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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
小麦、黑麦 FISH技术特异序列探针的研究进展
汪慧 郭长虹 郭东林
(哈尔滨师范大学生命与技术科学学院 黑龙江省分子细胞遗传与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150025)
摘 要: 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术在染色体定位、基因克隆、遗传标记以及染色体畸变
研究中得到了广泛的应用。随着分子生物学的飞速发展，用于 FISH技术的染色体特异重复序列探针的开发和利用有了巨大
进展。就近年来小麦、黑麦等 FISH技术中染色体特异重复序列探针的研究进展及应用作一综述。
关键词: FISH 特异序列探针 小麦 黑麦
Development of FISH Specific Sequence Probe in Wheat and Rye
Wang Hui Guo Changhong Guo Donglin
(Key Laboratory of Molecular Cytogenetics and Genetic Breeding of Heilongjiang Province，
College of Life Science and Technology，Harbin Normal University，Harbin 150025)
Abstract: FISH(fluorescence in situ hybridization)technique is an important non-radioactive in situ hybridization technology
widely used in chromosome location，gene cloning，genetic markers and chromosome aberration research． With the rapid development
of molecular biology，a great progress has been shown in the FISH chromosome specific probes of repetitive sequences． The research
progress and application of chromosome specific repeat sequence probe in wheat and rye were reviewed．
Key words: FISH Sequence-specific probe Wheat Rye
收稿日期:2011-03-17
基金项目:科技部国际科技合作项目(2009DFA32470) ，黑龙江省科技攻关项目(GA08B104)
作者简介:汪慧，女，硕士，研究方向:植物遗传学;E-mail:yaolovehui@ 126． com
通讯作者:郭东林，女，博士，副教授，研究方向:植物遗传学;E-mail:gdl1225@ 163． com
1 FISH技术
1974 年 Evans首次将染色体显带技术和染色
体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。20
世纪 70 年代后期，人们开始探讨荧光标记原位杂
交(fluorescence in situ hybridization，FISH) ，即 FISH
技术。1981 年 Harper 成功地将单拷贝的 DNA 序
列定位到 G 显带标本上，标志着染色体定位技术
取得了重要进展。20 世纪 90 年代，随着人类基因
组计划的进行，由于绘制高分辨率人类基因组图
谱的需要，FISH 技术得到了迅速的发展和广泛应
用。此后非放射性的荧光标记原位杂交(FISH)技
术在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展
起来。
同位素标记的放射性探针的优势在于对制备样
品的要求不高，可以通过延长曝光时间、加强信号强
度来提高灵敏性。其缺点是探针不稳定、自显影时
间较长、放射线的散射使得空间分辨率不高以及同
位素操作繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些
不足。FISH技术以荧光标记的核酸片段为探针，与
染色体上或 DNA显微切片上的特异序列进行杂交，
通过荧光检测系统检测信号从而确定探针序列在染
色体上或 DNA显微切片上的杂交位点［1］。FISH 技
术现已被广泛应用于染色体鉴定、基因定位和异常
染色体检测等领域。其优点如下:荧光试剂和探针
经济安全，无污染;探针稳定;特异性好、定位准确、
检测时间短，试验周期短;灵敏度高，FISH 可定位 1
kb的 DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当;多色
FISH通过在同一个核中显示多种颜色来同时检测
不同序列;既可以在玻片上显示中期染色体数量和
结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体 DNA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
的结构。
近年来，在 FISH 技术的基础上发展起来的分
子遗传学新技术不断出现，如多色 FISH 技术、染色
质纤维荧光原位杂交(chromatin fiber FISH)和 DNA
纤维荧光原位杂交(DNA fiber FISH)技术等。多色
FISH通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与
不同的探针结合(直接法) ，在一个染色体中期分裂
象或细胞核中可呈现多种颜色标记。多色 FISH 利
用不同颜色的荧光素标记不同的探针，同时对一张
制片进行杂交，能将不同的靶 DNA同时进行定位和
分析，并能对不同探针在染色体上的位置进行排序。
多色 FISH 技术克服了 FISH 技术的许多局限性，能
同时检测多个基因，分辨复杂的染色体易位和超二
倍体或多倍体的间期细胞。
在 20 世纪 90 年代出现的 DNA 纤维 FISH，利
用化学方法对染色体进行线性化，再以此线性化的
染色体 DNA纤维为载体进行 FISH，使 FISH的分辨
率显著提高。这种方法除了显著提高了 FISH 的空
间分辨率(可达 2. 78 － 3. 3 kb)外，也使 FISH 的灵
敏度进一步提高(可达 200 bp)。DNA 纤维 FISH在
1996 年被引入植物分子细胞遗传学研究，在马铃
薯、番茄和甘蓝等植物中进行了重复序列的染色体
定位和准确的基因定位［2］。流式分拣植物染色体
的 FISH技术也可用于研究染色体的超微结构，但
此技术需要流式细胞仪来对染色体进行分拣，其应
用有一定的局限性。
FISH技术所用的探针类型十分广泛，大小可以
从几百 bp到几 Mb。根据不同的需要可将探针分为
基因组探针、染色体特异重复顺序探针、染色体文库
探针、单一序列探针、RNA探针等，还包括较长的基
因组克隆，如 BAC(bacterial artificial chromosome)、
YAC(yeast artificial chromosome)以及分子标记等，
探针可通过克隆、酶扩增及化学方法合成获得［3］。
FISH技术从 DNA 水平上检测染色体的构成和
变化情况，可以准确地显现异源染色体或其片段存
在于染色体(组)中的位置，对染色体或染色体片段
的遗传变化分析起着重要作用。在植物育种中也被
广泛用于进行目标基因序列的定位分析。运用
FISH技术也可以对转基因后代进行鉴定，可判定植
株后代是否带有外源 DNA片段，从而在细胞分子水
平上证实杂交或转基因是否成功。利用 FISH 技术
通过对特定 DNA 序列特别是编码序列在染色体上
分布位点的研究，对探讨基因组起源和进化具有重
要的理论意义。在小麦育种工作中，利用染色体工
程进行外源基因的转移是目前公认的重要手段。在
小麦与近缘物种的远缘杂交后代中选育异附加系、
代换系和易位系的过程中 FISH 技术发挥了重要的
作用，FISH技术对了解小麦与近缘物种染色体的部
分同源关系也有重要作用［4］。针对近年来在小麦、
黑麦中广泛使用以及新开发的几种染色体特异重复
序列探针进行综述。
2 染色体特异重复序列探针的应用
重复 DNA序列可以作为分子标记来研究小麦
基因组组成以及基因组进化，重复序列也可以作为
小麦与近缘物种间杂交的分离群体中外源染色质是
否存在的渗入标记或染色体臂上的易位断裂位点的
指示物。
2. 1 pAs1 序列的应用
pAs1 序列是一个非常有用的探针序列，与其他
序列如 GAA 卫星序列、pSc119. 2 等相结合能绘制
小麦的详细核型。Pedersen 和 Langridge［5］提出以
pAs1 序列和 GAA 卫星序列(pHvG38)为基础的详
细完整的小麦分子核型。Pedersen 等用 Aegilops
tauschii克隆的 pAs1 和用大麦克隆的 pHvG38 进行
双色荧光原位杂交，鉴定出六倍体小麦的染色体中
心区域。两个探针的结合体能简单的辨别小麦的第
3 组染色体［5］。Mukai 等［6］使用高度重复序列探针
pSc119. 2 和 pAs1 识别了所有的 B和 D组染色体以
及小麦的 1A、4A 和 5A 染色体。María Rosa Ferrari
等［7］得出用 pSc119. 2 来鉴定小麦全部 B 基因组以
及 4A、5A 基因组，其他基因组用 pAs1 鉴定。通过
使用来自黑麦的高度重复序列 pSc119. 2 和插入了
重复序列节节麦的 pAs1 为探针进行双色 FISH 分
析，Mukai等［6］创立了中国春小麦的 B 和 D 基因组
染色体核型模式图。
2. 2 pSc200 序列的应用
重复 DNA序列 pSc200 是在小麦、黑麦基因组
及染色体鉴定中应用比较广泛的一个探针。1996
年 Vershinn 等［8］用 Southern blotting 和原位杂交分
析时，发现在小麦染色体中没有重复 DNA 序列
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2011 年第 8 期 汪慧等:小麦、黑麦 FISH技术特异序列探针的研究进展
pSc200，但是在小麦 －黑麦杂交多倍体中很容易就
能找到此序列。pSc200 在鉴定小麦中黑麦外源种
质及染色体定位的工作中得到广泛的使用。1999
年 Alkhimova等［9］发现在中国春和 Imperial 附加系
的 2R染色体长臂上的 pSc200 信号消失。近期的研
究中有两个有趣的现象，一个是 pSc200 的 FISH 信
号不出现在 Mianyang11 和 Kustro 的多倍体物种的
第 4 组黑麦染色体的端粒或近端部区域;另一个是
在中国春和“AR106BONE”的多倍体物种中的
pSc200 FISH 位点比“AR106BONE”中的多。结果
说明当染色体在杂交物种中，或者在多倍体形成早
期多倍体位点经过急速的变化时，像 pSc200 和
pDc1R-1 这种端粒或近端粒的串联重复 DNA 序列
非常不稳定。表明 DNA 片段在多倍体之间进行了
染色体交换，需要更多的研究来阐述这些 DNA片段
交换是怎样产生的。
2. 3 PCR的标记序列探针的应用
PCR的标记用散布在特定基因组中的重复序
列扩增，不仅可以迅速解决多倍体物种、杂交种质资
源和附加系易位系中特定基因组的存在或缺失，还
能 PCR分析条带的重复性。
RAPD分析是一种用大量的重复基因组去隔离
小麦族 Triticeae 植物的还原转座子序列的有效方
法。特异 PCR 标记 SaO5411序列进行 FISH 分析可
以测出黑麦染色质被引入小麦背景下，尤其是在早
一代的小麦 －黑麦杂交物种［10］。在特定的小麦染
色体位置:2AL、1BL、5BS、1DL、2DL 和 6DS，能用
RAPD产出的 OPF － 031296作为 FISH的探针测出 A．
elongatum的 E基因组染色质其存在于所有小染色
体片段基因［11］。此外，在小麦背景下的节节麦草染
色体已被报道利用 RAPD 获得了 E 基因组的特殊
重复序列探针［12］。Nagy 等［13］将原位杂交和双色
FISH与大麦 SSR 遗传图谱相结合来发展小麦 －黑
麦易位系的鉴定。Blanco 等［14］报道来自 1A 和 1D
的几对小麦 SSR 引物被用来定位重组染色体和在
硬粒小麦染色体背景下的 1D染色体片段。
黑麦的 RAPD 标记———Sc10C和 Sc20H，将作为
小麦与黑麦、小麦与 Triticale种间杂交的分离群体中
黑麦染色质是否存在的渗入标记。此外，它们可以作
为黑麦染色体臂上的易位断裂位点的指示物［15］。
3 几种新型 FISH 技术的染色体特异重复
序列探针
3. 1 小麦特异重复序列 Fat元件
Fat元件是一种新型的小麦 DNA序列高度重复
的特异元件。这个元件可能第一次出现于大麦属
(Hordeum)从最后的普通祖先中分离过程中。Fat
元件与任何已知的还原转座子之间没有联系，代表
一种新型的小麦特异性重复 DNA家族，显示出成簇
分散的分布。Ekaterina 等［16］研究显示 Fat 序列组
成比较复杂。在小麦的 3B 染色体的细菌人工染色
体(BAC)末端序列中分离得到的 TAACSPALLhA_
1119J14(131 kb) ，其长度为 129 880 bp，并且有 264
个 465 bp的 Fat重复拷贝在其上分布。
Fat 像其他重复序列一样，可以被克隆用于
FISH分析，进行染色体鉴定和染色体水平进化过程
的研究。目前已经报道的大多数串联重复序列通常
定位在染色体近端部或者近中心部，而据 FISH 技
术将 Fat元件定位在染色体的近端部区域。因其高
度的特异性可作为 FISH 的探针，Fat 元件在小麦中
进行染色体鉴定以及染色体组的进化分析。
Ae. tauschii 的 D 基因组、山羊草属、黑麦属和
冰草属的染色体中也显示出相当特异保守的 Fat 杂
交信号。Ekaterina 等［16］发现，在所有的小麦属
(Triticum)和山羊草属(Aegilops)中，Fat元件最多存
在于 D基因组上。Fat元件作为探针，在 Triticum和
Aegilops的 D 基因组染色体和偃麦草属(Agropyron)
的 S 基因组染色体上显示了大量的荧光标记，Fat
元件探针杂交的荧光强度高的情况多出现在 Ae.
tauschii。Fat探针在一些小麦品系中的染色体近端
区产生不稳定的、分散的荧光信号。以 Fat 为探针
的 FISH杂交在披碱草(Elymus dahuricus)和天蓝偃
麦草(Agropyron glaucum)之间有明显的不同。在六
倍体 A． glaucum的染色体中，有 14 条显示出较强信
号，4 条在近端区有一小簇清晰信号，余下的 42条几
乎没有杂交位点。除了在 H. vulgaue和 H. spontaneum
中未检测到强烈的 Fat 杂交信号之外，其余小麦族
Triticeae中的特异染色体位点上都产生了强烈的杂交
信号，并且在第 4组染色体上的信号最强。
3. 2 小麦重复序列 WE35
WE35 是从小麦基因组中分离出来，该序列由
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320 bp 的重复单位组成，占全部小麦 DNA 的
0. 002%，在基因组中呈单向连续或非连续分布。在
其他单子叶植物如大麦(Hordeum vulgare)、玉米
(Zea mays)、燕麦(Avena sativa)、珍珠粟(Pennisetum
glaucum)、黑麦(Secale cereale)和高粱(Sorghum vul-
gare)中也发现类似于 WE35 的重复序列。重复单
元附近保守的 475 bp 序列与谷物还原转座子 LTRs
的 5-末端有 70% －76%的同源性［17–21］。该串联重
复序列元件及其两侧的序列在单子叶植物的进化中
是十分保守的。Suoniemi 等［22］证明大麦 BARE-1
LTRs在没有 TATA盒时不能活跃地转录，小麦基因
组中的 WE35 重复元件的分子结构和功能的相关性
目前是未知的，需要进一步研究。
用标准的小麦品种‘中国春’双端体和缺体—
四体来确定 WE35 重复序列的染色体定位。其结果
在所有的双端体和缺体—四倍体小麦的 DNA 杂交
中显示出梯状模式［23］。而 Ueng 等［24］的原位杂交
结果表明，在以 7 个 WE35 单位组成的 p551 为探针
时显示强烈的杂交信号，并且在小麦‘Arthur71’和
‘Oasis’基因组的染色体的近端区上有高度精确的
定位。WE35 可以被认为是染色体特异性重复序
列，作为一个在小麦族遗传、系统发育和进化研究的
分子标记。
3. 3 小麦着丝粒区 pHind258 序列
pHind258 序列与谷物的着丝粒 Ty3-gypsy 反转
录转座子的长末端重复序列有同源性。pHind258
有一对 192 bp 的串联重复序列。Ito 等［25］FISH 分
析表明，192 bp 的 pHind258 探针在小麦和黑麦的着
丝粒区有强烈的克隆杂交信号，但在大麦中的信号
很弱。pHind258 探针在小麦染色体上信号程度不
同，A组染色体信号强，B 基因组染色体信号中等强
度，D基因组染色体信号微弱，这与预计的在六倍体
小麦的祖先物种中的 192 bp 的重复序列拷贝数
相符。
在谷物品种中，有两个保守的着丝粒区域重复
序列家族。谷物着丝粒序列家族(CCS1)起源于短
柄草属，在小麦、大麦、黑麦、玉米和水稻［26］的着丝
粒区域也是保守的。Presting 等［27］提出与大麦同源
的 CCS1 显示出 Ty3-gypsy 还原转座子的长末端重
复(LTRs)的一部分。高粱序列 pSau3A9，在谷物染
色体的着丝粒区也是保守的［28］。Miller 等［29］表明，
pSau3A9 序列与 Ty3-gypsy 还原转座子的聚编码区
的整合基因序列有部分同源。
最近，有报道表明部分或全部 Ty3-gypsy还原转
录转座子的多个副本分散在大麦、玉米、大米和小麦
的着丝粒区域［30 － 33］。除了谷物保守的着丝粒序列，
物种特有的着丝粒重复序列在高粱、玉米、大米、甘
蔗和大麦中分离出来［29，30，34 － 37］，并且一个基因组特
异重复序列在六倍体小麦的 A 组和 B 组染色体上
鉴定出来［38］。
3. 4 黑麦 pSaO5411 序列
Jia等［39］用 RAPD方法分析小麦和小麦—黑麦
S． africanum 双二倍体物种。在黑麦 Secale africa-
num 基因组中分离出长度为 411 bp 的重复序列
pSaO5411。此序列与 Triticum turgidum 的还原转座
子Wis-2p-copia一致。BLAST分析推测，pSaO5411的
氨基酸序列与 Oryza sativa 亚类的 Ty1-copia 还原转
座子蛋白质编码区域具有较高的同源性，表明
pSaO5411序列是 Ty1-copia还原转座子的一部分。
对黑麦 Ty-copia还原转座子的分布存在着不同
的报道，2001 年 Francki［10］分离出一个 Ty1-copia 的
还原转座子，发现它只散布在黑麦染色体的着丝粒
异染色体区，而 Pearce 等［40］在 1997 年报道黑麦
Ty1-copia的还原转座子序列不在黑麦染色体的着
丝粒区和端粒异染色体上。所以根据 pSaO5411 在
黑麦染色体上独特的分布可以将 pSaO5411 当成一个
新的类 Ty1-copia 序列。在 Jia 等［39］的研究中，
pSaO5411标记在小麦—黑麦 S. africanum双二倍体基
因组中的 14 条黑麦 S. africanum染色体上都显示出
散在的强杂交信号，信号分布在黑麦除端部以外的
染色体臂上，只在少数小麦染色体上有模糊的杂交
信号。这种特异性标记序列被测定出能够追溯小麦
背景下的黑麦 Secale染色体组成。
3. 5 黑麦 pSc10C和 pSc20H 标记
Ko等［15］在黑麦渗入小麦基因组中鉴定出两种
黑麦基因组特异的随机扩增多态性 DNA(RAPD)标
记，命名为 pSc10C 和 pSc20H，分别为1 012 bp和
1 494 bp。序列分析表明，pSc10C 和 pSc20H 片段与
反转录转座子相关，并在植物基因组中广泛分布。
pSc10C和 pSc20H 经常与重复 DNA 家族如内部串
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2011 年第 8 期 汪慧等:小麦、黑麦 FISH技术特异序列探针的研究进展
联重复序列、反向重复序列、回文结构相结合。
BLAST表明，pSc10C 与大麦的类 gypsy 还原转
座子的长末端重复序列(LTR)有较高的同源性［41］。
约 200 bp 的 pSc10C 还显示与小麦端粒相关序列
PSR2137 有 84% 的同源性［42］。Presting 等［27］用
FISH已经证明了 Ty3-gypsy 还原转座子定位于谷物
染色体的着丝粒区。pSc10C 序列表现出与大麦中
类 gypsy的还原转录转座子 5LTR和 3LTR有高度
的序列同源性，表明 pSc10C 序列可能是 LTR 还原
转座子的一部分，优先存在于近着丝粒区域［41］。
pSc10C探针与六倍体黑麦的染色体杂交中，在 A和
B基因组染色体上几乎没有信号。黑麦染色体杂交
信号在近着丝粒区强烈。对早中期的黑麦染色体进
行 FISH显示，清晰的 pSc10C 杂交信号在染色体近
中心区域，但着丝粒区域上没有［15］。在染色体上并
非全部显示强的 FISH 信号，表明黑麦染色体中含
有这个序列的拷贝数目不同。
pSc20H核苷酸序列与一些已报道序列中的
gypsy逆转录转座子有长度较短的同源性。BLASTX
分析表明，推测 pSc20H 的氨基酸序列与高粱、大
米、菠萝和拟南芥等物种的还原转座子中已报道的
编码序列有高度的同源性，并且 pSc20H 序列杂交
信号与类 Ty1-copia的还原转录转座子相似，散布于
整个黑麦基因组中［40］。pSc20H 探针在六倍体黑麦
属的所有黑麦染色体上端粒以外区域都有杂交信
号，而在小麦染色体上没有。Sc20H 探针信号遍布
在除端粒区和核仁组织区以外的整个基因组中，将
近染色体长度的 3 /4。
这两个标记可以用来选择或跟踪所有小麦–黑
麦易位系，以及准确描述黑麦染色体臂的近端和远
端地区的易位断点位点。
3. 6 黑麦 JNK1 序列
Achrem 等［43］在 Secale vavilovii Grossh． 的第 3
组的 2R 染色体上建立一个附加的异染色单体条
带。Nagaki等［44］报道这个附加条带的结构是 1 200
bp长的串联重复序列，在特定区域重复 4 000 次并
且具有高度甲基化。这个附加条带的异染色体是由
JNK重复家族组成的，其重复序列不同于黑麦的端
粒、着丝粒和异染色质的结构。JNK1 的序列与 H．
chilense(HCH1016，HCH1018，88%)的 5S rRNA 高
度相似，并与 Marinum (HMAR003，97%)的 5S
rRNA序列片段也高度相似。此外，JNK1 的相同片
段显示出与小麦属(Monococcum)的 Angela 反转录
转座 子 有 92% 相 似，与 属 于 CACTA 家 族 的
SNAC426K20-1转座子有 89%相似，与偃麦族 Zinge-
ria biebersteiniana 近端着丝粒序列有 78%相似。与
JNK1 相似的序列可能是偶然的，也可能 JNK1 是 5S
rRNA基因序列的一个古老的可变的遗传元件，经
过一系列的进化，这些序列积累在 2R 的染色体的
特定区域上。Achrem 等［43］ 的研究结果表明，
S． vavilovii 2R 染色体上的附加异染色体条带是有
缺失基因组或可变基因组聚集而成的元件。在
S. vavilovii Grossh．系中发现一个附加的异染色体条
带是具有活性的异染色质，这个现象在日本当地的
黑麦(S. cereale L．)中也有发现［44］。FISH 分析表
明，JNK1 的序列在所有黑麦染色体上是分散的［45］。
以 JNK1 的序列为探针分析显示在 S. vavilovii 的 2R
染色体上有强烈的杂交信号［46，47］。
4 展望
可以预见，随着 FISH 技术的发展和不断创新，
这些新型的 FISH 探针序列必将在基因组研究、育
种等方面得到更为充分的利用，发挥更为重要的作
用。FISH技术在基因组的同源区域的预测位点上
有影响力和有价值的特性，必定能进一步扩展人对
麦类作物基因组的认识，并且为创建更好的农业特
性提供一种有力的选择方法。
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(责任编辑 马鑫)
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