全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-12-28
基金项目:中科院西双版纳热带植物园创新工程试点经费(0501073003)
作者简介:王桂娟(1974-),女,汉族,硕士,主要从事生物多样性研究;E-mail:wanggj@xtbg.org.cn
通讯作者:陈茂盛,硕士,主要从事植物分子生物学研究;E-mail:chenms@xtbg.org.cnTel:0691-8715474
小桐子(Jatropha curcas L.)为大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属(Jatropha curcas L.),原产于中美洲,现主
要分布于非洲、拉丁美洲、亚洲。在我国云贵高原南部年降雨量仅 400~500mm的干热河谷地区,以及海拔
1 600m以下没有重霜的亚热带地区旺盛生长,开花结实。在广东、广西、四川、贵州、台湾及沿海等地均有
分布[1]。小桐子种子油具有优良的燃烧特性,从其种子中生产的新型燃料适用于各种柴油发动机,并在闪
点、凝固点、硫含量、一氧化碳排放量和颗粒值等关键技术上均优于国内 0号柴油[2],极具开发价值,因而
目前引起国内外研究人员的广泛关注。小桐子作为一种绿色、环保、可再生的生物柴油,在缓减我国的能源
供应、促进资源、环境、社会经济的和谐发展中有巨大的潜在应用价值。目前对小桐子的一些研究主要集中
在生理生化和毒理学领域方面,对小桐子遗传演化、种质资源评价、遗传育种等方面的研究较少。通过对小
桐子 ISSR-PCR反应体系及扩增程序进行优化,旨在建立一个较为可靠的小桐子 ISSR-PCR反应系统,为进
一步研究小桐子的遗传多样性、群体结构以及品种选育等工作的展开奠定良好的基础。
ISSR(Inter Simple Sequence Repeat)是一种基于 SSR(Simple Sequence Repeat)和 PCR技术的分子标记,
于 1994年由 Zietkiewiez等创建[3]。ISSR标记多态性高、费用低、稳定性好、方便易用,目前被广泛用于遗传
图谱构建、种质资源鉴定、植物进化和遗传多样性分析等领域的研究[4~8]。由于 ISSR标记是基于 PCR的反
应,其多态性、清晰度以及稳定性受不同实验因子影响,因此采用正交试验设计,进行 ISSR-PCR反应体系
小桐子ISSR-PCR体系的优化
王桂娟 1 陈茂盛 1 向振勇 2
(1中国科学院西双版纳热带植物园,勐腊 666303;2云南农业大学园林园艺学院,昆明 650201)
摘 要: 采用正交试验设计方法,建立了小桐子ISSR-PCR反应体系和扩增程序。结果表明,在20"l反应体系中
含有 1×PCR缓冲液、200#mol/L dNTP、0.5$mol/L引物、2.0mmol/L MgCl2、0.5U Tag DNA聚合酶和 90ng模板 DNA
最适用于小桐子 ISSR-PCR扩增。适宜的扩增程序为 94℃ 7min;94℃ 1min,44℃~56℃(退火温度随引物不同而定)
45s,72℃ 1min,35个循环;72℃ 7min;4℃保存。
关键词: 小桐子 ISSR正交优化
Optimization of ISSR-PCR System in Jatropha curcas
Wang Guijuan1 Che Maosheng1 Xiang Zhenyong2
(1Xishuangbanna Tropical Botanical Garden,Chinese Academy of Sciences,Mengla 666303;2College of Horticulture and
Landscape,Yunnan Agricultural University,K nming 650201)
Abstract: In this paper,the orthogonal design was used to establish an ISSR-PCR reaction system and amplification
program of Jatropha curcas. The results indicated that 20’l reaction system containing 1×PCR buffer,200(mol/L
dNTP,0.5)mol/L Primer,2.0mmol/L MgCl2,0.5U Tag DNA polymerase and 90ng template DNA was suitable to ISSR-
PCR amplifying. Amplification program as followed:Pre-denatu tion at 94℃ for 7min;De aturation at 94℃ for 1min;
Annealing at 44℃~56℃ for 45s;Extending at 72℃ for 1min;After 35 cycles,then extending again at 72℃ for 7min and
keeping at 4℃.
Keywords: Jatropha curcas L. ISSR Orthogonal optimization
2008年第3期
的优化和扩增程序的选择是应用 ISSR标记的关键。
1 材料与方法
1.1 材料
小桐子叶片采自云南省勐腊县勐仑镇的野生种。
1.2 试剂与仪器
所用 ISSR引物为加拿大哥伦比亚大学设计的第 9套引物序列。网址:htp:/www.michaelsmith.ubc.ca/
services/NAPS/Primer_Sets/Primers.pdf,由上海生工生物工程公司合成。dNTP和 DNAmarker购自昆明云科
生物工程公司,TaqDNA聚合酶购自东洋纺公司,琼脂糖购自美国 UVP公司。PCR扩增仪购自美国 Bio-
Rad公司,紫外透射凝胶成像系统(GelDoc-itimagingsystem3UVTMTransiluminator)购自美国 UVP公司。
1.3 基因组 DNA提取
采用改良 CTAB法[9]提取基因组 DNA,0.8%琼脂糖凝胶上检测 DNA质量,紫外分光光度计检测 DNA
浓度,稀释至 30ng/!l备用。
1.4 PCR扩增
扩增程序为 94℃预变性 7min;94℃变性 1min,44℃~56℃复性 45s,72℃延伸 1min,35个循环;72℃延伸
7min;4℃保存。反应结束后,取 10!l产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳(含 0.05%的溴化乙锭),用紫外凝胶成
像系统观测并拍照。
1.5 PCR反应体系的正交试验
根据预备试验结果,采用 L9(34)正交试验设计,对主要影响因子做如下处理(表 1)。引物选用 ISSR-36,
总反应体积 20!l,其中 1×PCR缓冲液和 90ngDNA模板不变,设 2次重复。
表 1 ISSR-PCR各因子正交设计表
1.6 模板 DNA浓度筛选
选用 ISSR-34引物,以不同浓度的 DNA为模板,用得到的最佳反应体系进行扩增。DNA模板浓度设
30、90、150、210、270和 330ng共 6个处理。
1.7 退火温度及反应循环次数筛选
选用 ISSR-58引物(理论 Tm值 53.8℃),以优化的反应体系和 DNA模板浓度对退火温度及循环次数
进行优化,分别设 50℃,35循环;50℃,45循环;53℃,35循环;53℃,45循环;56℃,35循环;56℃,45循环;
共 6个处理。
1.8 优化体系稳定性检测
随机选择 6个 ISSR引物,以优化的 PCR反应体系、DNA模板浓度、退火温度及循环数进行扩增,2次
重复。
王桂娟等:小桐子ISSR-PCR体系的优化 163
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
2 结果与分析
2.1 ISSR-PCR反应体系的正交优化
如图 1所示,在 9个处理组合中,dNTP、Primer、Mg2+和 Taq酶 4个主要影响因子浓度组合不同,扩增效
果存在明显的差异。其中处理 4、5、7,条带清晰、多态性最好。在 dNTP的 3个浓度梯度中,当 dNTP浓度为
200μmol/L时,扩增效果最好;处理 6效果不佳可能是因为引物浓度大或者 Mg2+浓度小所致。在引物的 3
个浓度梯度中,当引物浓度为 0.5μmol/L时,扩增效果最好;处理 1效果差,可能与 dNTP、和 Taq酶用量少
有关。在 Mg2+的 3个浓度梯度中,当 Mg2+浓度为 2.0mmol/L时,扩增效果最好;处理 3效果差可能与 dNTP、
Primer浓度低或 Taq酶用量大有关。在 Taq酶的 3个梯度中,用量为 0.5时,处理 5最好;用量为 1.0时,处
理 7最好;用量为 2.0时,处理 4最好,为减少费用,可选用 0.5U。综合以上分析,在小桐子 ISSR-PCR的
20μl反应体系中 200μmol/LdNTP、0.5μmol/LPrimer、2.0mmol/LMgCl2、0.5UTagDNA聚合酶的组合应该是
最佳选择。
2.2模板 DNA浓度对 ISSR扩增效果的影响
使用 ISSR-34引物,以不同浓度的 DNA为模板,扩增结果表明,随着模板浓度升高,扩增出的条带亮
度增加(图 2)。由于过暗或过亮的条带会对读带造成一定困难,因此选用 90ng为最佳模板 NDA浓度。
图 2 不同模板 DNA浓度的 ISSR-PCR扩增
M为 Maker,1~6分别为 30、90、150、210、270和
330ng模板 DNA,引物为 ISSR-34
图 1 正交设计的 ISSR-PCR反应体系扩增结果
M为 Maker,1~9为处理组合编号(表 1),引物为 ISSR-36
2.3 退火温度及循环次数对 ISSR扩增效果的影响
使用 ISSR-58引物,在不同退火温度和循环次数下扩增,结果表明,处理间没有明显差异(图 3),说明对
于ISSR-58引物,退火温度和循环次数在一定范围内的变化不影响扩增结果。为减少扩增时间,选35个循环。
2.4 ISSR-PCR反应体系及扩增程序的稳定性检测
综合上述分析,小桐子 ISSR-PCR最佳反应体系及扩增程序如下:1×PCR缓冲液、200μmol/LdNTP、
0.5μmol/L引物、2.0mmol/LMgCl2、0.5UTagDNA聚合酶和 90ng模板 DNA。扩增程序为 94℃7min;94℃
1min,44℃~56℃45s,72℃1min,35个循环;72℃7min;4℃保存。随机选择 ISSR-49、ISSR-56、ISSR-40、ISSR-
52、ISSR-60、ISSR-46共 6个引物,对上述小桐子 ISSR-PCR反应体系及扩增程序进行稳定性检测。结果表
明,6个引物均能扩增出清晰、稳定、重复性好的条带(图 4),表明所建立的 ISSR-PCR反应体系及扩增程序
适用于小桐子的 ISSR标记研究。
图 4 不同 ISSR引物用优化 ISSR-PCR体系的扩增结果
M 为 Maker,1~6分 别 为 引 物 ISSR-49、ISSR-56、
ISSR-40、ISSR-52、ISSR-60和 ISSR-46
图 3 不同退火温度和循环次数的 ISSR-PCR扩增
M为 Maker,150℃,35循环;250℃,45循环;353℃,35循环;4
53℃,45循环;556℃,35循环;656℃,45循环,引物为 ISSR-58
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3 讨论
在 PCR反应体系中,dNTP、引物、Mg2+和 Taq酶是 4个主要的影响因子,它们之间的相互作用会影响扩
增结果。对于不同物种或在不同试验条件下,需要对这些因子的最佳组合浓度进行优化。在本试验当中,不
同处理间确实存在明显差异。dNTP、primer和 Mg2+分别在 150μmol/L、1.5μmol/L和 1.0mmol/L时,扩增效
果最差,说明小桐子 ISSR-PCR扩增体系中,当 dNTP、Mg2+和 primer的浓度分别达到某个阀值时,即使调节
其它因子的浓度也不能得到理想的扩增结果,因子之间的相互作用只在一定的浓度范围内起作用。而 Taq
酶的用量在 0.5~2.0的 3个梯度都可以扩增出比较好的结果,可能与酶本身的性质有关。
模板 DNA浓度主要影响扩增条带的明暗度,因此在实验当中,可根据每个引物的具体扩增效果适当
调节模板浓度,以便于得到清晰可辨的条带。另外,退火温度和循环次数也是 PCR反应中的重要因子,它
们的变化通常会对扩增结果产生影响。但在实验中,退火温度和循环次数并没有明显影响扩增结果,可能
与引物的特异性较强有关;也可能是所建的小桐子 ISSR-PCR扩增体系比较稳定,因此对反应条件的变化
具有较强的承受能力。
虽然 ISSR标记具有比较好的稳定性和重复性,由于 PCR反应制约因素比较多,因此尽量在相同的条
件下进行扩增反应是实验成功的关键。
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