全 文 ：生物杖术通银
研 究报 告 刀万口了万C 日刊刀仪姆 Y B U L L E TI N 2 (X 为 年 增 刊
尿激酶催化结构域 5356A 突变体在毕氏
酵母中的表达 纯化及结晶
赵更香 江龙光 卞传兵 衰彩 侯晓敏
叶晓明 黄子详 黄明东
(结构化学国家重点实验室 中国科学院研究生院 中国科学院福建物质结构所 , 福州 35 仪K) 2
摘 要: 采用定位突变和重处延伸 Pc R 方法扩增尿激阵催化结构城基因片段 , 将其克隆至表达载体 pPI c z a A 上 ,转
化毕氏醉毋 x一3 重组蛋白通过阳离子琼脂格柱纯化 凝胶层析柱检测 , 纯度达到 9 % 以上 , 该重组的尿激璐催化结构城
(c2 79 刃 N 30 2Q /s 35 6A )不其有丝氛睦蛋白踌活性 用气相扩散法获得蛋白晶体 ,其衍射分辫率达 1.7 A ,结构解析发现在其复
合物结构中有三个抑制荆分子笨甲眺
关抽词: 尿激醉 定位突变PC R 表达 纯化 结晶
E xPres ion , P urin cati on and C ry sta llization of th e C a妞lyti e D om ain
of In activati ng U roki nas e一ty Pe Pl asndno gen A cti vator in R c址a
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PC R m eth od an d w o elo ned int o P PIC Z a A sec二to 叮 exP re s ion Plas 而 d . T h e re co mb i~ t Plas nu d was tr ans fo rme d in to yeas t x 一33 .
Th e re comb inat pro 比in was c叩tu red by th e cati on exchan 罗 ehr omat ograp场 胡d purified to 99% puri ty as an alyzed 师 罗l一日trai on
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幼ti ng~ 山 P vaPor 山伍io n . T hese e竿 tals di 任比cte d to 1 .77A in our ho us e X 一rav . T he stru etu re ar 山ysis of the u PA 一benzau di ne re ve出
th at th e Pres enee of th ree benzau di ne mo lecul es an d three 50 4 ions righ t next to uPA . T his thr ee一dim ens io初 strU CtUr e Pro vi des th
basi fo r th e des i即 of slllal m oleeul es.
K ey wo rd s : U ro ki nas e Site一m uta ted p C R E冲 ressio n P un fi二 on C 娜 正 ti on
尿 激 酶 (uro kinas e 一ty拌 plas m ino gen activator,
uPA )是一种丝氨酸蛋白水解酶,所介导的纤溶酶原
激活系统参与细胞的分化 迁移 组织重建 基质降
解等多种生理病理过程 肿瘤组织中尿激酶能特异
性地激活纤溶酶原转化为纤溶酶 ,降解肿瘤细胞外
基质和基底膜成分l]( 纤维蛋白l2] 纤维连接素 蛋白
多糖和 压而ni n) ,使其得以迁移[3] 因此 ,尿激酶是
癌细胞组织中细胞侵袭的一个重要因素 ,所以通过
收稿 日期 :2以珍一03 一20
蓦金项 目:基金委(306 25 01 1, 30 81 1 13 以67 ),中科院创新基地(KS CxZ 一yw 一R一082 ),科技部 86 3 项 目(2(X 巧从 02 A3 13 ),福建省青年人才
项 目 (2(X) 7 F3 119)
作者简介 :赵更香 (l 97 8一) 女 ,博士研究生 .研究方向:结构生物学
通讯作者:黄明东 .E一m 卜mh u助护驹irs m. ac .cn
2 X珍 年 增 刊 赵更香等 :尿激酶催化结构域 5356 A 突变体在毕氏酵母中的表达 纯化及结晶 337
多种方法拮抗I4]尿激酶的表达 ,可为抑制癌细胞的
侵袭至转移15, 6]的研究提供一定的思路
目前 ,已有大量文献报道了对尿激酶的性质 ,结
构以及功能的研究l7,8 ],但仍存在一些难以突破的问
题 ,例如蛋 白表达过程中糖基化严重 ,不容易获得
单晶 ,晶体衍射分辨率低等 本实验室采用毕氏酵
母表达体系19. 0] ,克隆 表达和纯化及结晶了尿激酶
催化结构域 ,该蛋白因将其 356 位的丝氨酸突变成
丙氨酸 ,所以不具有丝氨酸蛋白水解酶活性 ,为研
究作为底物的化合物与尿激酶的相互作用 ,了解它
们的结合位点 , 从其作为底物的化合物结构中 ,找
到更合适抑制尿激酶在体内活性的药物分子模板 ,
为该类药物分子的设计及开发创造更宽阔的领域
1 材料与方法
1.1 材料
月ehJe 那sto对s菌株 X 一33 大肠杆菌肠ploF
pPI Cz aA 质粒均购 自 Inv itro ge n 公司 ; 含全长 u以
的质 粒 由 U nivers ity of Pe ns ylvan ia, Dougl as B
Cines赠 Pfu D NA 聚合酶购自 Stra tsg6 ne ;D NA 的
合成与序列测定由上海生工生物工程有限公司完
成 ;Y N B 为 51脚 a 公司产品 ; 生物素 Biotin 为 日本
进 口;纤维蛋白购于上海生物试剂公司 ;纤溶酶原
购于中国药品生物制品检定所 ;其他试剂均为国产
分析纯
1 .2 方法
1.2.1 重组质粒的构建 以全长 u以 为模板 ,设
计引物扩增 u以 的 159 一40 5 催化结构域片段 ,并通
过重益延伸 代R 定点突变 e279A N 302Q 5195^ ,
通过 肠 I 酶切 , 连接同样酶切的 pPI CzaA 载体 ,
构建重组质粒
1.2. 2 转化酵母细胞及高抗性转化子的筛选 以
限制性内切酶 I 将重组 pPIc zaA 质粒线性化
后 ,与经处理的酵母细胞混合 ,用电转仪电击 ,参数
为 :1 5(X) V , 25uF , 2加n 电击后 , 30 温育后 ,取
20 闪 菌液分别涂布于含抗生素 zeoc in 0.lmg /耐
的 Y PD S 平板上 ,温育 2一3d ,筛选转化子
1.2. 3 重组质粒在酵母 X 一3 中的表达 重组酵
母在 5而 BM GY 中培养至 A . 二40 D , 离心收集菌
体 , 重悬于 10m l B M M Y 于 27 甲醉诱导 % h ,取
1而 培养液离心取上清 ,巧% SD S一PA G E 凝胶电泳
鉴定
1.2. 4 表达蛋白的纯化 甲醇诱导表达的该突变
体蛋白分泌到酵母细胞培养液中 , 4d 后收获 ;培养
液离心 ,取清液加 3 倍体积水稀释 ,过阳离子亲和
层析柱 , 用 2(X ha l起始缓冲液 (20m M KH ZP04-
N a0 H ,pH 6.5) 洗 柱 后 , 以 洗 脱 缓 冲液 (20m M
K H 2P() 4一N a0 H , 0.5M NaCI, pH 6.5 )进行洗脱 ,收集
洗 脱 峰 处 蛋 白 , SD S 一PA G E 和 凝 胶 层 析 柱
Su pe rd ex 75 检测洗脱峰分子量及纯度
1.2. 5 纤维蛋白一琼脂糖平板法测定表达蛋白的
活 性 纯 化 的 蛋 白在 20 m M K H ZP O;一N a0 H ,
pH 7.4 条件下与纤溶酶 (0.12 unitz林l)按体积 比 12
1 , 1巧, l/ ro 混合 ,点纤维蛋白一琼脂糖平板 , 37 温
育 ,培养过夜 ,实验重复 5 次 ,并设相应对照
1.2. 6 表达蛋白的结晶 纯化的蛋白 ,经透析钮扣
脱盐 ,浓缩至 13 .sm g/nil ,用 2闪 蛋白与等体积母液
混合对 Inil 母液 (l .95 M 硫酸按 , 5% PEG4的 , 20m M
柠檬酸钠 , pH4. 6) 进行气相扩散平衡队川结晶 , 3
天后 ,成长为 0.45x0.25x0.25m m 3的晶体
晶体衍射之前 , 首先经过含 25 % 甘油的母液 ,
再快速地放于液氮预冷的 x一ra y 衍射仪 ,晶体立即
被冷冻 ;收集晶体数据 ,用 PR O化 U M 初步处理 以
uPA 一benz arn idine (PD B , ID :IFSK )结 构为模板 ,接着
用 CCP4 13 和 CN S 软件包进行结构解析 ,程序 0 上
手动调节结构
2 结果
2.1 重组质粒的构建与鉴定
重组质粒抽 提 , 用 限制性 内切酶 Ec oRI 和
Ec oR v 进行酶切 , 出现约 2 10 bp 和 1 喇x 帅 片
段 ,与分析结果一致 ;测序结果也表明重组表达质
粒的目的基因序列与设计一致 , 其中编码 279 位
Cys 的基因 TG C 突变为编码 Al a 的基因 G C C ,编码
302 位 A sn 的基因 A A T 也 突变为编码 Gl n 的基因
CAA , 编码 35 6 位 Se r 的基因 TC A 也 突变为编码
A la 的基因 G CC
2. 2 表达蛋白的纯化
采用阳离子层析柱捕获分泌在培养基中的尿
激酶突变体蛋 白 ,收集峰处蛋白质.过凝胶层析柱
Su伴 rd ex 75 (图 l)和 15% SDS一pA G E (图 2)检测蛋
白质纯度. 如图 1所示 , 出现 13.79ml 洗脱的单一
338 健物杖术通报 B io te chnole盯 2 兀月 年增 刊
峰 ,从电泳和凝胶层洗柱结果中得出 ,蛋白质纯度
已达到 9 % 以上 ,且蛋白浓度约为 lm g/ml
留
圈 3 纤维蛋白一琼脂箱平板检测衰达蛋白活性
1 :H 刃十plas m ino ge n ;2一3 :尿激酶催化结构域突变体+
禅as m in oge n;4 :尿激酶标准品十plas mi nog en
二已当= 二岁鉴兰聋= 进生
圈 1 凝胶层析柱分析由 S P F F 柱捕获尿激醉
催化结构域突变体
2. 4 突变体蛋 白的结晶
用坐滴气相扩散法I5J进行该蛋白的结晶 , 3 天
出现晶体 ,晶体体积为 0.45x0.25x0.25m m , (图 4 )
该晶体经 x一ra y 衍射 , 分辨率达 1.7吸 , 空间群确
定为 R3 , 单胞参数为a=b二12o.o73A , =42.252A ,
a =日二9() o, 丫二1200
用分子取代法{6懈 析结构 ,发现一个非对称单
元中含一个分子 ,经过 CN S 程序包精修结构 ,得出
结构中一个尿激酶分子中含有 3 个硫酸根离子外 ,
还有 3 个苯甲醚分子 ,分别处于尿激酶分子中的不
同表面区域中 ,其中水分子介导着蛋白与苯甲醚分
子之间的相互作用
助974枷砚
圈 2 15% S D S 一PA G E 电泳检测 由supe rd eX 75
捕获的尿激醉催化结构域突变体
M :蛋白分子里标准 1 :凝胶层析柱捕获的蛋白
2 .3 纤维蛋白一琼脂糖平板法测表达蛋白的活性
活性的尿激酶催化结构域能使纤溶酶原激活
成纤溶酶 ,后者能降解纤维蛋白 ,从而在纤维蛋白-
琼脂糖平板上形成鲜明的透明圈fI41 从图 3 可以看
出 ,表达的尿激酶催化结构域不能将平板上的纤维
蛋白溶解 ,即得出如下结果 :将尿激酶 35 6 位的活
性位点 Se : 突变为 Al a , 失去其激活纤溶酶原的全
部活性 ,因此不能溶解纤维蛋白 ,形成溶圈现象
洲l4
圈 4 尿激醉催化结构域突变体晶体
3 讨论
巴斯德毕赤酵母 是一种甲基营养菌 ,能在低廉
的甲醇培养基中生长 ,甲醇可高效诱导甲醇代谢途
径中各酶编码基因的表达 ,因此生长迅速 醇氧化
酶基因 A O X I 所属强启动子 表达的可诱导性是巴
斯德毕赤酵母表达系统的只大优势 该表达菌株与
2(X 为 年 增 刊 赵更香等 :尿激酶催化结构域 5356A 突变体在毕氏酵母中的表达 纯化及结晶 339
其他真核 原核表达系统相比 ,具有表达过程中糖
基化程度低 ,高分泌 ,高表达 ,表达蛋白翻译后加工
等特点
尿激酶的三维结构从上个世纪开始 , 已陆续出
现研究其本身及与多种抑制剂复合物的相互作用 ,
从而得知 , 除它们的结合位点 sl s2 S3 及 S4 外 ,
其活性位点 356 位的丝氨酸在参与它们的相互作
用同时 ,也起重要的蛋白酶水解作用 ;故从大量文
献中得知 , 由于尿激酶的丝氨酸蛋 白水解酶的特
点 ,使其与很多化合物发生水解作用 ,这些化合物
成为尿激酶蛋白的底物 ,而非抑制剂
本文采用酵母表达体系 , 在 PC R 的扩增过程
中 , 突变其搪基化位点和易形成聚集体的位点lv1
及活性位点 蛋白的搪基化和聚集影响其本身性
质 ,使蛋白均一性降低 ,给蛋白结晶造成严重障碍;
活性位点的突变使蛋白丝氨酸蛋白水解酶活性丧
失 ,而后 ,研究作为底物的化合物与尿激酶的相互
作用 ,了解它们的结合位点 ,从其结构中找到更合
适抑制尿激酶在体内活性的药物分子模板 ,为该类
药物分子的设计及开发创造更宽阔的领域
同时 ,为提高蛋白的表达量 ,采取改变以下条
件优化酵母发酵条件 :pH 值 ,溶氧量 ,细胞浓度 ,甲
醇浓度 ,甘油量 ,还有添加不同浓度的硫酸按等 ,结
果显示在 pH 6. O , 溶氧值高 , 添加 1.0% 甲醉诱导 ,
2.0% m zv (N H 4)250 4 的条件下蛋白的表达量较高 ,
为以后大量的外源蛋白的表达打下了基础 ;蛋白在
有硫酸按的条件下表达量较多 ,与蛋白结晶所使用
的沉淀剂相同 , 说明该蛋白在硫酸馁溶液中均一
稳定 蛋白结构固定 以及该蛋白结构柔韧性降低
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