全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-05-27
基金项目：国家高技术研究发展计划（863 计划）（2008AA10Z402、2006AA10Z402）
作者简介：李莹莹（1985-），女，硕士研究生，主要从事环境微生物学研究
通讯作者：闫艳春，教授，Tel：010-82109685，E-mail：yanyanchun@caas.net.cn
有机磷农药是当今农药的主要类别之一，一直在国内外大量生产和广泛使用，并在农业增产和害虫防
治方面产生了巨大的经济效益和社会效益 [1，2]。 由于有机磷农药对非靶标生物的毒性高和某些有机磷农药
存在潜在迟发性神经毒性，致使有机磷中毒事件在我国时有发生 [3，4]。 生物修复特别是微生物对残留农药
的降解去毒，是目前治理环境污染特别是农药污染的有效途径。因此，大力开发有机磷农药降解菌资源，并
对降解菌的性质进行鉴定，深入了解降解机理和代谢途径，构建工程菌及利用混合菌制剂和酶制剂降解有
机磷农药是生物修复的重要工作，对于农业的可持续发展具有重要的现实意义。
通过富集培养的方法，筛选到一株能够完全矿化甲基对硫磷的菌株 L1，该株菌能够高效的降解甲基
对硫磷，并克隆到了其降解酶基因，这对于深入研究其降解酶基因，构建能够高效表达降解酶的表达载体，
并研究降解酶的性质奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 试剂与培养基
甲基对硫磷（MP）原药，纯度 80％，购自华阳农药厂，活性污泥取自山东华阳农药厂污水处理曝气池。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3.0g；胰蛋白胨 10.0g；NaCl 5.0g，蒸馏水定容至 1L，调节 pH 至 7.0~7.2。
甲基对硫磷降解菌 L1的分离、鉴定及降解酶基因的克隆
李莹莹 2 李文 2 张琛 2 闫艳春 1
（1中国农业科学院研究生院，北京 100081；2山东农业大学生命科学学院，泰安 271018）
摘 要： 从农药厂的污水处理池中分离到一株能高效降解甲基对硫磷的菌株L1，L1能以甲基对硫磷为惟一碳源、
氮源和能源生长；经生理生化实验和16s rRNA同源性分析，初步将L1归为节杆菌属（Arthrobacter sp.）。紫外分光光度法
对L1的降解性能研究表明，L1能在12h内将50mg/L的甲基对硫磷完全降解；用PCR方法克隆其甲基对硫磷降解酶基
因 mpd，这是迄今首次从革兰氏阳性菌中克隆到的 mpd基因。
关键词： 甲基对硫磷 节杆菌属 甲基对硫磷降解酶基因
Isolation，Characterization of Methyl-parathion Degrading Strain
L1 and Cloning of the mpd Gene
Li Yingying2 L Wen2 Zhang Chen2 Ya Yanchun1
（1Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；2College of Life Science of Shandong
Agricultural University，Taian 271018）
Abstract： Strain L1，capable of utilizing methyl-para hion as sole carbon，nitrogen and energy source，was isolated
from the activated sludge by enrichment technique. As the result，the strain L1 was identified asArthrobacter sp. by
biochemical tests and analysis of the partial 16S rDNA sequence. Degradation tests of MP with spectrophotometry
revealed that L1 could degrade 50mg/L MP completely in 12h. The methyl-parathion degradingmpd gene was cloned.
This is the first report of isolating thempd gene rom the positive strain.
Key words： Methyl-parathionArthrobacter sp. Methyl-parathion degrading gene
2008年第 6期
LB 培养基：胰蛋白胨 10g；酵母提取物 5g；NaCl10g，蒸馏水定容至 1L，调 pH 至 7.4。
基础培养基 （MM）：NH4NO3，1.00g；MgSO4·7H2O 0.50g；（NH4）SO4 0.50g；KH2PO4 0.50g；NaCl 0.50g；Yeast
Extract 0.05g；K2HPO4 1.50g，蒸馏水定容至 1L，调节 pH 至 7.0。
1.2 菌株的分离与筛选
取采样点污泥和污水的混合样，3 000r/min 离心 3~5min， 收集活性污泥 5.0g， 加入盛有 100ml 的富集
培养液中，MP 浓度为 100mg/L，30℃，180r/min 摇床培养，以后每隔 7d 转接 1 次，以接种量 10％接入新鲜培
养液，并不断提高 MP 的浓度直到 500mg/L。 取驯化液，梯度稀释，涂布含 MP 为惟一碳源的基础培养基固
体平板，30℃恒温倒置培养，MP 以 100mg/L 的梯度递增并直到 500mg/L，分离纯化得单菌落，并观察菌的生
长速度和水解圈的大小，初步判断其降解能力，初筛、复筛菌株。
1.3 菌株的鉴定
菌株的生理生化鉴定参照文献[5，6]。
细菌基因组 DNA 提取采用 CTAB 法 [7]。
16S rRNA 的 PCR 扩增使用细菌通用引物：5-GGCTACCTTGTTACGACT-3；5-AGAGTTTGATCCTGGCTC
AG-3[8]。 以新提的基因组 DNA 为模板，每 25μl 体系中含：10×PCR Buffer（Mg2+ free）：2.5μl；MgCl2（25mM）：
1.5μl；引物 1（5μM）：2μl；引物 2（5μM）：2μl；dNTP Mixture：2μl；rTaq 酶（5U/μl），0.125μl；加模板 DNA 和灭
菌 ddH2O 至 25μl。 PCR 反应条件 ：94℃预变性 3min， 循环 1 次 ；94℃变性 1min，50℃退火 1min，72℃延伸
1.5min，循环 30 次；72℃后延伸 8min，循环 1 次 ，4℃保存。 PCR 产物经纯化，克隆至 pMD-18T，转化 E.coli
DH5α，序列测定由 Invitrogen 公司完成。
测序结果用 BLAST 软件与 GenBank 中注册的 16srDNA 序列进行同源性比较。
1.4 菌株对甲基对硫磷的生物降解
L1 对甲基对硫磷的降解可通过紫外分光光度计法测定 ，甲基对硫磷在 273nm 处有特征吸收 ，可通
过测定甲基对硫磷的特征吸收值来定量测定菌株对甲基对硫磷的降解 。样品处理 ：取 1ml 细菌培养液 ，
10 000r/min 离心 10min，取上清液稀释 10 倍后测定 273nm 处的特征吸收值，然后与用标准浓度甲基对硫
磷获得的标准曲线比较确定培养物中甲基对硫磷的浓度。
1.5 甲基对硫磷降解酶基因的克隆
根据已报道的甲基对硫磷水解酶的基因序列设计特异引物 LH1，HL[9，10]。 LH1：5-ATGCCCCTGAAGAAC
CGCTT-3；HL：5-CAGTCACTTGGGGTTGACGAC-3， 以 L1 的基因组为模板， 以 LH1，HL 为引物 PCR 扩增
mpd 基因， 反应条件为：94℃预变性 5min，94℃变性 30s，57℃退火 50s，72℃延伸 1.5min， 共 30 个循环，于
72℃延伸 8min。 然后将 PCR 产物与 pMD18-T vector （TakaRa）4℃过夜连接 ， 将连接产物转化大肠杆菌
DH5α，蓝白斑筛选，筛选阳性克隆，菌落 PCR 检测目的条带，提取阳性菌的质粒，酶切鉴定，测序由上海英
骏生物技术有限公司（Invitrogen）完成。
2 结果与分析
2.1 菌株 L1 的分离与鉴定
经筛选、分离获得一株降解性能好的菌株，将其命名为 L1。 该菌株能以甲基对硫磷为惟一碳源、氮源
和能源生长。革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，在牛肉膏蛋白胨培养基平板生长时，菌落光滑，边缘整齐；生理生
化反应为：好氧及兼性厌氧菌，脲酶阴性，明胶水解阳性，葡萄糖发酵阴性，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，
产生吲哚实验均为阳性，丙二酸发酵阳性，柠檬酸盐还原阳性，酪氨酸水解阴性，果聚糖形成阴性，淀粉水
解阴性，不能利用乳糖、蔗糖和麦芽糖，
以菌体的基因组为模板，以细菌 16S 通用引物进行了 PCR 扩增，获得菌株的 16S rRNA 序列，将该序
列与 GenBank 中注册的 16S rRNA 序列比较发现，该菌株与节杆菌属的同源性达到 97%，综合生理生化试
李莹莹等：甲基对硫磷降解菌 L1的分离、鉴定及降解酶基因的克隆 129
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
验与 16S rRNA 遗传性分析，将菌株 L1 归类为节杆菌属（Arthrobacter sp.）。
2.2 菌株对甲基对硫磷的降解性能研究
收集于牛肉膏蛋白胨培养基中培养至对数生长期的菌株 L1， 转接至含有 50mg/L 甲基对硫磷的基础
培养基中，30℃振荡培养，每隔 2h 取样，设定不接菌的对照，样品处理如前所述，经紫外分光光度计法测定
发现，菌株能够在 12h 内将 50mg/L 的甲基对硫磷降解完全（图 1）。
2.3 降解酶基因的克隆
以菌株 L1 的基因组为模板，以 LH1，HL 为引物，PCR 扩增 mpd 基因，PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测结
果如图 2 所示，基因大小大约为 1.0kb 左右，单引物泳道处没有目的条带出现，证明 PCR 产物是双引物扩
增结果。

















   

 


图 1 菌株 L1 对甲基对硫磷的降解 图 2 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测结果
回收目的条带，与 pMD18-T vector（TakaRa）4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌 DH5α，蓝白斑筛选
阳性克隆 ， 将阳性克隆寄出测序 ， 其结构基因全长为 996bp， 将基因提交到 GenBnak 中 （注册号是
EF055988）。 测序结果在 GenBank nucleic-nucleic Blast 进行比对，发现它们与其它甲基对硫磷降解菌的 mpd
基因同源性高达 99%，说明该株菌的 mpd 基因是甲基对硫磷降解酶基因的同源基因。
为了进一步验证克隆到的 mpd 基因的功能，测定了阳性克隆对甲基对硫磷的降解性能，结果表明，筛
选到的阳性克隆能够在 24h 内将 50mg/L 的甲基对硫磷完全转化为对
硝基苯酚（图 3），但是并不能够将对硝基苯酚进一步降解，原因是对硝
基苯酚的降解需要一系列代谢过程，说明对硝基苯酚的降解可能是由
基因簇产物决定。
3 讨论
利用富集培养的方法，从农药厂活性污泥中筛选到一株能够能够
高效降解甲基对硫磷的菌株， 经生理生化实验及 16S rRNA 同源性分
析，将该菌株鉴定为 Arthrobacter sp.L1，它能够在 12h 内将 50mg/L 的甲
基对硫磷降解完全，根据已报道的甲基对硫磷降解酶基因设计引物，PCR 扩增到其甲基对硫磷降解酶 mpd
基因， 这是首次报道从革兰氏阳性细菌克隆到甲基对硫磷降解酶基因， 下一步的工作是克隆代谢 PNP 的
降解基因簇，构建 MP 和 PNP 的融合表达载体，构建能彻底矿化甲基对硫磷的超级细菌，以用于环境的污
染治理。
随着有机磷农药新的降解微生物、降解酶的发现以及生物工程技术的发展，生物修复技术在减少或消
除由于有机磷农药的广泛使用而带来的诸多负面影响诸如环境污染、 食品安全等将起着越来越重要的作
用。

















   


时间 （h）
图 3 阳性克隆对甲基对硫磷的降解
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2008年第 6期
（上接第 127页）
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