全 文 ：遗 传 学 报 , 27 ( 10 ) : 8 78一 882 , 20 00
A e招 G e n e点e a 及n ic a
用顺序 G IS H 一F IS H 技术鉴定小麦一中间
堰麦草小片段易位系
刘道峰 , 王献平 , 景建康 , 张相岐①
(中国科学院遗传研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室 , 北京 10 0 101 )
摘要 : 利用顺序基因组一重复序列荧光原位杂交技术对 1 个来 自中 3不育系和普通小麦恢 75 杂
种后代稳定株系 9H 62 76 一2的染色体组成进行了分析 。 以中间堰麦草 (七 r口p , r on in et ~ id u m)
基因组 D N A 为探针的荧光原位杂交结果表明 , 9H 6 276 一 2的体细胞中有 42 条染色体 , 包括 20
对小麦染色体和 1对小麦一中间堰麦草易位染色体 , 中间堰麦草染色体的易位片段位于 1对小
麦染色体的端部 。 进而用重复序列探针 p s o l lg 进行第 2 次荧光原位杂交 , 证明 9H 62 76佗中的
中间堰麦草染色体易位片段位于小麦 Z B 染色体的短臂上 。
关键词 : 小麦 ; 中间堰麦草 ; 易位系 ; 顺序 GI S-H FI S H
中图分类号 : Q3 4 3 文献标识码 : A 文章编号 : 0 379礴 1 7 2 (2 000 ) 10 { 57 8一 5
中间堰麦草 〔gA 八$移夕or n in et rme id u m (oH st ) B e au .v ]具有许多对小麦改 良有用的性
, 如高蛋白 、 抗多种病虫害 、 耐盐碱 、 抗干旱等 , 是小麦改 良的重要近缘种材料 . 几十年
, 国内外 已经培育出了一些小麦一中间堰麦草 的 (部分 )双二倍体 、 附加系 、 代换系和易位
。 准确 的染色体鉴定是进一步改 良和利用这些异源材料和有 目的转移有用基 因的基
来状础系
原位杂交技术是一项利用标记的 D N A 做探针与染色体 D N A 杂交直接检测外源染色
质和识别染色体的技术 。 近年来 , 已有一些利用复合技术鉴定异源材料和识别染色体的
报道 。 irF e be 等 l[] 用 顺序分带一原 位 杂交 ( se q u e n it al hc or m os om e b an d ign an d in : iut
hy ibr id
z
iat on )技术分析了 1个小麦一中间堰麦草部分双二倍体 T A -F 46 的染色体组成 , 识别
了附加 的 7 对中间僵麦 草染 色体 。 iJ an g 等 2j[ 用 同样 的技术鉴定 了小麦 一黑 麦易位系 。
M l lk ia 等 l3j 用两个重复序列 p s 。 1 19 . 2 和 PA S I 作探针 , 通过原位杂交带型分辨出 17 对小麦
染色体 。 eP de sr en 等 l4] 用两个重复序列探针 PA S I 和 p vH 3G 8 成功地识别了小麦的所有 21
对染色体 。 1 992 年 , eH sl o -P H a币 so n 等 5I] 首先建立 了植物染色体的重 复原位杂交技术
( er p or ih gn )
, 分别利用 5 r R N A 和 1 8 5一5 . 8 5一26 5 r R N A 基因为探针对大麦染色体进行了
两次 原位杂交 。 随后 , uC de adr 。 & oJ vu el 〕在黑 麦染 色体制 片上用 5 个重复序列探针
收稿日期 : 20 0 0刃 5一 14 ; 修订日期 : 2 0 0 0 { 6一 19
基金项目 : 国家 “九五 ” 攻关项目 (批准号 : %一 14 刁 1刁 6刃 2) 和中国科学院 “九五 ” 特别支持项目 (批准号二 K Z 95-T
0 2一 2一 9 )资助
作者简介 : 刘道峰 ( 19 7 4) ,男 , 遗传学专业硕士研究生 , 主要从事植物分子细胞遗传学研究
① 通讯联系人 , E e m ial :x qz l l a n g@ ig tP 朗￡n
10期 刘道峰等 :用顺序 GI SH- FI S H技术鉴定小麦一中间堰麦草小片段易位系 879
(TP叮 1、 p T a 7 9 4、 p s c 3 4、 p s e 7 4、 p s c l 19 . 2 )成功地进行了 3次原位杂交 , 并识别 了黑麦的全
部染色体 。 这些工作都证明利用重复序列探针的原位杂交是识别染色体的一项有效技
术 .
本文利 用基 因组 D N A 和重 复序列 D N A 为探针 进行 重复原位杂交 的方 法 O顶序
GI S H - FI S H法 )对 1个抗条锈病的小麦一中间堰麦草杂种材料 9H 6 2 7 6一2的染色体组成进行
了分子细胞遗传学分析 , 证明 9H 6 2 76 一2是 1个小麦一中间僵麦草的小片段易位系 , 并进一
步识别了易位的小麦染色体 。
1 材料和方法
1
.
1 材料
9H 62 7 6
一 2 , 由哈尔滨师范大学李集临教授惠赠 , 是 1个来 自小麦一中间堰麦草部分双
二倍体中 3不育系 (G 中 3 )与普通小麦恢 75 杂交后代的稳定株系 , 高抗条锈病 。 中间堰麦草
(gA
r op y r o n in et r m e id u m )和普通小麦品种中国春 ( rT i ti e u m a e it v u m e v C ih n e s e S p ir n g )由
本实验室繁殖 和保存 。 重复序列探针 p s cl gl 由 M . D . C a l e 教授 ( J o h n nI ne s eC n et r U K )
提供 。
1
.
2 染色体制片
9H 62 7 6
一 2的种子 在 25 ℃下 萌发 , 根 长 1 . 5一 .2 co m 时 , 取根尖于 冰水 中预处理 2 一
24 h
, 用卡诺固定液 (无水酒精 :醋酸 = 3 : l) 于 4℃ 下固定 2一 d3 。 制片前 , 根尖用 1% 醋酸
洋红染色 巧一 20 而 n ,普通压片法制片 , 液氮冷冻揭去盖玻片 , 空气干燥 。 制片直接用于原
位杂交或 一 2 0℃保存备用 。
1
.
3 基 因组 D N A 的提取和探针标记
用 C T A B 法提取 中间堰麦草和中国春的基 因组 D N A 。 采用 瓦ck T r a n s liat o n 方法用
压 go ix ge in 二 1 1一 d UT p标记 中间堰麦草基 因组 D N A 和用 q 3一d C Tp 标记 重复序列探针
SP cl 1 9
。 中国春基因组 D N A 高压剪切 5而 n , 用作封阻 D N A O
1
.
4 基 因组原位杂交
参照 Q 峪afst on 等7[] 的方法 , 略加修改 。 染色体制片于 60 ℃下处理 hl , RN白s e A (2 户g / 司 ,
2 x S S C ) 3 7 oC 下处理 l h , 2 x S S C 室温下漂洗 5而 n , 70% 甲酞胺 7 0 oC 下变性 3而 n , 用 一 2 0 oC
预冷的系列酒精脱水 , 70 % 、 9 5% 和 10 % 各 5而 n , 气干 20 而 n 。 杂交液 (每 20 娜含探针 20 gn ,
s D N A 10 雌 , 中国春基因组 D N A .3 0户g , 50 % 去离子 甲酞胺 , or % 硫酸葡聚糖 , 0 . 1% S邵 ,
2 x S )C 在沸水中变性 10而 n , 迅速冰浴 10 而 n , 每张片子加 20 川杂交液 , 加盖玻片 , 37 ℃下杂
交 过夜 。 信号 检 测用 荧光抗体增 强 系 统 (R~
s e nt A n it 饮劝y E n h an c e r eS t oF r DI G
氏cet iot n , B M) 进行放大 , 实验按 B co ihr gn er M an n he im 公司提供的程序进行 。 PI 复染 , 抗荧
光褪色剂封片 。 荧光显微镜 ( Ol y lr lP uS BX6 0) 观察 。 选染色体分散较好 、 信号清晰的分裂相用
K do ak 4 0 0 彩色胶卷照相 。
1
.
5 重原位杂交
重原位杂交用 p s cl gl 做探针 , 参照 eH sl o犷H a ir s on 等 5[] 的方法进行 。 将第 1次杂交的
染 色体制片上 的盖玻 片小心揭 去 , 用含 0 . 1% irT ot n 的 1 x P B S 漂洗 Z x 巧而 n( 42 ℃ ) ;
1 x P B S 10而n( 42 ℃ )以除去封片剂 、 探针和其他检测试剂 , 用 70 % 、 95 % 、 10 % 酒精系列
脱水 , 70 % 甲酞胺 70 ℃下变性 3而 n , 再用 一 20 ℃ 的 70 % 、 95 % 、 10 % 系列酒精脱水 , 气干 。
8 80 遗 传 学 报 27 卷
杂交液中除不加 中国春 D N A 和探针改为 p s o l lg 外 , 其他成分与基因组原位杂交液相同 ,
原位杂交程序也与基 因组原位杂交相同 。 杂交后洗脱程序为 : 2 x sS C (室温 , 5而 n) ; 30 %
甲酞胺 (Z x S S C , 4 0 oC , 5而 n ) ; Z x S S C ( 4 0 oC , 1 0而 n ) ; Z x S S C (室温 , s m i n ) , 抗荧光褪色
剂封片 , 在显微镜下找到第 1 次拍照的细胞拍照记录 。
2 结果
2
.
1 基 因组原位杂交
在基因组荧光原位杂交 的制片上 , 被荧光素标记的中间堰麦草染色质呈现黄绿色 , 经
IP 复染的小麦染色体呈红色 。
基因组原位杂交结果显示 , 9H 6 2 7 6一 2体细胞的染色体数为 Z n = 42 , 在间期核 中可见
2 个点状杂交信号 (图版 卜 1 ) , 说明 9H 6 2 7 6一 2中有 中间堰麦草的染色质片段渗人 。 在中期
细胞 中 , 可见在 1 对小麦染色体的端部有杂交信号 , 经显微测量 , 信号区的长度约为整条
染色体的 5% (图版 卜2) , 从而证明 9H 6 2 7 6一 2含有 l 对小麦 一中间堰麦草的易位染色体 , 即
9H 6 2 7 6
一 2是 l 个小麦 一中间僵麦草的小片段易位系 。 利用本实验程序 , 杂交信号检测率几
乎为 10 0% 。
.2 2 易位染色体的识别
基因组原位杂交虽然可以检测易位片段 的大小及其所在位置 , 但不能识别易位涉及
到哪一条染色体 。 本文利用 1个来 自黑麦的重复序列探针 p s cl gl 对已应用 GI SH 鉴定为
易位 系的 同一张染色体制片进行重复杂交 , 参照 p s cl gl 在小麦染色体上的特异杂交带
型 3[, 4 , 8〕来识别易位涉及的小麦染色体 。 图版 卜3和 4 是 9H 6 2 7 6一2同一细胞分别用中间堰
麦草基因组 D N A 和重复序列 p s cl lg 为探针的原位杂交结果 。 两 图比较可见 , p s c l lg 在
易位染色体的长臂端部和中间部位各有 1条杂交带 , 在短臂近端部和端部也各有 1 条带 ,
短臂的端带位于中间堰麦草的易位片段上 , 其他 3条带为小麦 ZB 染色体的特异 p s cl gl 带
型 。 由此断定 中间僵麦草的易位片段位于小麦 ZB 染色体的短壁端部 , 即 9H 6 2 7 6一2是 1个
小麦 ZB一中间堰麦草染色体易位系 。 由于 目前尚没有 p s c l gl 在 中间堰麦草染色体上的原
位杂交标准带型可供参照 , 所以 9H 6 2 7 6一2中的中间堰麦草染色体易位片段的来源尚不能
确定 。
3 讨论
本文首次运用基 因组一重复序列探针重复原位杂交 (顺序 GI S H一H S H )技术准确鉴定
了 l 个小麦一中间堰麦草的小片段易位系 ,并识别了易位涉及的小麦染色体 , 为小片段易
位系的准确鉴定提供了一种新 的技术方法 。 该方法 与顺序分带一原位杂交技术体系 1[, ’ ]比
较 , 技术要求更为单一 , 即只需要原位杂交技术 。
顺序 GI SE -[ IF S H原位杂交的技术关键是第 2 次杂交 。 通过摸索 , 我们 已经建立 了一
套较好的技术程序 。 实验 中有 2 个方 面需要特别注意 。 ( l) 第 1次杂交后 的洗脱必须彻
底 , 封片剂等必须去除干净 ,否则第 2 次杂交难以成功 。 但同时又要避免染色体丢失 。 本
实验采用 2 x S S C (4 2 oC ) 2 x 1 5而-n l x P B S (4 2 oC ) 10而n 的洗脱程序 , 结果 比较理想 。 在
此洗脱强度下既能得到较好的重杂交信号 , 染色体也基本不丢失 。 (2) 选用有丝分裂前 中
期 、 染色体相对较长的分裂相 比较合适 。 中期染色体收缩程度较高 , 对 2 次杂交的带型分
辨不利 。
10期 刘道峰等 :用顺序 GI S玲 FI S H技术鉴定小麦一中间堰麦草小片段易位系 81 8
小片段易位系是向小麦中引进外源基因的最有价值的重组类型 , 而代换系 、 附加系或
大片段易位系由于 同时带进较多的不 良农艺性状而难以直接在生产上应用 。 本文报道的
9H 62 76
一2是 1 个小麦一中间僵麦草的小片段易位系 , 经接种鉴定高抗条锈病 , 而它的小麦
亲本恢 75 对条锈病敏感 。 推测抗条锈基 因可能位于中间僵麦草的易位片段上 。 9H 6 2 7 6 -
2是 1个对抗病育种很有应用价值的新种质材料 。
目前 , 对于非罗伯逊易位 (on -n oR be srt o in an tar n s loc iat on ) 的机理还不清楚 。 但值得
注意的是小片段易位系大部分为端部易位 。 irF e be 等 9[] 曾对 57 个小麦与近源种的易位材
料进行了分析 , 结果 45 个为端部易位 , 两个插人 易位和 10 个罗伯逊易位 (oR be srt o in an
tr an sl oc iat
o n)
。 张增艳等 〔’ 0] 、 韩方普等 1[ ’ ]和牟金 叶等 1[ 2]鉴定 的小麦一中间僵麦草易位系也
都是端部易位 , 并且易位片段都很小 。 推测在染色体的端粒附近可能存在一个结构脆弱
区 , 从而形成一个重组热点 。 深人研究异源染色体间的易位机制对于遗传学基础研究和
异源染色体的种间转移及其应用都具有重要意义 。
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8 82遗 传 学 报 27卷
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T r a n s lo e a t io n L in e b y Se q
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A b s t r a e t :
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图 版 说 明
1
:
9H 6 2 7 6月 间期细胞核的基因组荧光原位杂交 。 2 : 9H 62 7 6佗 中期染色体的基因组荧光原位杂交 , 可见一对易位染
色体 。 3 和 4 : 9H 6 2 76 一 2同一细胞分别用 中间僵麦草基因组 D N A 和重复序列 sP 。 1 19 为探针的原位杂交 ,箭头示易位
染色体
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