致 , real time PCR检测实验组 FOXO1与 GDF28基因转录
水平较对照组均有明显下降 ,其中服用 pH为 710的 RNA oligos的下降最多。因此 ,口服靶向 FOXO1与 GDF28基因的反义
RNA寡核苷酸药物的最适 pH值应为中性偏酸。
关键词 : 　肌肉萎缩 　RNA干扰 　pH值 　FOXO1　GDF28
The Influence of pH Value on the Absorption of RNA Interference O ligos
of FOXO1 and GDF28 Gene
Cong Haolong1, 2 　L iu Janling2 　Yang Zhuo2 　Sun Lunquan2 　L iu Changmei1
(1 N orthwest University, X i′an 710079; 2 Institu te of M icrobiology, Chinese Academ y of Science, B eijing 100101)
　　Abs trac t: 　 It was to evaluate the influence of pH value on the absorp tion of antisense RNA oligos targeted to FOXO1 and GDF281
Antisense RNA oligos was synthesized to adjust the pH value of the dissolved RNA solution1 After 20 days feeding, the body wight of
m ice and the muscle quality of thigh were analysized1 Total RNA s from the thigh skeletalmuscleswere isolated and real time PCR anal2
ysis of FOXO1 and GDF28 gene was done1 Results showed that the m ice fed effective RNA oligos had more thigh muscle mass compared
with control group1 Real time PCR results showed that the FOXO1 and GDF28 gene transcrip tion levels decreased rap idly compared
with control group s1 Thus, the most app rop riate pH value for absorp tion of antisense RNA oligos targeted to FOXO1 and GDF28 is acid2
ity or neutral1
Key wo rds: 　Muscle atropy　RNA interference　pH value　FOXO1　GDF28
收稿日期 : 2008212229
基金项目 :国家自然科学基金 (2007AA021505)
作者简介 :丛浩龙 (19802) ,硕士 ,研究方向 :微生物学
通讯作者 :刘建玲 , E2mail: ljl2003 ljl@1261com　　肌肉萎缩是由饥饿、癌症、糖尿病等多种系统性疾病导致的蛋白质的持续性降解 ,进而使肌肉体积缩小、肌纤维变细甚至消失 [ 1 ]。传统治疗肌肉萎缩的方法主要是注射生长激素 ,但在肌肉质量不断增加的同时 ,肌肉细胞数量也在不断增长 ,有可能导致细胞分裂失控、混乱扩散从而引发肿瘤 [ 2 ]。通过注射肌细胞生长负调控因子的抗体 ,可以达到提高肌 肉质量的目的 ,但往往会引发免疫反应 [ 3 ]。应用反义 RNA技术对肌肉萎缩的治疗有着良好的前景 ,通过直接注射或服用有效的干扰片段 ,或通过逆转录病毒 ,腺病毒载体 ,可以降低一些肌细胞生长负调控因子的表达量 ,从而促进肌细胞生长与分化 ,提高肌肉质量 , 达到理想的基因治疗目的 [ 4 ]。在肌肉萎缩发生的信号通路中 , FOXO1 ( fork2
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
head box o21 ) 与 GDF28 ( growth and differentiation
factor 28)是较为重要的两种因子。 FOXO1 为一种
FOXO转录因子家族中的参与肌肉萎缩发生的关键
性因子 ,低水平的胰岛素或 IGF21 ( insulinlide growth
factor1, IGF21) ,高水平的肾上腺皮质激素都会促进
FOXO转录因子进入细胞核 [ 5 ] ,导致肌细胞特异性
的蛋白酶体成分 E3 的大量表达的同时 [ 3 ] ,也诱导
自噬相关基因的表达 ,在细胞中形成自噬体。两种
途径都增加肌细胞蛋白质分解 ,并最终导致肌肉萎
缩的发生 [ 6 ]。GDF28又名肌细胞生长抑制素 ,属于
转化生长因子家族 ,是肌肉生长发育的负性调控因
子 ,其功能在不同种属间高度保守 ,主要是抑制成肌
细胞的增殖 ,缺失 GDF28基因的小鼠有肌肉过度生
长的现象 [ 8 ]。
反义 RNA是指与 mRNA或 DNA互补的小型单
链 RNA分子 ,其长度一般小于 200 bp,它导入靶细
胞后 ,形成 DNA /RNA或 mRNA /RNA杂交双链 ,从
而抑制基因表达。反义 RNA 主要通过影响真核
mRNA前体的拼接、转移、修饰等途径来发挥作用。
由于反义寡核苷酸能够抑制特定致病基因的表达 ,
可以通过化学合成或基因工程的方法合成反义
RNA ,阻断某个基因的功能 ,该技术现在已处于各种
疾病治疗的临床试验阶段。
直接服用化学合成的片段虽然面临药物靶向性
差 ,药效持续时间短等缺点 ,但却是最方便的给药方
法。影响直接口服疗效的因素有很多 ,如消化道的
环境。因此推测 ,肌体对于不同 pH值的 RNA oligos
的药物吸收水平可能会不同。随着小 RNA技术的
发展 ,近年来有通过干扰 FOXO1 与 GDF28基因来
治疗肌肉萎缩的报导 [ 9 ]。本试验选取了 FOXO1与
GDF28作为抑制的靶基因 ,通过化学合成针对两个
靶基因的有效的反义 RNA寡核苷酸 ,对它们在不同
PH值给药时的作用效果进行了研究。
1　材料与方法
111　靶向 FOXO1和 GDF28基因的反义 RNA的合成
靶向 FOXO1和 GDF28基因 RNA反义 RNA由
O ligos Etc Inc (O regon)合成 ,并经过 2’2O2甲基和 3’2
丁醇基联合修饰 , HPLC纯化。
112　试验用小鼠和主要试剂
54只饲养 6～8周、体重在 15～18 g的雌性
BALB /c小鼠购自中国科学院遗传与发育研究所。
TR IZOL试剂 ( Invitrogen)、Takara公司 DNA酶、AB
公司的 SYBR green master m ix试剂盒、Imp rom II
逆转录酶 ( Promega)。
113　给药
将合成的 RNA片段由 DEPC处理的水溶解至
10 mg/m l,调节 pH值至 5、7、9 。将小鼠分为 9组 ,
每组 6只。灌胃方式给药 ,每只小鼠一次给药 100
μg,每两天给药一次 ,每天称重。最后一天收集小
鼠肌肉称重并进一步分析。
114　小鼠腿部肌肉称重
处死小鼠 ,并取其大腿 ,小腿 ,称量重量。
115　FOXO1、GDF28 mRNA的实时定量 PCR检测
取小鼠后腿肌肉 ,迅速置于液氮中 ,研磨后 , TR2
IZOL试剂提取总 RNA。115%琼脂糖凝胶检测完整
性。DNA酶去除基因组 DNA,测定 RNA浓度 ,并定量 ,
应用 Improm II 逆转录酶和 oligo (d) T引物合成 cDNA。
应用 SYBR green mastermix试剂 ,及 B iosystem s Prism
7000系统 ,进行相对定量计算 , Beta2actin作为相对定
量的内参照 ,每个样品重复 3次 , PCR反应条件 :预变
性 95℃, 10 min; 95℃, 15 s; 60℃, 60 min; 40个循环。检
测 PCR的引物为 (5′→3′) :Myostatin forward: CAGAC2
CCGTCAAGACTCCTACA, Myostatin reverse: CAGTGC2
CTGGGCTCATGTCAAG; FOXO1 forward: GTACGC2
CGACCTCATCACCA, FOXO1 reverse: TGCTGTCGC2
CCTTATCCTTG; Beta2actin forward: GAACCCTAAGGC2
CAACCG TGAA, Beta2actin reverse: CTCAGTAACAGTC2
CGCCTAGAA。
2　结果与分析
211　小鼠体重变化
小鼠给药后 ,每天称量其体重 ,检测小鼠对药
物有无不良反应。从结果可以看出 (图 1,图 2) ,所
有试验组的体重变化情况与对照组相当 ,可以排除
药物对小鼠生理状况的不良影响。
212　小鼠腿部肌肉重量变化
由于 FOXO1和 GDF28在骨骼肌的生长和分化
中有着至关重要的作用 ,因此小鼠腿部肌肉 ,尤其是
大腿的质量可以直接反映靶向 FOXO1和 GDF28基
因反义 RNA 药物的治疗效果。由于药物的治疗
效果受给药剂量 ,药物的稳定性 ,药物吸收量 ,给药
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2009年第 6期 丛浩龙等 : pH值对 FOXO1、GDF28基因反义 RNA寡核苷酸吸收的影响
图 1　FO XO 1试验组小鼠体重变化
图 2　GD F28试验组体重变化
对象等多种因素的影响 ,因此在相同的给药剂量和
饲养条件下 ,腿部肌肉的重量可以说明靶向 FOXO1
和 GDF28基因的反义 RNA在不同 pH值给药时的
吸收效果。通过比较试验组的大腿重量平均值 ,发
现靶向 FOXO1反义 RNA的 pH510和 710试验组大
腿肌肉重量平均值均比对照组高 ,而 pH 910的试验
组其大腿肌肉重量平均值却与对照组相当。因此口
服靶向 FOXO1基因的反义 RNA , pH 510 与 710有
着类似的吸收效果 ,均好于 pH 9的吸收效果 (图
3)。同样 ,靶向 GDF28 基因的反义 RNA的结果与
FOXO1基因一致 (图 4)。GDF28 pH 510与 710 的
效果也要优于 GDF28 910 。
213　小鼠腿部肌肉与体重比值的变化
不同个体其肌肉增加的绝对量不同 ,为了排除
小鼠间个体差异对肌肉质量增加值的影响 ,参照小
鼠腿部肌肉与其体重的比值。 FOXO1 510、FOXO1
710、GDF28 510与 GDF28 710的腿部肌肉质量总和
均大于对照组 (图 5)。腿部肌肉与小鼠体重的比值
也均比对照组大 ,而 GDF28 910与 FOXO1, 910的腿
部肌肉质量总和腿部肌肉与小鼠体重的比值与对照
组相当 (图 6)。所以从结果来看 ,服用 RNA oligos
的试验组小鼠肌肉重量均比对照组肌肉重量增长
快。其中 pH为 710的 RNA oligos的效果比 pH为
510的效果好 ,而 pH 910的 RNA oligos的作用效果
最弱。与小鼠体重变化结果一致。
11后左小腿 ; 21后左大腿 ; 31后左小腿 ; 41后右大腿 ; 51前左小腿 ;
61前左大腿 ; 71前右小腿 ; 81前右大腿
图 3　FO XO 1试验组、对照组大腿与小腿重量比较
11后左小腿 ; 21后左大腿 ; 31后左小腿 ; 41后右大腿 ; 51前左小腿 ;
61前左大腿 ; 71前右小腿 ; 81前右大腿
图 4　GD F28试验组、对照组大腿与小腿重量比较
11FOXO1 510 ; 21FOXO1 710 ; 31FOXO1 910 ; 41GDF28, 510;
51GDF28, 710; 61GDF28, 910; 71Mock, 510; 81Mock, 710;
91Mock, 910
图 5　FO XO1、GD F28试验组与对照组腿部总肌肉重量比较
214　real time RT2PCR结果
由于 MyoD在其他类型细胞转化为成肌细胞和
成肌细胞分化为肌管的过程中起重要作用 ,是一种
正调控因子 ,在 FOXO 1与 GDF 28基因表达量低的
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
11FOXO1 510 ; 21FOXO1 710 ; 31FOXO1 910 ; 41GDF28, 510;
51GDF28, 710; 61GDF28, 910; 71Mock, 510; 81Mock, 710; 91Mock,
910
图 6　FO XO1、GD F28试验组与对照组腿部总肌
肉重量与体重比值比较
情况下 , M yoD 基因表达量会升高 [ 12 ] ,因此检测
M yoD 基因的转录水平可以间接说明 FOXO1 与
GDF28基因的干扰效果。以反转录的 cDNA为摸板
进行实时荧光定量 PCR分析 FOXO 1 、GDF28、M yoD
基因 mRNA的转录水平。
结果表明 ,与对照组相比 , FOXO1 510、FOXO1
710中 FOXO1基因的表达量均比对照组的有明显
的降低 ,其中以 FOXO1 710下降最为明显 , FOXO1
910中 FOXO1基因表达量无明显变化 , FOXO1所有
试验组 GDF28基因表达量无明显变化。GDF28 510
与 GDF28 710中 GDF28基因的表达量比对照组有
明显的下降 ,以 GDF28 710下降最为明显 , GDF28
910 GDF28的表达量与对照组相当 , GDF28试验组
中 FOXO1基因表达两无明显变化 (图 7,图 8)。说
明 GDF28与 FOXO1干扰片段在中性偏酸的情况下
干扰效果更佳 ,与腿部重量图一致。所有试验组中
M yoD 基因的表达量相对对照组都有所上升 ,以
GDF28 710和 FOXO1 710中上升量最为明显 (图
9) ,说明 GDF128 710和 FOXO1 710的吸收效果最
好 ,与上述结果一致。
3　讨论
很多疾病 ,如肌源性疾病、神经性疾病和代谢性
疾病发生时都会影响到骨骼肌。当肌肉出现萎缩、
消瘦、老化或者是废用时 ,骨骼肌都会出现萎缩。肌
肉萎缩疾病属于肌病和运动神经元病 ,是目前世界
上难以医治的一类疾病 ,这些病常因肌无力和肌肉
萎缩导致患者失去生活能力甚至引起死亡。肌肉萎
11FOXO1 510 ; 21FOXO1 710; 31FOXO1 910; 41GDF28, 510; 51GDF2
8, 710; 61GDF28, 910; 71Mock, 510; 81Mock, 710; 91Mock,
910; 101Saline
图 7　不同 pH GD F28干扰 RNA oligos对
GD F28基因表达量的影响
11FOXO1 510; 21FOXO1 710; 31FOXO1 910; 41Mock, 510; 51Mock,
710; 61Mock, 910; 71Saline
图 8　不同 pH FO XO 1干扰 RNA oligos对
FO XO1基因表达量的影响
11FOXO1 510 ; 21FOXO1 710 ; 31FOXO1 910 ; 41GDF28, 510;
51GDF28, 710; 61GDF28, 910; 71Mock, 510; 81Mock, 710; 91Mock,
910; 101Saline
图 9　不同 pH GD F28干扰 RNA oligos与不同 pH FO XO 1
干扰 RNA oligos对 M yoD 基因表达的影响
缩疾病包括的种类较多 ,常见的如 :肌源性病变 ,即
遗传因素引起的进行性肌营养不良症是以进行性骨
骼肌萎缩和无力为特征的一类遗传性疾病 ,通常是
在幼年起病 ,如不正确治疗 ,常早年致残并导致死
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2009年第 6期 丛浩龙等 : pH值对 FOXO1、GDF28基因反义 RNA寡核苷酸吸收的影响
亡 ;运动神经元病变引起的肌萎缩侧索硬化 ,进行性
脊髓性肌萎缩等 ;以及其它因素引发的脊髓空洞症 ,
多发性神经根炎 ,周围神经炎等或者外伤或手术等
引起的神经受损或周围神经疾病、小儿麻痹后遗症、
偏侧面肌萎缩症、硬皮病以及多种肌病等。目前尚
无特殊有效的针对性治疗手段及药物。
目前对于骨骼肌萎缩的预防与治疗 ,主要是采
用运动及功能训练、机械刺激以及药物治疗等措施 ,
这些措施对防治骨骼肌萎缩有一定的成效。但是 ,
运动及功能训练、机械刺需要患者的积极配合 ,在制
动 (如骨折固定 ) 、失重及肌肉拉伤等条件下难以实
施 ,而且常常受场所、仪器设备等条件的限制 ;激素、
激动剂、多肽类药物应用范围狭窄 ,毒副作用较大 ,
且有些药物价格昂贵。
虽然 FOXO1和 GDF28基因的过量表达并不是
肌肉萎缩的根本原因 ,但抑制其表达可以刺激卫星
细胞的活化 [ 11 ] ,增加肌细胞和肌管的融合 ,抑制肌
细胞的程序性死亡 ,显著改善病人肌肉生长状况。
利用反义 RNA分子能与特异 mRNA分子互补
的特点 ,设计靶向 FOXO1和 GDF28基因的有效反
义 RNA ,直接或间接地通过调控细胞中 FOXO1 和
GDF28基因的表达 ,能够达到较好的肌肉萎缩的治
疗目的。
通过 RNA干扰来降低 FOXO1 和 GDF28基因
的过量表达是一种治疗肌肉萎缩的新的有效的方
法 ,除了直接服用 FOXO1 和 GDF28基因反义 RNA
oligos,还可以应用直接注射质粒或以腺病毒或逆转
录病毒载体在体内进行稳定的 shRNA干扰 [ 10 ]。
在设计靶向性特意的反义核苷酸序列的前提
下 ,通过改变立体构型及化学修饰 ,即反义寡核苷酸
磷酸糖骨架的磷酸二酯键被一些化学基团修饰 ,如
甲基、乙基和硫 ( PS2ASO s)等方法能够极大的增强
反义核苷酸的稳定性。用多肽取代磷酸二酯键骨架
PS2ASO s具有较强的抗核酸酶的能力、良好的杂交
性能以及在较低浓度下诱导 RNaseH (促进 mRNA
降解 )活性的特点 ,而且合成和纯化也较容易 ,又
具有相当高的水溶性。其不足之处在于 :有非序
列特异性毒性、细胞摄取相对较差。将修饰的反
义 RNA与多聚离子药物载体 ( PLL )连接。由于
PLL带正电荷 ,可与细胞膜非特异结合 ,所以可增
加反义寡核苷酸透过细胞膜的效率。垂环修饰 ,
如胆固醇和磷脂与反义寡核苷酸结合后 ,对细胞
的亲和力可增加 8～10倍。脂质体包裹 ,脂质体
包裹修饰后的反义寡核苷酸不仅可以避免细胞外
环境中核酸酶对其破坏作用 ,而且有利于通过血
脑屏障 ,进入大脑。上述方法中 ,最安全最直接的
方法就是口服反义 RNA oligos。但其面临着一系
列的问题 ,除了靶向性差 ,药效持续时间短等缺点
外 ,还面临药物吸收水平低的问题。
弱酸性药物在胃内的解离度较高 ,吸收较快。
另外高酸性环境还能使某些药物受到不同程度的破
环。RNA oligos药物进入体内的速度除取决于膜的
性质 ,面积及膜两侧的浓度梯度外 ,还与药物的性质
有关。分子量小的 ( 200 Da以下 ) ,脂溶性大的 ,极
性小的较易通过。RNA oligos药物多是弱酸性分
子 ,其离子化程度受其 pKa及其所在溶液的 pH而
定 ,这是影响药物跨膜被动转运 ,吸收分布排泄的一
个可变因素。除此之外 ,肠壁及肝脏代谢酶的灭活
作用 ,胃肠道的生理状况 ,对 RNA oligos药物的吸收
有也明显的影响。
本试验通过检测不同 pH值条件下 ,小鼠对干
扰 FOXO1和 GDF28基因的 RNA oligos的药物作用
的反应 ,评价了不同 pH条件对 RNA oligos药物吸
收的影响 ,证明了在中性偏酸的条件下给药 , RNA
oligos的吸收程度最高 ,药效最强。从而为 RNA oli2
gos药物的给药条件提供了依据。
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通过观察发现 , A cGFP基因主要在骨骼肌中表
达 ,且表达量随仔鱼肌肉的发育呈增长趋势。但随
着鱼体的不断发育 ,成鱼肌肉组织被表皮和鳞片逐
渐覆盖 ,背部及躯干仅能观察到微弱的荧光。在鱼
的鳃盖骨周围以及吻端还能观察到明显的荧光。本
研究证明了分离得到的α2actin1启动子所在区域片
段具有有效的驱动功能 ,但所开发的转基因荧光斑
马鱼在观赏性方面还有很大的不足 ,要得到观赏性
更高的转基因荧光鱼尚需进一步深入地研究。
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