全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
慢性高眼压下兔视网膜组织蛋白质组变化的初步研究
刘珏 李平华
(重庆医科大学附属第一医院眼科 眼科学重庆市市级重点实验室,重庆 400016 )
摘 要: 应用蛋白质组学技术对兔青光眼慢性高眼压视网膜组织的蛋白进行初步分析。左眼前房注入 0. 2 mL复方卡
波姆溶液制作成慢性高眼压模型,右眼为对照眼。 28 d后分离各组视网膜组织,用双向电泳分离试验组和对照组的蛋白, 然
后分析电泳图谱, 对比、分析其表达蛋白质点的差异,寻找兔视网膜中与慢性高眼压相关的蛋白质。结果表明 ,慢性高眼压诱
导视网膜组织 3种蛋白质出现明显差异表达。质谱鉴定出 3个蛋白质, 分别为热休克蛋白 70 ( heat shock 70 kD prote in,
HSP70), 丙酮酸激酶 ( Pyruvate k inase)和烯醇酶 ( eno lase)。通过双向电泳, 发现兔视网膜蛋白质表达与对照眼相比有质和量
的变化, 这些变化涉及与神经节细胞 ( retinal gang lion ce lls, RGCs)糖酵解及应激反应有关的几组蛋白质, 提示上述蛋白质组改
变可能参与了慢性青光眼神经节细胞凋亡的过程。
关键词: 慢性 高眼压 视网膜 双向电泳 质谱
Prelim inary Study on Retinal Proteome of ChronicH igh
Intraocular Pressure of Rabbits
L iu Jue L iP inghua
(D epartm ent of Ophthalmology, the First Affiliated H o sp ital, Chongqing M edical University,
Chongqing Key Laboratory of Ophthalmo logy, Chongqing 400016 )
Abstrac:t The study w as designed to app ly techno logy of P ro teom ics to resolve spec ifica lly expressed prote ins related to chron ic
h igh intraocu lar pressure in the retina o f rabb its. Them ode lw as induced by an in jection of 0. 2 mL compound ca rbom er so lution into an
ter ior chamber of left ey e, the r ight eye se rved as the contro1. A fter 28 days, retinas w ere iso lated from g laucom atous and contro l eyes.
P ro teins, prepared from the retinas o f g laucom a tous and control eyes, were separated by using twod imensional e lectrophoresis and then
analyzed by 2D electrophoresis im ag ing ana lyzer. 3 pro teins d isplayed significant changes after chron ic high intraocu la r pressure. 3 pro
te ins were identified afterm ass spec trom etry. H eat shock 70 kD prote in( HSP70), pyruva te k inase and eno lase increased in chron ic h igh
intrao cular pressure group. Therefo re, it proved tha t the expressed prote ins in the g laucom atous retina a re diffe rent in qua lity and quanti
ty from tha t in the contro l eyes, the changes o f g lycolysis and stress reaction in retinal
Key words: Chronic H igh intraocu lar pressure Retina Tw odim ensional e lec trophoresis M ass spectrom etry
收稿日期: 20091228
作者简介:刘珏,女,硕士研究生,研究方向:青光眼,白内障; Em ai:l liu jue0209@ sohu. com
通讯作者:李平华, Em ai:l cylip inghu a@ 163. com
青光眼是以视神经损害和视野缺损为特征的
致盲性眼病, 病理性眼压增高是其主要的危险因
素之一。高眼压可直接诱发视网膜、视神经缺血
和血流动力学的异常改变, 导致神经节细胞 ( ret i
na l gang lion cells, RGCs)凋亡, 视神经萎缩, 视功
能丧失。近年来对其病因的认识获得了突破性进
展 [ 1] ,认为在青光眼的发生发展过程中, 必然存在
着相关基因的差异性表达, 这些基因的表达产物
(即蛋白质 )具有明显的生物学效应, 将导致生理
平衡的失调和病理性改变。蛋白质组学研究能反
映蛋白质的动态变化, 从蛋白水平揭示疾病发生
时生物大分子的变化。近年来, 双向电泳 ( tw odi
mensional electrophoresis, 2DE )等蛋白质组学方法
已被广泛地运用于急、慢性青光眼的研究中,开展
了视网膜、视神经、小梁网、血清及房水等方面的
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
研究 [ 2- 5] , 但目前尚未见到对慢性高眼压下兔视
网膜组织蛋白质组研究的相关报道。本试验在建
立兔慢性高眼压模型的基础上, 采用双向电泳和
质谱分析技术, 研究慢性高眼压下的视网膜组织
蛋白质表达谱的变化, 为其机制和防治研究提供
新思路。
1 材料与方法
1. 1 供试动物及试剂
健康新西兰白兔 12只,雌雄不分,体重 2- 3 kg,
3- 4月龄,无眼疾;由重庆医科大学实验动物中心提
供。 IPG预制胶条 (非线性, pH3- 10), CHAPS, 四甲
基二乙胺 ( TEMED)购于 B ioR ad公司, 尿素,硫脲,
二硫苏糖醇 ( dithiothreito,l DTT) , 三羟甲基氨基甲
烷 ( T risbase) , 碘乙酰胺 ( IAA ), 十二烷基磺酸钠
( SDS)购于 Am eresco公司;其它试剂均为国产分析
纯,所有溶液均用超纯水 (M illiQ)配制。
1. 2 动物模型的建立
每只试验动物左眼设为试验组, 右眼设为对照
组。造模时将动物用水合氯醛腹腔注射麻醉,盐酸奥
布卡因滴眼液点眼行表面麻醉,眼角膜缘用 1 mL注
射器穿刺后抽出约 0. 2mL的房水。然后在此小针孔
对侧的角膜缘穿刺, 用 1 mL注射器注入约0. 2mL的
复方卡波姆溶液,对照组不作处理。术毕滴林可霉素
眼液。慢性高眼压模型以眼压高于 22mmHg并能持
续 1周为标准。如眼压低于 22mmHg, 7 d后按上述
方法重复注药 1次。造模成功后每周测 2次眼压。
1. 3 取材及视网膜蛋白质的提取
在造模后 28 d摘除动物眼球,取视网膜组织,
以湿重: 裂解液 ( 1 5)加入新鲜配制的裂解缓冲液
( 7M尿素, 2M硫脲, 4% CHAPS, 65mM DTT, 0. 2%
(w /v )两性电解质 ), 涡旋离心。冰浴超声, 4! 冰箱
孵育 1 h。14 000 r /m in( 4! )高速离心 40 m in。取
上清液分装, - 80! 保存。
1. 4 蛋白浓度测定
B randford蛋白测定试剂盒测定样品蛋白浓度,
并据此浓度确定上样量。
1. 5 双向电泳
1. 5. 1 等电聚焦 ( IEF) 待测蛋白裂解样品加入
上样缓冲液 ( 7 M 尿素, 2 M 硫脲, 4% CHAPS,
65 mM DTT, 0. 2% (w /v )两性电解质, 0. 001%溴酚
蓝 )充分混合, 上样蛋白总浓度为 300 g, 总体积为
450 L。样品溶液均匀加入 IPG胶条聚焦盘, 将
17 cm IPG干胶条置于样品液上, 17! 恒温下进行
等电聚焦, 设置程序如下: 被动水化, 14 h; 100 V,
3 h,缓慢升压; 250 V, 3 h, 缓慢升压; 500 V, 1 h, 缓
慢升压; 1 000 V, 3 h, 缓慢升压; 10 000 V, 5 h,线性
升压; 10 000 V, 60 000伏特小时。
1. 5. 2 平衡 等电聚焦结束后,迅速取出 IPG胶条
分别于 5 mL平衡液 I( 6M尿素, 0. 375M T risHC l
( pH8. 8) , 20% 甘油, 2% SDS, 0. 1 g DTT)及 5 mL
平衡液∀ ( 6M尿素, 0. 375M TrisHC l pH88), 20%
甘油, 2% SDS, 0. 125 g IAA )中各平衡 15 m in。
1. 5. 3 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS
PAGE) 将平衡后的 IPG胶条移至 12%的 1mm厚
的凝胶上端, 用低熔点琼脂糖封固, 先用 5 mA / ge l
电泳 1 h, 后用 30 mA /gel电泳, 直至溴酚蓝到达凝
胶底边处停止。
1. 5. 4 银染 将凝胶置于固定液中 ( 50% ( v /v )甲
醇, 10% 冰醋酸, 0. 05%甲醛, 40% M illiQ水 )固
定 2 h;弃固定液, 用洗涤液 ( 35%乙醇, 65% M illiQ
水 )洗涤 3次, 每次 10 m in; 弃洗涤液, 敏化液
( 02% N a2 S2O 3 )中敏化 5 m in; 弃敏化液, M illiQ
水洗 3次, 每次 5 m in; 银染液 ( 0. 2% AgNO3, 0.
076%甲醛 )染色 35 m in; 弃银染液, 洗 3次, 每次 5
m in; 显色液 ( 6% Na2CO3, 0. 05%甲醛 )中显色充分
后, 立即加入终止液 ( 50%甲醇, 10%冰醋酸 )至无
气泡产生;弃去显色液和终止液, M illiQ水洗 3次,
每次 5 m in。
1. 5. 5 图像分析 选取 3个差异明显的蛋白点作
HPLCCH IP /M S分析。用扫描仪扫描凝胶后用
PDQuest7. 4凝胶图像分析软件依次进行点检测、背
景消减, 2D校正、匹配与建立平均凝胶等分析。
根据 Norm alised V o lum e值的变化来判断蛋白斑
点表达量的变化, 从而来获取斑点的相关信息。
1. 5. 6 数据库搜索 Spectrum M illM S Pro teom ics
Workbench( R ev A. 03. 03. 078)自动分析 MS和 MS /
M S数据,搜索 Un iProtKB /SW ISSPORT, Rabb it数据
库。搜索后自动以下列条件进行有效性验证: 蛋白
评分大于 11. 0; 肽评分大于 6. 0; SPI( Structure pre
d ictability index for protein sequences)大于 60%。
170
2010年第 4期 刘珏等:慢性高眼压下兔视网膜组织蛋白质组变化的初步研究
2 结果
2. 1 眼压范围
建立兔慢性高眼压模型后, 每周测量试验组
和对照组兔眼压各 2次。试验组兔眼压术后 3 h
开始升高, 术后 14 d左右达到 40 mmHg以上, 之
后, 大多数兔眼压维持在 30- 40 mmHg; 对照组兔
眼压在整个试验过程中无升高, 平均为 13 - 15
mmHg (图 1)。
图 1 试验组与对照组眼压比较
2. 2 双向电泳图像
每张电泳图谱获得约 300个左右可辨认的蛋白
点。其相对分子质量主要集中在 25- 100区域 (图
2)。通过比对分析, 发现慢性高眼压可致兔视网膜
组织 3个蛋白点发生明显表达差异。
图 2 对照组 (A )与试验组 ( B )双向电泳图
2. 3 质谱分析结果
对 3个差异蛋白点进行了多维色谱 - 质谱 /质
谱分离与分析,差异蛋白点 MS /M S的分析结果如图
3所示,数据库搜索结果列于表 1。
图 3 MS/M S图谱
表 1 差异蛋白多维色谱 -质谱 /质谱数据搜索结果
蛋白点 蛋白名称 Un iProtKB /Sw issProt编号
分子量
( kD)
等电点
a 丙酮酸激酶 Q9Z984 52. 7 5. 36
b 热休克蛋白 70 Q91233 71. 6 5. 49
c 烯醇酶 P25696 47. 0 6. 13
3 讨论
20世纪 90年代, 双向电泳、质谱分析等蛋白质
组核心技术的形成,为人们从蛋白质水平上研究生物
体复杂的生理和病理过程提供了良好的技术支撑 [ 6 ]。
应用蛋白质组学技术对视网膜疾病的研究,已经向人
们展现了其在揭示发病机制和确定治疗靶标上的优
势 [ 7, 8]。二维电泳通过比较生理及病理状态下蛋白质
分布图谱,可以筛选出蛋白质关键分子,或者提供药
物作用的靶蛋白质分子,发现在信号传递中起重要作
用的蛋白质分子,也可比较不同组织、细胞蛋白质的
171
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
异同从而寻找特异蛋白和保守蛋白 [ 9]。
青光眼是临床常见的致盲性眼病,病理性眼压增
高是其主要危险因素之一。有研究表明有多种机制
参与高眼压性视网膜损伤,但无论何种机制其最终的
结局均是 RGC s的凋亡 [ 10]。在此过程中,必然存在着
RGCs内蛋白质质与量的变化。本试验采用双向电泳
方法,研究慢性高眼压对于视网膜组织蛋白质表达的
影响,通过质谱技术鉴定了其中的 3个与对照组比较
差异明显的蛋白质,分别是热休克蛋白 70,丙酮酸激
酶和烯醇酶。
HSP70是生物组织或细胞在缺血、缺氧、高温
等应激条件下产生的, H SP70能提高机体抵抗能
力, 保护正常生理功能。在对哺乳动物中枢神经
系统的研究中发现, HSP70能提高神经元对缺血
的耐受能力; 热休克后的视网膜细胞 (包括神经节
细胞、色素上皮细胞等 )对缺血、缺氧的耐受性增
强, 与未热休克的对照组视网膜细胞相比细胞存
活数量明显增多或细胞密度大; 热诱导大鼠视网
膜细胞高表达 HSP70能避免强光导致的视网膜损
伤 [ 11]。分子生物学研究显示, HSP70是主要的分
子伴侣 ( mo lecular chaperon)之一,能与其它蛋白分
子结合,保护蛋白免于变性降解,维持新合成蛋白
的正常构型 [ 12]。此外, HSP70还参与抑制 RGCs
凋亡过程, 保护细胞线粒体免受活性氧自由基的
毒性,下调细胞色素 C的释放, 抑制 caspase3的激
活; 提高 HSP70的表达可以阻断细胞凋亡信号通路,
抑制应激活化蛋白酶 / Jun N端激酶激活。从而达到
保护 RGCs的作用 [ 13]。
在糖酵解途径中, 丙酮酸激酶和烯醇酶催化
2磷酸甘油酸生成丙酮酸, 并使 ADP磷酸化为高
能量的 ATP。 RGC s在慢性高眼压的缺血缺氧情
况下, 丙酮酸激酶和烯醇酶活力增高, 葡萄糖无
氧酵解作用增加,导致细胞内酸中毒和 ATP生成
不足, 不能维持细胞膜内外离子浓度差, K +、
M g
2 +从细胞内渗出, C a2 +、Na+进入细胞内, 线粒
体功能受到损害, 细胞代谢出现严重障碍。在此
过程中, RGC s膜最先受氧自由基损害, 使膜磷脂
产生过氧化反应, 膜通透性增加, 离子转运和血
-眼屏障功能均受影响。能量代谢障碍所致酸
中毒和 ATP生成不足, 使细胞内蛋白质、脂蛋白
变性, 破坏细胞膜的分子结构, 各离子通道异常
开放, 细胞代谢发生紊乱, 蛋白合成受抑制。在
此基础上, Ca2+ 大量进入细胞内, 使细胞内 Ca2 +
超载, 兴奋性氨基酸释放增加, 加重 RGC s损害 ,
最终导致 RGC s凋亡。
综上所述,通过蛋白质组学研究发现了慢性高眼
压前后差异表达的蛋白, 上调和 (或 )下调相关蛋白
质的表达, 经其相应信号传导途径, 可能与 RGC s的
凋亡密切相关。但凋亡发生发展的确切分子机制、蛋
白质间相互作用及其蛋白质表达调控网络,以及利用
免疫标记等技术对单个有意义的蛋白质进行 RGCs
中亚细胞定位和特征分析,仍有待今后进一步研究。
参 考 文 献
[ 1] Frezzoty i R, R en ieri A, Frezzoth P. Adu ltonset prim ary g lau com a
and mo lecu lar genetics: a review. Eur J Ophthalm o,l 2004, 14( 3 ):
220225.
[ 2] Nakajim a E, Larry LD, B yst rom C, et a.l C alpain specif ic proteolys is
in p rim ate retin a: contribu tion of ca lpains in cel l death. InvestOph
thalm olV is Sc,i 2006, 47( 11 ): 54695475.
[ 3] Bhattacharya SK, C rabb JS, B on ilha VL, et a.l Proteom ics im pl icates
pept idyl arg in ine deim inase 2 and op tic n erve citru llin at ion in g lau
com a pathogen es is. Invest Ophthalm ol V is Sc,i 2006, 47 ( 7 ):
25082514.
[ 4] P iccian iRG, D iazA, Lee RK, et a.l Potent ial for transcript ional up
regu lation of coch lin in glau com atous trabecu larm eshw ork: a com b i
natorial b ioin form atic and b ioch em ical analyt ical approach. Invest
Ophthalm olV is Sc,i 2009, 50( 7 ) : 31063111.
[ 5] Boehm N, Th ielU, LossbrandtU, et a.l Intraind ividual com parison of
an tibody patterns in sera and aqueou s humor of glaucom a patients
and healthy sub jects. Invest Ophthalm olV is Sc,i 2009, 50: 2076.
[ 6] Poulak i V. M icrod issection, m icroarrays and p roteom ics: a new ap
proach to th e study of eye d iseases. G raefe A rch C lin Exp Ophthal
m ol , 2003, 241 ( 7) : 527528.
[ 7] Ouch iM, W est K, C ra1bb JW, et a.l Proteom ic analys is of v itreous
from d iab et ic m acu lar edem a. E xp Eye Res, 2005, 81( 2 ) : 176182.
[ 8] 李大疆,张清炯,肖学珊. 应用双向电泳对 rds和 C3B鼠视网膜
蛋白质组的初步研究.眼科新进展, 2001, 211( 3) : 153156.
[ 9] Dow sey AW, Dunn M J. Y ang GZ. Th e role of b io inform at ics in
tw od im ens ional gel electrophores is. Proteom ics, 2003, 3 ( 8 ):
15671596.
[ 10] 彭玉毫,李和平, C lark AF.青光眼性视网膜节细胞凋亡的病理
(下转第 178页 )
172
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
蛋白表达量的影响不大, 为了减小诱导剂对目的蛋
白的毒性作用,采用终浓度为 0. 1 mmo l/L来进行诱
导表达,这与方东山等 [ 12]报道的一致。
本研究利用原核表达系统, 获得了具有免疫
活性的重组 SAG2蛋白, 并用纯化的重组 SAG2
蛋白作为包被原建立的间接 EL ISA方法可明显
区分弓形虫阴阳性血清 , 这为血清学方法检测弓
形虫病奠定了基础。用重组蛋白制备的多克隆
抗体能够很好的识别弓形虫表面 SAG2蛋白, 为
进一步研究弓形虫的入侵机制和弓形虫的疫苗
奠定基础。
参 考 文 献
[ 1] Joiner KA, Dubrem etz JF. T oxop la sma gond ii: A p rotozoan for the
nineties. In fection and Imm un ity, 1993, 61( 4 ): 11691172.
[ 2] H u sk inson J, S tep ickB iek PN, A rau jo FG, et a.l Toxopla sma ant igens
recogn ized by imm unoglobu lin G subclasses du ring acute and chron
ic in fect ion. J C linM icrob io,l 1989, 27 ( 9) : 20312037.
[ 3] SuzukiY, Thu llies P, Desm onts G, et a.l Ant igen( s) respons ible for
imm unoglobu lin G responses specific for the acu te stage ofToxoplas
ma infect ion in human s. J C linM icro, 1988, 26( 5 ) : 901905.
[ 4] Chardes TBou rgu in I, M evelecMN, et a.l An tibody responses toTox
oplasm a g ond ii in sera, in test inal secret ions, and m ilk from orally in
fectedm ice and characterization of target an tigens . J Infe Immu,
1990, 58( 5 ) : 12401246.
[ 5] B ourgu in I, Ch ardesT, M evelecMN, et a.l Amp lif icat ion of th e secre
tory IgA respon se to T oxop la sma g ond ii us ing cholera toxin. FEMS
M icr Lett, 1991, 65( 3 ) : 265271.
[ 6] Luden A, Lovgren K, Uggla A, et a.l Imm une responses and res is t
an ce to Toxoplasm a g ondi i in m ice immun ized w ith an tigen s of the
parasite incorporated in to immunost imu lat ing com p lexes. J In fe Im
mu, 1993, 61( 6 ) : 26392643.
[ 7] Prin ce JB, Auer KL, H u sk inson J, et a.l C lon ig, expression, and cD
NA sequ ence of surface ant igen P22 from Toxoplasm a gond ii. Mo l
B iochem Paras ito, 1990, 43( 1) : 97106.
[ 8 ] G rimwood J, Sm ith JE. Toxopla sma g ondii: the role of parasite su rface
and secreted protein s in host cel l invas ion. In t J Parasito,l 1996, 26
( 2) : 169173.
[ 9] M ish im a M, Xu an X, Sh ioda A, et a.l M od ified p rotection against
Toxopla sma gond ii lethal infect ion and b rain cyst form at ion by vacci
nation w ith SAG2 and SRS1. JVetM ed S c,i 2001, 63: 433438.
[ 10] L iS, Galvan G, A rau jo FG, et a.l S erod iagn os is of recen tly acqu ired
Toxoplasm a gond ii infect ion u sing an enzym e linked imm un osorbent
assay w ith a com b inat ion of recomb inant an tigen s. C l in D iagn Lab
Imm uno,l 2000, 7( 5 ) : 781787.
[ 11] Tom ao S, M artin age A, Dubrem etz JF. Phosphorylat ion ofT oxop las
ma gond ii ma jor su rface an tigen s. Paras itol R es, 1992, 78
( 7) : 541544.
[ 12] 雷明军,吴少庭, 戴五星,等.弓形虫 RH 株膜表面抗原 2全长
基因的高效表达与抗原性分析.中国人兽共患病杂志, 2004, 20
( 1) : 91.
[ 13] 张舒婕,邓干臻,龚炎长,等.鸭 MHC∀ 融合蛋白表达条件的
优化.华中农业大学学报, 2008, 27( 1) : 7174.
[ 14] 方东山,许应天,等.牛瑟氏泰勒虫 P23表面蛋白基因表达条件
的优化.延边大学学报, 2009, 32( 1) : 3235.
[ 15] 言慧,李华,周晓红,等.截短形式弓形虫 SAG1抗原在大肠杆
菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定.第一军医大
学学报, 2004, 24 ( 4) : 412414.
(上接第 172页 )
学机制.中华眼科杂志, 2004, 40: 495499.
[ 11 ] C aprioh J, K itano S, M organ JE. H yp erth erm ia and hypoxia increase
tolerance of ret inal ganglion cells to anoxia and excitotoxicity. Invest
Ophthalm olV is Sc,i 1996, 37: 23762381.
[ 12 ] Kaked aK, Ish ikaw a H. M olecu lar chaperon produ ced by an in tracel
lu lar symb iont. J B ioch em (T okyo) , 1991, 110: 583587.
[ 13 ] Qn igley HA, N ickellsRW, K errigan LA, et a.l Retin al gangl ion cell
death in experim en tal glau com a and after axotom y occu rs by apopto
s is. Inves tOphthalm olV is S c,i 1995, 36: 771786.
178