全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
甜瓜 HMGR基因全长 cDNA的克隆及序列分析
郝金凤 李彤彤 郭艳琼 高峰 哈斯阿古拉
(内蒙古大学生命科学学院生物工程中心 内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室,呼和浩特 010021 )
摘 要: 根据已报道的 reticulatus甜瓜的 HMGR cDNA序列设计合成引物, 应用 RTPCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜幼果
总 RNA中克隆得到 HMGR的全长 cDNA序列,共 1 939 bp,编码 588个氨基酸。序列比对及系统发育分析表明, 该 HMGR cD
NA序列与已报道的 reticulatus甜瓜 HMGR基因 cDNA序列完全一致, 和拟南芥 HMG1亲缘关系最近。该基因的克隆为研究
该基因在甜瓜中的表达特性及其功能奠定基础。
关键词: 甜瓜 HMGR基因 cDNA RTPCR
Cloning and Sequence Analysis of the 3hydroxy3methylglutaryl
Coenzym eA Reductase Gene cDNA from M elon
Cultivar Hetao(Cucum ismelo L. cv. Hetao)
H ao Jinfeng L iT ongtong GuoYanqiong Gao F eng H asiAgula
(B iotechnology C enter, College of Life Sciences, InnerM ongolia University,
InnerM ongolia K ey Laboratory of H erbage& Endem ic Crop B io technology,H ohhot 010021)
Abstrac:t A pa ir o f specific prim ers w as designed based on the nuc leo tide sequence o f CmHMGR gene from m e lon reticu la tus
va riety in GenBank. The fu llleng th cDNA of HMGR w as c loned by RTPCR from young fru it o f me lon(Cucum ism elo L. cv. H e tao ).
The leng th o f cDNA w as 1 939 bp, encoding 588 am ino ac ids. Sequence analysis and the phy log enetic trees showed that the cDNA se
quence w as consistent w ith that of reported m e lonHMGR cDNA, and this gene was close ly re la ted toHMG1 o fA rab idop sis. The c lon ing
o f theHMGR gene fu llleng th cDNA prov ides the basis for e luc ida ting the expression characteristics and func tion of the HMGR gene
during deve lopm ent of m elon.
Key words: M elon HMGR gene cDNA RTPCR
收稿日期: 20100302
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30660111) , 国家基础科学人才培养基金资助项目 ( J0730648)
作者简介:郝金凤,女,讲师,研究方向:植物分子生物学及基因工程; Em ai:l haoj indd@ 163. com
通讯作者:哈斯阿古拉, Em ai:l h as ind@ s ina. com
萜类化合物在植物发育的许多生物学过程中起
着重要的作用,而类异戊二烯是构成萜类化合物的基
本结构单元。植物类异戊二烯代谢是植物体内重要
的代谢途径,它是植物生命活动必不可少的环节之
一,如与植物生长调节相关的植物激素、与光保护相
关的类胡萝卜素、在植物与植物、植物体内对病原菌
起抗性作用的倍半萜或类倍半萜化合物、调节细胞膜
流动性的甾体、起电子传递作用的质体醌等物质的生
物合成,均源于植物类异戊二烯代谢途径, 而且,许多
特殊萜类在植物细胞信号转导和抗逆生理过程中也
发挥着重要功能 [ 1- 5]。在高等植物中,类异戊二烯代
谢至少存在两条途径, 甲羟戊酸 (MVA )途径是植物
体内合成萜类的主要途径。 3羟基3甲基戊二酸辅
酶 A还原酶 ( 3hydroxy3methy lglutaryl coenzyme A
reduetase, HMGR)是 MVA途径的一个关键酶,也是细
胞质萜类代谢中的重要调控位点。在快速生长的植
物组织中, HMGR活性很高,成熟组织中的活性则相
对较低。在番茄中, HMG1基因编码的 HMGR在果实
的早期发育过程中是必需的 [ 6]。甜瓜 (Cucum ismelo
L. )授粉后的果实生长初期 HMGR mRNA上升, 末期
2010年第 8期 郝金凤等:甜瓜 HMGR基因全长 cDNA的克隆及序列分析
明显下降, 成熟期间又显著上升 [ 7]。在番茄 [ 8]、鳄
梨 [ 9]、甜瓜 [ 10]中已经证实, HMGR在果实发育过程中
参与细胞的分化和生长。
HMGR基因是由 3个基因 ( hmgr1、hmgr2、
hmgr3)组成的基因家族 [ 11] , 近年来, 很多植物中编
码 HMGR的基因家族不断被发现,目前 HMGR基因
已从拟南芥 [ 12 ]、马铃薯 [ 13]、番茄 [ 14]、甜瓜 [ 7]以及多
种中药原料植物如紫杉 [ 15 ]、大戟 [ 16 ]、柴胡 [ 17]等多
种植物中克隆。为研究 HMGR在甜瓜果实生长、发
育以及成熟过程中的特异性功能, 本研究克隆了
HMGR全长 cDNA。
1 材料和方法
1. 1 植物材料和试剂
甜瓜品种河套蜜瓜原种由本实验室保存, 在大
田种植, 采摘授粉后 10 d的幼果, 于液氮速冻,
- 80 保存备用。
大肠杆菌 (E. coli ) DH5由本实验室保存。反
转录试剂盒购自 Inv itrogen公司; 克隆载体 pMD19
T、限制性内切酶、PrimeSTARTM HS DNA 聚合酶、
dNTPs、氨苄青霉素、DNA marker等购自大连宝生物
公司; PCR产物纯化试剂盒购自上海生工生物工程
有限公司;其余试剂为进口或国产分析纯。
1. 2 甜瓜果实总 RNA提取
采用异硫氰酸胍法结合 KA c沉淀多糖法提取
甜瓜果实中果皮组织总 RNA [ 18]。
1. 3 引物设计与合成
根据 GenBank上登录的 reticulatus甜瓜的 HMGR
cDNA序列 (登录号: AB021862),设计特异性引物。上游
引物 P1序列: 5!TGCTCTAGACTAACGCTTCTCTTC
CTCTAT3!, 5!端设计限制性酶 Xba∀酶切位点;下
游引物 P2序列: 5!TATGGTACCTGTAAACCAGC
CAGAAGCCAT3!, 5!端设计限制性酶 Kpn∀酶切位
点,引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1. 4 cDNA克隆及序列分析
取 5 g总 RNA做模板, 加 50 mol/L O ligo
( dT) 20引物 1 L,加 10 mmo l/L dNTP 2 L, 灭菌
无 RN ase水 5 L, 65 变性 5 m in, 迅速放在冰上 5
m in。然后依次加入 5 # cDNA Buffer 4 L、0. 1mo l/
L dTT 1 L、15U /L反转录酶 M MLV 1 L、40U /
L RNaseout 1 L, 反应程序: 50 , 50 m in; 60 ,
10m in; 70 , 10m in; 85 , 5 m in; 4 , 5 m in。反应
结束后,加 RN aseH 1 L, 37 反应 30 m in, - 20
保存备用。
以合成的 cDNA第一链为模板, 采用 Pr imeST
AR
TM
HS DNA聚合酶进行 PCR扩增。 PCR反应程
序: 94 预变性 1 m in, 94 变性 30 s, 60 退火 40
s, 72 延伸 2 m in, 扩增 30个循环后, 72 延伸 10
m in。 PCR产物经 1. 0%琼脂糖电泳检测。
PCR产物经 PCR产物纯化试剂盒纯化后与
pMD19T载体连接, 转化大肠杆菌 DH5, 在含有
Amp的 LB平板上筛选阳性克隆, 然后随机挑选经
P st∀或 Xba∀ /Kpn∀酶切确认的重组质粒 3个独立克
隆,进行序列分析。将所测的序列结果进行 B last序
列相似性分析,用 DNAStar软件对 12种植物 HMGR
进行序列比较分析,所用的序列来自 NCBI( http: ∃
www. ncb.i n lm. nih. gov ) , 序列号分别为拟南芥
( L19261、L19262)、番茄 ( L40938、AF420477)、马铃薯
( L01400、U51985、U51986)、甜瓜 (AB021862)、黄瓜
( D63389)、水稻 (U95816、L28995)。
2 结果与分析
2. 1 RNA的分析
从电泳图 1可以清晰地看出 28S rRNA、18S
rRNA和 5S rRNA 3条 rRNA条带, 其中 28S rRNA
条带的亮度大约为 18S rRNA的 2倍, 说明总 RNA
良好的完整性。进一步通过紫外分光光度法测定
RNA的 OD值,结果表明 OD260 /OD280为 1. 98, 表明
总 RNA纯度较高,符合后续试验要求。
图 1 甜瓜果实总 RNA的电泳结果
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
2. 2 RTPCR产物的分析
RTPCR扩增后得到约 2 kb的特异性条带 (图
2) ,与预期相符。
2. 3 cDNA克隆及序列分析
将得到的特异性条带进行克隆和酶切鉴定 (图
3) ,由于已报道的 CmHMGR基因序列内部有一个
P st∀ 酶切位点 ( 689 bp), 与载体 pMD19T连接后
用 P st∀单酶切时, 会出现 700 bp或 1 300 bp两种
结果, 电泳结果表明已经得到预期正确的克隆。
1. DL 2000M arker; 2 - 4. RTPCR产物
图 2 甜瓜 HMGR基因的 cDNA扩增
将 3个独立克隆进行测序分析,结果 (图 4)表
明, 克隆的该基因 cDNA核苷酸序列长度为 1 939
bp, 编码区共 1 764 bp, 与已报道的 CmHMGR mR
NA序列完全一致, 编码 588个氨基酸组成的蛋白。
通过 DNAS tar软件对几种植物 HMGR基因序列进
行了系统发育分析,构建了系统发育树 (图 5) ,结果
显示该甜瓜与 reticu latus甜瓜 HMGR基因在进化上
完全一致,和拟南芥 HMG1亲缘关系最近。
1. DNA /H ind% m arker; 2, 3. P st∀单酶切的重组质粒;
4. X ba∀和 Kpn∀双酶切的重组质粒
图 3 重组质粒的酶切鉴定
下划线为引物序列
图 4 克隆的 HMGR基因的核苷酸序列
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图 5 部分植物 HMGR的系统树
3 讨论
研究表明,在番茄早期的果实发育过程中 HMG1
基因的转录水平及其蛋白活性均很高,而在成熟的番
茄果实中,即使 HMG2的转录水平很高,其蛋白活性
却很低 [ 6]。CmHMGR基因转录产物的积累与番茄
的两个基因 HMG1和 HMG2的积累模式相同, Cm
HMGR基因及其蛋白活性在果实发育早期显著增加,
而且 HMGR活性与甜瓜果实的大小相关 [ 7 ]。
本研究克隆了甜瓜品种河套蜜瓜的 HMGR的
全长 cDNA, 与已报道的 reticulatus甜瓜的 HMGR
cDNA序列完全相同, 表明了甜瓜这两个品种间
HMGR的高度保守性。HMGR基因的克隆为研究
HMGR在决定果实大小中的调控作用奠定了基础,
同时也是研究 HMGR在甜瓜中的表达特性及其特
异性功能的前提。
参 考 文 献
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(下转第 115页 )
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