全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
叶绿体功能基因的工程改造
徐昀 胡凯 崔震海 张立军
(沈阳农业大学生物科学技术学院 辽宁省植物基因工程技术研究中心，沈阳 110866)
摘 要: 主要介绍叶绿体功能基因工程改造的目的、受体材料、主要方法、转入外源基因细胞的筛选和鉴定等。
关键词: 叶绿体功能 基因工程 同源重组 通用载体 筛选标记基因
Genetic Engineering of Chloroplast Function
Xu Yun Hu Kai Cui Zhenhai Zhang Lijun
(College of Biotechnology，Shenyang Agricultural University，Liaoning Province
Research Center of Plant Genetic Engineering Technology，Shenyang 110866)
Abstract: In this article，we reviewed the purpose of chloroplast transformation，receptor makings，the main methods，the select，
and identify of foreign gene cells．
Key words: Chloroplast function Genetic engineering Homologous recombination Universal vector Selectable marker genes
收稿日期:2011-04-18
基金项目:国家自然科学基金项目(30870190) ，国家自然基金青年科学基金项目(31000673)
作者简介:徐昀，女，硕士研究生，研究方向:植物基因工程;E-mail:wensheng860628@ 163． com
通讯作者:张立军，男，教授，研究方向:植物基因工程;E-mail:lijunzhang8@ yahoo． com． cn
叶绿体是存在于植物细胞及真核藻类中的一类
细胞器，是光合作用的主要场所，具有固定和还原二
氧化碳的能力。此外，还是植物体内多种重要代谢
物质合成的场所。目前在分子水平上对植物进行遗
传操作，改变植物的遗传特性，已经成为研究植物代
谢和发育机制、调节环境反应机制以及培育具有新
遗传特性优良品种的重要手段。叶绿体基因组以双
链环状 DNA 形式存在，大小为 120 － 220 kb 个碱
基［1］。叶绿体基因组具有多拷贝，每个叶绿体约含
100 个环状 DNA 拷贝。每个植物细胞都含有数十
至几百个叶绿体，因此每个细胞的叶绿体遗传物质
约有 10 000 个拷贝［2］。相比于核基因组，叶绿体基
因组尽管小得多，但其 DNA 却占整个细胞 DNA 含
量的 10% －20%。叶绿体基因组虽然具有相对独立
的遗传系统，但它却是半自主性细胞器，其生长和增
殖是受核基因组及自身的基因组两套遗传信息系统
控制的。复制所需的 DNA聚合酶都是由核 DNA编
码的。所以，在叶绿体基因组水平上的遗传操作，赋
予叶绿体新的功能或敲除原有基因消除其功能，将
有助于人们深入了解植物光合作用的机理、叶绿体
基因组与细胞核基因组基因表达的互作、叶绿体内
合成蛋白质与细胞质中合成蛋白质的互作、叶绿体
内物质代谢与细胞质内物质代谢的关系、叶绿体的
光合物质代谢与线粒体呼吸物质代谢的关系等，为
通过基因工程途径改造作物，提高光合效率和物质
生产潜力，以及改变抗逆等遗传特性提供理论基础。
除此之外，由于叶绿体在植物细胞内的存在数量多，
内含的遗传物质又具有多拷贝性［2］，使其成为用于
特殊物质生产的最具潜力生物反应器之一。
1 叶绿体功能遗传改造的植物材料
叶绿体功能遗传改造的植物材料可以是植物的
愈伤组织、体细胞胚或离体原生质体，其目标可以是
叶绿体，也可以是前质体。但叶绿体是目前叶绿体
功能遗传改造的主要目标。Lee 等［3］将水稻的种子
在 MS 培养基上培养，以其诱导出的愈伤组织为受
体进行轰击，成功将 aadA(抗壮观霉素基因)和 gfp
(绿色荧光蛋白基因)的融合基因导入叶绿体中。
Chakrabarti等［4］用离体的烟草叶片为材料诱导出愈
伤组织，采用基因枪转化法，成功将抗虫性基因
cry9Aa2 导入烟草叶绿体中，并得到同质化。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
前质体是叶绿体的前体，在光下发育为叶绿体。
因此，人们也以细胞中的前质体为目标进行遗传转
化。Kumar 和 Daniell［5］将胡萝卜的根进行组织培
养，用其诱导出的愈伤组织为材料将 badh(甜菜碱
醛脱氢酶)基因转入前质体;在棉花中，也利用前质
体途径实现了叶绿体的遗传转化，将 aphA6 和 nptII
两种不同的基因成功转入其叶绿体基因组中［6］;
Dufourmantel等［7］以大豆体细胞胚(非绿色组织)作
为外植体，将抗虫基因 cry1Ab 转入其中，成功实现
了 cry1Ab基因在叶绿体中的表达。
2 叶绿体功能遗传改造的方法
将外源 DNA序列导入叶绿体或细胞核基因组，
使叶绿体增加新的遗传物质、蛋白质或敲除某个基
因，都可以影响叶绿体的功能。外源序列导入叶绿
体或细胞的方法有物理的、化学的和生物的 3 种，主
要因受体材料不同而异，目前的主要方法有基因枪
转化法、农杆菌结合转运肽介导法和 PEG 介导法
等。
2． 1 基因枪转化法
基因枪法是将外源序列导入叶绿体从而改造其
功能的最有效的技术。用钨粉或金粉包裹外源
DNA，利用高压气体冲击波加速微弹穿透植物细胞
壁和细胞膜，使外源 DNA直接进入叶绿体。基因枪
法通常以植物的愈伤组织为受体材料。Lee 等［3］利
用基因枪成功实现了水稻愈伤组织的叶绿体转化，
并获得了稳定遗传的叶绿体转化植株。基因枪法的
一个主要优点是不受植物材料的限制。但在基因枪
轰击过程中可能造成外源序列的断裂，使插入的序
列成为无活性的片段，而且由于基因枪轰击时进入
细胞的基因可能是多拷贝的，这些拷贝可能随机整
合到受体的核基因组和叶绿体，因此出现嵌合体的
可能性较高。
2． 2 农杆菌结合转运肽介导法
这种方法是一种特殊的农杆菌法，其目的是通
过整合到细胞核的外源基因表达产物(蛋白质)调
节叶绿体的功能。该法首先将目的基因与叶绿体的
转运肽编码序列相连，然后构建到农杆菌的 Ti 质粒
上。Ti质粒借助农杆菌进入核基因组后表达，在细
胞质中合成的融合蛋白，在转运肽的作用通过叶绿
体被膜进入叶绿体基质，从而影响叶绿体的功能。
2． 3 PEG介导法
当用于叶绿体功能遗传改造的材料为原生质体
时可用 PEG 介导法。原生质体作为受体具有群体
数大，DNA分子易于进入，便于操作等优点。Golds
等［8］用 PEG 介导法将 aphA6 基因成功的转入烟草
质体中，为叶绿体遗传转化提供了一条新的途径。
但由于原生质体培养难度大、再生频率低、周期长，
从而限制了 PEG介导法的使用。
3 外源序列整合入叶绿体基因组的方式
在进行叶绿体功能的遗传改造时，往往需要使
外源序列定点插入叶绿体基因组或需要定点敲除叶
绿体的基因，其方式主要有同源重组和位点特异性
整合。
3． 1 同源重组
为实现外源序列在叶绿体基因组上的定点整
合，需要在外源序列表达盒两侧各连接一段预插入
部位的叶绿体 DNA序列，即同源重组片段［9］。叶绿
体同源片段的大小以 1 － 2 kb 为宜。通过这个方式
既可以将外源序列定点插入叶绿体基因组，也可以
定点敲除叶绿体基因组中的特定基因［10］，然而这种
方法的应用是受人们对目标植物叶绿体基因组序列
的了解程度限制的。
3． 2 位点特异性整合
该法是借助于 phiC31 噬菌体位点特异性整合
酶(integrase，INT)的一种方法。 INT 是来源于
phiC31 系统中的重组酶，能够介导噬菌体 attP 与细
菌 attB位点之间的整合［11］，所以这种方法需要两个
步骤。首先，利用将细菌 attB 位点通过同源重组整
合到质体基因组中，然后，以这种质体转基因系为材
料，将带有外源基因、筛选标记基因和 attP位点的质
粒，在 INT 酶的介导下，通过 attP位点与质体基因组
中的 attB位点的整合，从而将外源序列和筛选标记
基因定点整合到受体质体基因组中［12］。
4 导入叶绿体外源基因受体的筛选和鉴定
依前述方法对植物受体材料进行外源序列导入
处理后，需要通过选择标记将已经导入外源 DNA序
列的叶绿体及所在细胞筛选出来［13］。选择标记有
多种: (1)外源的定位筛选标记，如葡萄糖苷酶
(GUS)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因和荧光素酶
(LUC)基因;(2)外源的抗生素抗性基因，如细菌编
2
2011 年第 8 期 徐昀等:叶绿体功能基因的工程改造
码的卡那霉素抗性基因、壮观霉素 /链霉素抗性基
因、氯霉素乙酰基转移酶［14］等; (3)外源的除草剂
抗性基因，如细菌编码的抗除草剂 Basta 和 Herbiace
主要活性成分 PPT的 bar基因;(4)外源的抗渗透胁
迫基因，如甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因［15］; (5)外
源的抗色氨酸反馈抑制基因，如邻氨基苯甲酸合成
酶 α亚基编码基因，能够抗吲哚类似物 4-甲基吲哚
(4MI)或色氨酸类似物 7-甲基-DL-色氨酸(7MT)的
抑制作用［16］; (6)内源的抗生素抗性标记，如来自
叶绿体 16S rRNA 和 23S rRNA 上不同位点的突变
的壮观霉素、链霉素、林可霉素的抗性。尽管用叶绿
体遗传转化筛选的标记种类很多，但是能够代替抗
生素抗性基因的高效筛选基因还有待于进一步的
研究。
5 外源基因导入叶绿体的主要载体
5． 1 通用载体
高等植物叶绿体基因组是高度保守的。Daniell［17］
用烟草叶绿体基因 trnA 和 trnI 作为同源片段，构建
了适用于多种不同植物叶绿体基因组转化的通用载
体。但是，这种通用载体对不同植物的转化效率存
在差异，例如，对马铃薯［18］和番茄［19］叶绿体的转化
效率明显低于烟草，即植物与烟草叶绿体基因组的
差异愈大，转化效率愈低。
5． 2 特异性载体
许多植物和许多场合不适合用通用载体进行转
化，如当我们对叶绿体遗传改造的目的是敲除某个
基因时，就需要根据所敲除的序列构建特异的载体。
然而，许多物种的叶绿体基因组序列尚不完全清楚，
限制了特异载体的构建和应用。
6 叶绿体基因组转化成功的作物及导入的
外源基因
目前已实现叶绿体遗传转化的植物多达 10 余
种(表 1) ，包括模式植物烟草、番茄、水稻和杨树等。
在其中表达的外源基因大致可分为抗性基因、报告
基因、药用蛋白和疫苗等。
目前的叶绿体遗传功能改造主要限于导入外源
基因，其目的是生产有用物质。然而，随着植物生理
生化研究进展的需要，可能需要更多的通过导入外
源基因或敲除内源基因来改变叶绿体的功能。了解
叶绿体在细胞代谢、信号转导和对环境刺激反应中
的作用，将需要更高效的叶绿体转化方法、更理想的
筛选标记，以及控制细胞内不同程度叶绿体异质化
的技术等。
表 1 叶绿体基因组转化成功的部分作物及导入的外源基因
作物 导入外源基因及导入基因的功能 参考文献
烟草
bar(抗除草剂) ［20］
TPS1(抗旱性) ［21］
phaA(细胞质雄性不育) ［22］
IGF-1(胰岛素类生长因子) ［23］
cry9Aa2(抗虫性) ［4］
lecA(变形虫病疫苗) ［24］
INFa2B(a-2b干扰素) ［25］
NS32C(人类丙型肝炎病毒融合抗原基因) ［26］
Bt、OC融合蛋白(抗虫性) ［27］
Has(人血清蛋白) ［28］
GFP-2L2I(动物疫苗) ［29］
merA /merB(环境修复) ［30，31］
aro(抗除草剂) ［32］
番茄 aadA(抗壮观霉素) ［19］
油菜 cry1Aa10(抗虫性) ［33］
矮牵牛花 aadA、gusA(抗壮观霉素) ［34］
胡萝卜 BADH(抗盐性) ［5］
棉花 aphA6、nptII(抗卡那霉素) ［6］
马铃薯
aadA、gfp(抗壮观霉素) ［35］
gfp(绿色荧光蛋白) ［36］
大豆 cry1Ab(抗虫性) ［7］
水稻
aadA、gfp融合蛋白(抗壮观霉素) ［3］
bar(抗除草剂) ［37］
杨树 aadA、gfp(抗壮观霉素) ［38］
生菜 aadA(抗壮观霉素) ［39］
卷心菜 uidA(β-葡糖苷酶基因) ［40］
甘薯 aadA、gfp(抗壮观霉素) ［41］
高羊茅 bar(抗除草剂)、tps1(抗旱性) ［42］
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