全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2009年第 1期
收稿日期：2008-06-28
作者简介：韦永琼（1983-），女，硕士研究生，研究方向：生物信息学
通讯作者：曾照芳，教授，Tel：023-68485095，E-mail：zeng000@126.com
PTEN（Phosphatase and tensin homolog deleted on
chromosome ten）基因 ，即第 10 号染色体同源丢失
性磷酸酶张力蛋白基因， 是 1997 年在美国克隆出
的一种新型肿瘤抑制基因，是迄今为止发现的第一
个具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因 [1]。 它能
通过 PI3K ／ AKT、FAK 和 MAPK 信号转导通路调节
细胞的生长、凋亡、迁移和转化。除了对肿瘤细胞生
物学特性的影响之外，越来越多的证据表明，PTEN
在脑组织中也高度表达，其在调节神经干细胞的增
殖、SVZ 前体细胞的迁移及凋亡、PC12 细胞的分化
和神经突触的建立方面具有重要作用 [2]。 有报道显
示，PTEN 可通过磷酸化调控与受体结合，直接参与
神经元的凋亡过程，在中枢神经系统的损伤防护和
再生中可发挥重要作用 [3]。 因此，深入研究 PTEN 对
神经细胞凋亡过程的作用及机制，可为临床脑血管
疾病的防治提供新的思路。通过基因重组来构建携
携带 PTEN基因的重组腺病毒表达载体构建的研究
韦永琼 曾照芳
（重庆医科大学检验系 临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室 重庆市重点实验室，重庆 400016）
摘 要： 构建携带抑癌基因 PTEN（Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）的重组腺病毒表
达载体，为研究 PTEN的功能和作用机制奠定基础。 采用 RT-PCR法从大鼠海马神经元扩增目的基因 PTEN，克隆人含绿
色荧光蛋白 （Green fluorescence protein），GFP 基因的 pAdTrack-CMV穿梭质粒， 在含有腺病毒骨架质粒 pAdEasy-1 的
BJ5183大肠杆菌内进行同源重组；获得重组腺病毒质粒，经 PacI线性化后，转染 AD293细胞。结果表明，感染腺病毒载体
的 AD293 细胞表达 GFP 基因，随着时间逐渐增强，并且出现明显的细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE），经 PCR 对传
代的 Ad-PTEN分析证实得到目的基因。成功构建了携带 PTEN基因的腺病毒表达载体，为研究 PTEN的功能和作用机制
奠定了基础。
关键词： PTEN基因 重组腺病毒 载体 构建
Construction of Recombinant Adenovirus Expression Vector
Containing PTEN Gene
Wei Yongqiong Zeng Zhaofang
（Key Laboratory of Medical Diagnostics，Ministry of Education，Chongqing Medical University，Chongqing 400016）
Abstract： To construct a recombinant adenovirus expression vector containing an anti-oncogene，PTEN gene was
amplified form the hippocampus of rats by RT-PCR，and cloned into shuttle plasmid pAdTrack-CMV，which containing
green fluorescence protein GFP gene. The shuttle plasmid was transformed into BJ5183，which had already contained
adenovirus backbone vector pAdEasy-1 to achieve the homologous recombination and btain recombinant adenovirus
genome plasmid as well. This recombinant construct was subsequently linearlized with PacI and transfected into AD293
cells. Results showed that， GFP gene was expressed in recombinant adenovirus infected AD293 cells. Cytopathic effect
（CPE） was found in GFP expression，which was extending and brightening as time going on. Therefore the PTEN
recombinant adenovirus expression vector was constructed successfully，and the foundation for the study on function and
mechanism was established.
Key words： PTEN gene Recombinant adenovirus Vector Construction
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
带外源性 PTEN 基因的腺病毒载体，并对之进行鉴
定和扩增。 以便为脑血管疾病的基因治疗奠定基
础。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌株
穿梭质粒 pAdTrack-CMV， 腺病毒骨架质粒
pAdEasy-1，DH5α，BJ5183 菌种 ，AD293 细胞等由重
庆医科大学基础研究所实验室提供。
1.2 酶及其他生化试剂
限制性内切酶 PacI 及 PmeI 购自 NEB 公司；其
他限制性内切酶及 T4 DNA 连接酶 、PCR 试剂盒购
自 Takara 公司；质粒提取试剂盒与胶回收试剂盒购
于 Omega 公司； 脂质体 2000 购于 Invitrogen 公司；
其他试剂为国产分析纯。
1.3 PCR 所需引物
由野生型 PTEN 的 cDNA 序列设计一对编码
PTEN 全长的引物：上游 5′-CTGGGTACCATGACAG
CCATCATCAAAG-3′，下游 5′-GGCCTCGAGTCAGAC
TTTTGTAATTTGTG-3′；分别带有 KpnI 和 XhoI 的酶
切位点 ； 退火温度 64℃， 产物为 1 214 bp 片段 ；
pAdEasy-1 引物：上游 5′-ACCTAATAAGCAATGAC
AGC-3′，下游 5′-TGAGTTGGGAGTAGACGG-3′，退火
温度为 54℃，产物为 282 片段。
1.4 插入 PTEN 基因的穿梭质粒的构建
1.4.1 全长 PTEN 基因的扩增 分离 SD 大鼠海马
神经元，抽提总 RNA 通过逆转录获得 cDNA 后，使
用上述 PTEN 全长引物，通过 PCR 扩增出全长 PTEN
基因，PCR 反应条件为 94℃预变性 5 min，94℃变性
45 s，64℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，循环 35 次，最
后 72℃延伸 5 min。
1.4.2 质粒转化、 扩增与提取 用 pAdTrack-CMV
质粒转化感受态 DH5α，在含卡那霉素的琼脂平板
上筛选后扩增 ， 用试剂盒提取 pAdTrack-CMV 质
粒，备用。
1.4.3 穿梭质粒的构建 分别用限制性内切酶
KpnI和 XhoI 双酶切 PCR 产物和穿梭质粒 pAdTrack-
CMV，酶切产物经胶回收试剂盒纯化后 ，将线性化
的载体与 PTEN 片段按 1∶3 mol 比混合， 用 T4 DNA
连接酶于 16℃连接过夜 ， 连接产物转化感受态
DH5α，在含卡那霉素琼脂平板上接种，37℃孵育过
夜。 挑取小的单菌落，在 1 ml 含卡那霉素的 LB 培
养基中摇菌 12~16 h， 取 2 ml 菌液用 PTEN 引物进
行 PCR， 从扩增出目的条带的菌液中选取 2 管，扩
增后提取质粒，分别用 KpnI 和 XhoI 双酶切筛选出
重组质粒 pAdTrack-CMV-PTEN， 并送生物公司测
序。
1.5 制备重组腺病毒质粒 pAd-PTEN
先将腺病毒骨架质粒 pAdEasey-1 用氯化钙法
转化于 BJ5183 菌，用氨苄青霉素和链霉素 LB 培养
基平板筛选 ；用 PmeI 将 pAdTrack-CMV-PTEN 线性
化， 再次采用氯化钙法转化于含 pAdEasey-1 骨架
质粒的 BJ5183，而后接种于含卡那霉素的 LB 平板
上，37℃孵育过夜，次晨挑选单菌落，继续在含有卡
那霉素的 LB 试管中生长 16～18 h， 取 2 μl 菌液分
别用 PTEN 和 pAdEasey-1 引物进行菌液 PCR，选取
两者都扩增出目的条带的菌液， 扩增后提取质粒，
用 PacI 进行单酶切鉴定。 如果重组质粒在 BJ5183
菌中拷贝数低，再将阳性质粒转入拷贝数较高的感
受态 DH5α 细菌中以扩增。
1.6 重组腺病毒 pAd-PTEN 的包装与扩增
将 AD293 细胞接种到 6 孔板上 ， 等细胞融合
到 50% ~70%时进行转染 ， 用 PacI 线性化 pAd-
PTEN，纯化后按脂质体 2000 说明书操作说明转染
293 细胞。 定期用荧光显微镜监测 GFP 的表达；转
染后 7~10 d 用细胞刮匙刮取细胞转入 10 ml 离心
管中，2 000 r ／min 离心 10 min， 弃上清液。 细胞团
块用 pH7.36 的 PBS 重悬，反复冻融 4 次裂解细胞，
短暂离心后收集病毒上清液-20℃保存或用于再次
感染 293 细胞，通过病毒液反复感染以达到病毒所
需滴度。
1.7 重组腺病毒 pAd-PTEN 的鉴定
检测 GFP 表达确认重组腺病毒包装成功 ，病
毒液分别用 PTEN 和 pAdEasey-1 引物进行 PCR 鉴
定。
2 结果
2.1 目的基因 PTEN 的扩增
提取 SD 大鼠海马神经元总 RNA 后逆转录成
cDNA，用 PTEN 全长引物扩增出目的基因，经 1%琼
脂糖凝胶电泳条带大小与预期结果一致， 为 1.2 kb，
未见非特异扩增带（图 1）。
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2.2 PTEN 基因重组穿梭载体的构建
取重组的 pAdTrack-PTEN 用 KpnI 和 XhoI 双酶
切鉴定，切下 1.2 kb 的目的条带和 9 kb 的 pAdTrack-
CMV 空载体两条带，与预期结果相符，证明载体构建
正确（图 2）。 pAdTrack-PTEN测序结果也与 Genebank
（NM 000314）一致。
2.3 重组腺病毒 pAd-PTEN 的 PCR 筛选和 PacI
酶切鉴定
分别用 PTEN 引物和 pAdEasey-1 引物进行
PCR， 所选菌落大部分扩增出目的条带，PacI 酶切
结果切出 30 kb 的大片段和 4.5 kb 的小条带，证明
重组成功 （图 3）；将正确的重组腺病毒 pAd-PTEN
转化 DH5α 提取质粒后再 PacI 酶切，结果一样。
2.4 腺病毒包装与扩增
用 PacI 酶切重组腺病毒 DNA 质粒， 获得重组
腺病毒基因组的 DNA 分子转染 293 细胞 ， 约经
过大约 10 d，细胞呈现 CPE 现象：细胞变圆，肿胀，
脱壁 ，呈葡萄串状 （图 4，a），得到重组腺病毒 Ad-
PTEN。
2.5 重组腺病毒的初步鉴定
重组腺病毒感染 293 细胞 24 h 后， 倒置荧光
显微镜下显示有 GFP 表达，以后逐渐增多（图 4，b），
证明重组腺病毒基因组中有 GFP 基因， 符合预期
结果。用 PTEN 引物和 pAdEasey-1 的特异性引物进
行 PCR， 从病毒液中分别扩增出 1.2 kb 和 282 bp
大小的两条带（图 5），证明重组腺病毒构建成功。
3 讨论
抑癌 PTEN 基因， 即第 10 号染色体同源丢失
性磷酸酶张力蛋白基因，其编码具有双重特异磷酸
酶活性的蛋白可以反向调控 PI3K/AKt 信号传导途
径，从而抑制细胞生长增殖及迁移 ，是继 p53 后又
一个与多肿瘤发生发展密切相关的抑癌基因。目前
对 PTEN 的研究已从肿瘤细胞扩展到神经细胞、心
肌细胞、平滑肌细胞等，相关疾病也从癌症扩展到
神经系统疾病、心衰、动脉粥样硬化等。 而 PTEN 用
于神经系统疾病的研究更是现阶段的热点。发现鼠
的大脑皮质、 小脑 、 海马及嗅球等神经元中均有
PTEN 基因表达 ，为神经元生长所必须 [4]；PTEN 基
因突变可引起巨头、癫痫 、运动失调、脑干异常、神
经节细胞瘤等变型异常，纯合体 PTEN 敲除可致小
图 1 PCR 产物电泳结果
1~3.PTEN 基因的 PCR 产物；M.Maker DL2000
图 2 pAdTrack-PTEN 的双酶切鉴定
1~4.pAdTrack-PTEN 的 KpnI / XhoI 双酶切产物；
M1.Maker DL15000；M2.Maker DL2000
图 3 阳性重组质粒的 PacⅠ酶切鉴定
1.PacI 酶切产物；2.未被酶切的 pAd-PTEN
a b
图 4 重组腺病毒载体 Ad-PTEN 转染 293 细胞
图 5 重组腺病毒的 PCR 鉴定结果
1~2.PTEN 和 pAdEasey-1 引物的 PCR 产物；
M.Maker DL2000
15 000
7 500
5 000
2 500
1 000
250
2 000
1 000
750
500
250
100
2 000
1 000
750
500
250
100
韦永琼等：携带 PTEN基因的重组腺病毒表达载体构建的研究
2 000
1 000
750
500
250
100
3 2 1 M
bp
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
鼠胚胎期死亡 ；PTEN 在神经干细胞 （NSCs） 的增
殖 、PC12 细胞的分化和维持以及协调 SVZ 前体细
胞增殖、凋亡和迁移之间的平衡中也发挥了重要作
用 [5～7]，由此可见 PTEN 与神经系统疾病关系密切 。
更重要的是现已有研究证实 PTEN 与脑血管疾病，
如脑缺血及血管性痴呆（VD）关系更密切。 PTEN 可
通过抑制 NMDARs 活性、 磷酸化蛋白激酶 B ／ Akt，
进而改变受体功能来治疗缺血性脑损伤 [8]。 试验证
实 PTEN 在突触建立的过程中也发挥重要作用，即
通过影响 NMDA 受体的表达和功能 [8]从而调节神
经元的发育和突触可塑性，大脑中 PTEN 的缺失将
导致突触结构、突触传递及突触可塑性发生缺陷 [9]。
而突触可塑性在 VD 中扮演重要角色，突触可塑性
的变化可能是引起 VD 的重要机制 [10]，血管性痴呆
是脑血管病所致的痴呆，发病率高而临床疗效不理
想。 基因治疗是近年发展起来的新的治疗模式，已
用于脑血管疾病中 ，因而 ，对 PTEN 在脑血管疾病
中作用的深入研究可为脑缺血 、VD 的治疗找到新
的靶点。
使用腺病毒作为外源 PTEN 基因导入的载体，
相当简便有效，因腺病毒具有宿主范围广、制备和
操作容易、纯化载体滴度高以及病毒感染和复制过
程不整合人宿主细胞基因组因而遗传毒性低等优
点 。 携带 PTEN 基因的重组腺病毒表达载体的构
建、包装和扩增，根据 He 等 [11]的方法及相关文献 [12，13]
进行的，同时根据实际情况做了部分调整。 即用菌
液进行 PCR 初步筛选阳性菌落。 通过此方法可同
时进行广泛的菌落筛选，在粗筛的基础上再选择阳
性菌落进行质粒提取和酶切，减少了繁琐的质粒提
取过程及大量的酶切鉴定，大大提高了效率。 另外
使用 Ad-Easy 系统 [12]更具有以下优点：可在细菌体
内完成同源重组，重组效率高，周期短；利用含不同
抗生素的平板筛选重组子，简化了筛选工作；经重
组的腺病毒带有 GFP 基因， 可直接通过荧光显微
镜监测病毒的生成，故更简便易行。 运用该系统成
功地构建了携带 PTEN 基因的重组腺病毒表达载
体， 从而为其在基因治疗中的研究价值奠定了基
础，更有望为神经系统疾病特别是脑缺血及血管性
痴呆的治疗提供新思路。
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