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珠子参总皂苷对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的保护作用



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The neuroprotective effect of total coumarine of Angelica pubescentis on APP /PS1 double
transgenic AD model mouse
Jiao Yanan,Hu Yu,Zhao Dan,Sun Dong,Hao Haiguang,Yang Jingxian
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600)
Objective:To investigate whether total coumarine of Angelica pubescentis (TCA)exert neuroprotective effect on APP /PS1 double
transgenic mice. Methods:7-month old APP /PS1 mice were randomly divided into model group,TCA low,medium,high dose groups (3. 6,
7. 2,14. 4 mg /kg) (n = 10) ,with age-matched C57BL /6J mice of the same genetic background as normal control group. Immunohistochemi-
cal fluorescence,HE and Nissl staining as well as Hoechst 33258 staining were used in the present study. Results:In TCA high dose (14.
4 mg /kg)mice,the pyramidal cells in CA3 zone were significantly improved (77. 56 ± 5. 82 n /mm2,P < 0. 01 vs. model group)and Nissl
body quantity were increased. In addition,the fluorescence intensity of NF-M was rescued (83. 25 ± 10. 74%,P < 0. 01 vs. model group)
and the percentage of apoptosis cells was decreased (14. 08 ± 3. 27 %,P < 0. 01 vs. model group)in TCA high dose (14. 4 mg /kg)group.
Conclusion:TCA (14. 4 mg /kg)was effective dose,which can significantly protect APP /PS1 mice from neural damage probably through
improving NF-M expression and reducing the apoptosis cells in the brain of APP /PS1 transgenic mouse.
Key words total coumarine of Angelica pubescentis (独活香豆素,TCA) ;APP /PS1 double transgenic mice;neuroprotective;anti-apoptosis
珠子参总皂苷对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的保护作用
*
王 薇,张 旋,许苗苗,宋 蓓,宋小妹**
(陕西中医学院,咸阳 712046)
摘 要 目的:研究珠子参总皂苷对对四氯化碳所致大鼠慢性肝损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法:采用 40%的
CCl4 橄榄油剂灌胃制备慢性肝损伤大鼠模型。分别采用不同浓度的珠子参总皂苷进行干预,9 周后检测大鼠肝、脾脏器指数,血清
ALT、AST浓度和 TP、ALP、ALB含量,肝组织中 MDA、SOD、T-AOC、GSH-Px、Hyp 的含量。结果:珠子参总皂苷(60、120、240 mg /kg)
07 中药药理与临床 2014;30(5)
* 基金项目:国家自然科学基金项目,编号:81102805 /H2804) ;陕西省科技统筹创新工程计划项目,编号:2011KTCQ03 - 02;陕西省教育厅专
项科研计划项目,编号:2010JK490 **通讯作者
灌胃给药能显著降低 CCl4 致慢性肝损伤大鼠肝脏、脾脏指数;降低血清中异常升高的 ALT、AST;提高血清中降低的 TP 含量,降低
血清中升高的 ALP含量,降低肝组织中 MDA水平,同时升高其低下的 T-AOC、GSH-Px水平;降低 Hyp含量。结论:珠子参总皂苷对
大鼠实验性肝损伤具有一定程度的保护作用,其机制可能与抑制脂质过氧化反应、减少自由基生成、提高组织抗氧化能力、促进蛋
白质合成有关。
关键词 珠子参总皂苷;四氯化碳;慢性肝损伤
珠子参为五加科植物珠子参 Panax japonicus C. A. Mey. var.
major (Burk.)C. Y. Wu et K. M. Feng 或羽叶三七 Panax japoni-
cus C. A. Mey. var. bipinnatifidus (Seem)C. Y. Wu et K. M. Feng
的干燥根茎,作为秦巴特色中草药资源的太白七药之一,具
有补肺养阴、活络、止血之功效,临床主要用于治疗气阴两虚、烦
热口渴、虚劳咳嗽、跌扑损伤、关节疼痛、咳血、外伤出血等病
症[1]。珠子参总皂苷(珠子参总皂苷)是珠子参中主要有效成
分,研究表明其具有免疫调节[2]、抗心肌缺血[3]、抑制白血
病[4,5]、镇痛镇静[6]、抗脂质过氧化以及抗实验性溃疡[7]等药理
作用。本文从保肝的角度,研究了 珠子参总皂苷 对大鼠实验
性慢性肝损伤、肝纤维化的预防作用,观察了 珠子参总皂苷 对
四氯化碳诱发大鼠实验性慢性肝损伤、肝纤维化的影响,为珠
子参总皂苷在临床的进一步应用提供实验依据。
1 材料与方法
1. 1 试验药物 珠子参总皂苷由陕西中医学院中药化学教研
室提供,规格分别为 240、120、60 mg /kg,纯度为 96. 2%。原药
材珠子参购自陕西眉县槐芽镇,经陕西中医学院药学院王继涛
高级实验师鉴定为五加科植物珠子参 Panax japonicus C. A.
Mey. var. major (Burk.)C. Y. Wu et K. M. Feng的干燥根茎,质量
标准符合 2010 版药典规定。
珠子参总皂苷高效液相色谱图如下:
秋水仙碱由西双版纳版纳药业有限责任公司,规格 0. 5mg
× 20 片,批号:H53021369。
1. 2 动物 SD大鼠,成年 SPF级,(180 ± 20)g,雌雄各半,由第
四军医大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(军)2007-007。
食用鼠料由第四军医大学实验动物室提供。
1. 3 试剂 四氯化碳(天津市红岩化学试剂厂,临用前以橄榄
油调和按体积比配成 40% CCl4 溶液) ;丙氨酸氨基转移酶
(ALT)试剂盒、谷氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、MDA 检测试
剂盒、SOD检测试剂盒、T-AOC 检测试剂盒、GSH-PX 检测试剂
盒和 Hyp试剂盒(南京建成生物工程研究所生产,批号分别为
091201、091201、091205、091205、091205、091205、20100203)。
1. 4 仪器 UV1102 紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限
公司) ;NFCA-1680 生化仪(北京华运安特科技有限责任公司)。
1. 5 方法 大鼠 96 只,按体重随机分成 6 组:正常对照组、
CCl4 模型组、珠子参总皂苷三个剂量组(240、120、60 mg /kg)、
秋水仙碱组(0. 1 mg /kg)。除正常对照组外,其他各组大鼠按 1
ml /kg ig 40% CCl4 橄榄油溶液,每周 2 次,连续给药 10 周,正常
对照组给予等体积橄榄油。建模第二周开始灌胃给药,正常对
照及模型组给予等体积生理盐水,连续给药 9 周。末次给药后,
大鼠禁食不禁水 24 h,称体重,乙醚麻醉,眼球后静脉丛取血;将
大鼠处死,同时取肝脏、脾脏,称重,并计算肝脾指数。常规制备
血清标本,按照试剂盒说明书测定 ALT、AST、TP、ALP、ALB 含
量;取肝脏左叶少许,冰生理盐水冲洗、滤纸吸湿后,在相同部位
精确称取 0. 3g,加入预冷的生理盐水,在冰水中制成 10%的匀
浆,3000 rpm离心 15min,提取上清液,按照试剂盒说明书测定
MDA、SOD、T-AOC、GSH-Px、Hyp含量。
2 结果
2. 1 珠子参总皂苷对大鼠肝脾指数的影响 与正常组相比,模
型组大鼠肝、脾指数显著增加;珠子参总皂苷高、中、低剂量组和
秋水仙碱组均有抑制肝脾增大的作用,与模型组相比差异显著,
结果见表 1。
表 1 珠子参总皂苷对大鼠肝脾指数的影响(珋x ± s,n = 10)
组别
剂量
(mg /kg)
脾脏指数
(mg /10g)
肝脏指数
(mg /10g)
正常对照 2. 32 ± 0. 48* 34. 53 ± 2. 82**
模型对照 2. 98 ± 0. 63 40. 10 ± 4. 84
珠子参总皂苷 240 2. 44 ± 0. 40* 36. 30 ± 2. 16*
珠子参总皂苷 120 2. 40 ± 0. 50* 34. 46 ± 3. 98*
珠子参总皂苷 60 2. 09 ± 0. 63** 35. 72 ± 3. 72*
秋水仙碱 0. 1 2. 28 ± 0. 42** 36. 02 ± 1. 35*
与模型组比较 * P <0. 05,** P <0. 01(下同)
2. 2 珠子参总皂苷对大鼠血清 ALT、AST、TP、ALP、ALB 含量
的影响 与正常组相比,模型组大鼠血清 ALT、AST、ALP 水平
明显升高;珠子参总皂苷各剂量组和秋水仙碱组均能显著降低
大鼠血清中升高的 ALT活性,珠子参总皂苷低剂量组和秋水仙
碱组均可以显著降低 ALP的含量,珠子参总皂苷低剂量组和秋
水仙碱组亦能明显降低大鼠血清升高的 AST活性,与模型组比
17中药药理与临床 2014;30(5)
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2014.05.023
较有显著性差异。
与正常组相比,模型组大鼠血清 TP 水平明显降低,与模型
组相比,珠子参总皂苷中、低剂量组及秋水仙碱组均可以显著
升高 TP的含量,说明珠子参总皂苷对慢性肝损伤大鼠肝功能
有不同程度的改善,此外,此模型对 ALB无影响,结果见表 2。
表 2 珠子参总皂苷对大鼠血清 ALT、AST、TP、ALP、ALB含量的影响(珋x ± s,n = 10)
组别
剂量
(mg /kg)
ALT
(U /L)
AST
(U /L)
TP
(g /dl)
ALP
(g /dl)
ALB
(g /dl)
正常对照 44. 7 ± 11. 4* 111. 0 ± 18. 9* 66. 01 ± 3. 26* 164. 1 ± 32. 3** 25. 74 ± 3. 52
模型对照 133. 9 ± 109. 7 215. 0 ± 130. 2 62. 91 ± 3. 80 255. 9 ± 89. 8 25. 28 ± 1. 38
珠子参总皂苷 240 43. 0 ± 15. 2** 131. 7 ± 21. 5 63. 98 ± 4. 16 242. 0 ± 78. 9 23. 07 ± 2. 74
珠子参总皂苷 120 52. 6 ± 17. 7* 112. 9 ± 14. 2 56. 82 ± 3. 24** 229. 8 ± 66. 0 22. 51 ± 1. 79
珠子参总皂苷 60 38. 5 ± 10. 2** 106. 2 ± 11. 3** 59. 08 ± 3. 71* 183. 3 ± 58. 4* 22. 73 ± 3. 26
秋水仙碱 0. 1 50. 5 ± 34. 5* 125. 2 ± 28. 7* 58. 31 ± 3. 03** 170. 1 ± 81. 5* 24. 25 ± 1. 55
2. 3 珠子参总皂苷对大鼠肝组织 SOD、GSH-PX、MDA、T-
AOC、Hyp的影响 与正常组比较,模型组大鼠肝匀浆中 GSH-
Px和 T-AOC酶活性显著下降,而 MDA 含量显著升高。与模型
组相比,珠子参总皂苷各剂量组和秋水仙碱组可显著降低升高
的 MDA值,并显著升高 T-AOC 和 GSH-Px 活性。此外,对 SOD
酶的活性无显著影响,表明珠子参总皂苷通过提高机体抗脂质
过氧化能力对 CCl4 致慢性肝损伤大鼠起保护作用。
肝脏 Hyp是反映肝纤维化程度的一个重要指标。与正常
组比较,模型组大鼠肝组织匀浆 Hyp 含量显著增高;与模型组
相比,珠子参总皂苷小剂量组和秋水仙碱组可显著降低肝匀浆
Hyp含量,说明珠子参总皂苷可以抑制 CCl4 致慢性肝损伤大鼠
的肝纤维化,结果见表 3。
表 3 珠子参总皂苷对大鼠肝组织 SOD、GSH-PX、MDA、T-AOC含量的影响(珋x ± s,n = 10)
组别
剂量
(mg /kg)
MDA
(nmol /mg pr)
SOD
(U /mg pr)
GSH-Px
(U /mg pr)
T-AOC
(U /mg pr)
Hyp
(mg /g)
正常对照 0. 43 ± 0. 15** 0. 54 ± 0. 11 15. 31 ± 7. 55* 1. 23 ± 0. 50* 0. 24 ± 0. 06**
模型对照 1. 01 ± 0. 41 0. 41 ± 0. 13 8. 97 ± 3. 13 0. 71 ± 0. 26 0. 35 ± 0. 04
珠子参总皂苷 240 0. 65 ± 0. 17* 0. 39 ± 0. 13 20. 09 ± 15. 13* 1. 02 ± 0. 30* 0. 28 ± 0. 07
珠子参总皂苷 120 0. 52 ± 0. 21* 0. 43 ± 0. 23 30. 79 ± 13. 29** 1. 37 ± 0. 51** 0. 26 ± 0. 10
珠子参总皂苷 60 0. 48 ± 0. 12** 0. 51 ± 0. 16 28. 41 ± 14. 73** 1. 19 ± 0. 70* 0. 23 ± 0. 06**
秋水仙碱 0. 1 0. 61 ± 0. 24* 0. 41 ± 0. 14 21. 86 ± 10. 59** 1. 18 ± 0. 43* 0. 27 ± 0. 05*
3 讨论
CCl4 诱导的肝损伤是广泛应用于肝病防治药物筛选的经
典模型[7 ~ 9]。CCl4 是最常用于诱发实验动物肝纤维化和肝硬
化的毒物,它进入机体后,能被肝脏内的肝微粒体色素 P450 激
活,产生三氯甲基自由基和氯自由基,这些自由基攻击肝细胞
膜的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化,导致细胞膜通透性增
强,严重的则使肝细胞变性坏死,胞浆内转氨酶渗出,血清中的
ALT和 AST含量上升,同时,这一过程也会形成一些脂质过氧
化物,如 MDA、氧自由基等,而 MDA 的量常常可反映机体内脂
质过氧化的程度,间接地反映出细胞损伤的程度,MDA 的测定
常常与 SOD的测定相互配合,SOD活力的高低间接反应了机体
清除氧自由基的能力[10,12]。GSH 是体内广泛存在的一种重要
的催化过氧化氢的酶,起到保护细胞膜结构和功能完整的作
用[13]。其机制为经肝内的 CYP2E1 代谢生成氧化活性中间产
物造成生物膜结构和功能损伤,表现为肝小叶中央区肝细胞坏
死脂变、反应性增生,脂质的过氧化反应可促进肝纤维化,急性
损伤小叶中央区见气球样变,DNA片段及巨噬细胞提示细胞凋
亡参与肝损伤中[14]。
在本实验结果中,与正常组比较,模型组大鼠肝、脾指数增
加;血清 ALT、AST活力升高,TP水平降低,ALP水平升高;肝匀
浆中 GSH-Px和 T-AOC酶活性下降,而 MDA、Hyp 含量升高,说
明肝细胞受到明显损伤,肝损伤模型造模成功。经珠子参总皂
苷治疗后,各剂量组可不同程度的降低肝、脾指数;降低血清
AST、ALT的活力,提高 TP 水平,降低 ALP 水平;提高肝匀浆中
GSH-Px和 T-AOC 酶活性,降低 MDA、Hyp 的含量,以上结果提
示珠子参总皂苷对 CCl4 致慢性肝损伤大鼠具有明显的保护作
用。因此认为,珠子参总皂苷对 CCl4 致慢性肝损伤大鼠的保护
作用机制可能与抑制脂质过氧化反应、减少自由基的生成、提高
组织的抗氧化能力、促进蛋白质合成有关。该研究结果对于扩
大珠子参的应用范围、促进珠子参总皂苷抗肝纤维作用机制的
深入研究提供了一定的科学依据。
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Protective effects of total saponins from Panacis majoris rhizoma
against CCl4-induced chronic hepatic injury in rats
Wang Wei,Zhang Xuan,Xu Miaomiao,Song Bei,Song Xiaomei
(Shaanxi College of Chinese Medicine,Xianyang 712046)
Objective:To study the protective effect of total saponins of Panacis majoris rhizoma against CCl4 induced chronic hepatic injury and in-
vestigate its mechanism. Methods:The hepatic fibrosis rat model was developed by gavage of 40% CCl4 and rats were treated with total sapo-
nins of Panacis majoris rhizoma separately at 240 mg /kg,120 mg /kg and 60 mg /kg. Liver index,pleen index,the serums levels of ALT and
AST,alkaline phosphatase(ALP) ,total protein(TP)and albumin(ALB)levels were measured. Results:Total saponins of Panacis majoris
rhizoma(60,120,240 mg /kg)could significantly reduce the CCl4 to chronic liver injury rat liver spleen index,reduce the abnormally high se-
rum level of ALT and AST;increase serum level of TP,and reduce the level of ALP and malondialdehyde. The degeneration level of T-AOC,
GSH-Px were markedly increased in the model group. Conclusion:Total saponins of Panacis majoris rhizoma can protect experimental hepat-
ic injury and prevent the progression of hepatic fibrosis in rats. The mechanism maybe related to the inhibition of lipid peroxidation,reducing
the creation of free radicals,improvement antioxidant capacity and romoting the synthesis of proteins.
Key words Total saponins from Panacis majoris rhizoma(珠子参总皂苷) ;carbon tetrachloride;chronic hepatic injury
珠子参皂苷对四氯化碳致大鼠肝纤维化的保护作用
*
张继红1,邓 为2,石孟琼2**,刘 雄1,周继刚1,谈燕清1,罗 涛1,李浩然1,田培琳1
(1三峡大学中医临床医学院·宜昌市中医医院,2三峡大学医学院,宜昌 443002)
摘 要 目的:观察珠子参皂苷对四氯化碳(CCl4)致大鼠肝纤维化的保护作用及可能机制。方法:腹腔注射 2ml /kg 50%
CCl4 橄榄油溶液制备大鼠肝纤维化模型,首次注射后分别灌胃给予珠子参皂苷(100 和 200mg /kg)和秋水仙碱(100 mg /kg) ,正常组
和模型组给予等体积的 0. 5%羧甲基纤维素钠溶液,每天 1 次,共 8 周。8 周后取血清,检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸
氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧
化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量;肝脏经组织匀浆和 HE染色后,分析肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量和形态学,计算肝纤维化
分级、胶原纤维面积比、网状纤维面积比;实时定量 PCR检测肝组织中 SOD1、SOD2、SOD3、CAT和 GPX1 基因表达,Western blot检测
细胞质和细胞核中 Nrf2 蛋白表达。结果:珠子参皂苷 100 和 200mg /kg 和秋水仙碱(100 mg /kg)能明显改善肝功能,降低血液中
ALT、AST、ALP和 MDA水平,增加 SOD、GSH-Px、CAT活性和 TP、ALB水平和 A/G比值,降低肝纤维化分级、胶原纤维面积比、网状
纤维面积比和 Hyp含量,改善肝脏组织形态学;上调 SOD1、SOD2、SOD3、CAT和 GPX1 基因表达和促进 Nrf2 核移位,增加肝细胞核
内 Nrf2 的蛋白表达水平,特别是珠子参皂苷 200mg /kg剂量组尤其显著。结论:珠子参皂苷对 CCl4 致大鼠肝纤维化具有较好的保
护作用,促进 Nrf2 核移位和增强内源性抗氧化系统功能可能是其作用机制之一。
关键词 珠子参皂苷;肝纤维化;抗氧化;转录因子 Nrf2
37中药药理与临床 2014;30(5)
* 基金项目:国家自然科学基金项目 (No. 81341141) **通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2014.05.024