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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
三角梅 ISSR反应体系的建立和优化
李房英1 黄彦晶2 吴少华2 赖钟雄2
(1福建农林大学园林学院，福州 350002;2福建农林大学园艺学院，福州 350002)
摘 要: 对影响三角梅 ISSR-PCR扩增反应的各个参数进行优化，建立适合三角梅的 ISSR 反应体系:PCR 反应体积为
20 μL，其中 10 × buffer(含 Mg2 +)2. 0 μL，dNTP 250 μmol /L，Taq酶 1. 0 U，引物 0. 3 μmol /L，模板 DNA 20 ng。扩增程序:94℃
预变性 5 min;94℃变性 1 min，51. 6℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，34 个循环;最后 72℃延伸 7 min。该反应体系标记点位清晰、
稳定、重复性好，适宜三角梅 ISSR分析，为应用 ISSR技术鉴定三角梅种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究
奠定了基础。
关键词: 三角梅 ISSR 体系建立 优化
Establishment and Optimization of ISSR System in Bougainvillea
Li Fangying1 Huang Yanjing2 Wu Shaohua2 Lai Zhongxiong2
(1College of Landscape Architecture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002;
2 College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002)
Abstract: Factors affecting ISSR-PCR application of Bougainvillea were optimized and ISSR system for Bougainvillea was estab-
lished． Each 20 μL amplification reaction consisted of 2. 0 μL 10 × buffer(include Mg2 +) ，250 μmol /L dNTP，1. 0 U Taq polymerase，
0. 3 μmol /L ISSR primer，20ng DNA template． Amplication was under the following conditions:5 min at 94℃ for 1cycle，followed by
1 min at 94℃，1 min at 51. 6℃，and 2 min at 72℃ for 34 cycles，and 7 min at 72℃ for a final extension． The clear，stable and repro-
ducible optimal ISSR-PCR reaction system was established for ISSR analysis of Bougainvillea，which could laid foundation for ISSR a-
nalysis on studies of germplasm resources identification，molecular marker assisted breeding and genetic diversity．
Key words: Bougainvillea ISSR Establishment of system Optimization
收稿日期:2010-01-21
基金项目:国家支撑计划(子课题)菊花等闽台特色花卉新品种引进创新和离体保存研究(2007BAD07B03)
作者简介:李房英，女，硕士，副教授，研究方向:园林植物及规划设计
通讯作者:吴少华，硕士，教授，博士生导师，E-mail:348279953@ qq． com
三角梅(Bougainvillea spectabilis Willd．)又名九
重葛、毛宝巾、勒杜鹃，在我国已有 100 多年的栽培
历史，品种丰富。我国部分研究者在同工酶水平上
对三角梅品种进行亲缘关系分析，但存在难以解释
之处［1］，至今仍有分类标准不统一、分类手段有一
定的局限性，所得分类结果不一致以及同名异物、同
物异名等问题，给生产、园林应用、交流等方面带来
诸多困难。而三角梅有关分子标记方面的研究仍是
空白，因此利用分子标记技术进行三角梅的分类、品
种鉴定等显得尤为重要。
ISSR(inter-simple sequence repeat，ISSR)又称简
单重复序列扩增，是由 Zietkiewicz 等于 1994 年创建
的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记［2］，
具有操作简单，标记重复性好，稳定程度高，多态性
丰富，DNA用量少，成本低等优点，已被广泛用于遗
传多样性、品种鉴定、系统发育、基因定位、分子标记
育种等方面［3］。
试验对影响三角梅 ISSR-PCR 扩增反应的各个
参数进行优化，建立适合三角梅的 ISSR-PCR 反应
体系，为应用 ISSR分子标记技术进行三角梅种质资
源研究、分子育种等创造条件。
1 材料与方法
1. 1 材料
三角梅“亮叶紫花”品种嫩叶取材自厦门植物园。
2010 年第 7 期 李房英等:三角梅 ISSR反应体系的建立和优化
1. 2 试剂和仪器
ISSR引物序列源自加拿大的英属哥伦比亚大
学(University of British Columbia) ，购自上海生物工
程技术服务有限公司。Taq酶等试剂购自大连宝生
物(TaKaRa)有限公司。梯度 PCR 仪 Tgradient 为
Biometra公司产品。
1. 3 方法
1. 3. 1 三角梅基因组 DNA 的提取 采用改进的
CTAB法［4］提取基因组 DNA。DNA经 1. 0%琼脂糖
凝胶电泳分析，用 TU-1810 紫外分光光度计测定
OD260 / OD280 的吸光值，确定 DNA 浓度和质量。
DNA-20℃保存备用。
1. 3. 2 ISSR-PCR反应体系参数的优化 参照其它
物种 ISSR反应的条件［57`］以及预备试验的结果，初
步设定各成分的用量:ISSR-PCR反应体积为20 μL，
10 × buffer(含 Mg2 +)2. 0 μL，模板 DNA 20 ng，Taq
酶 1. 0 U，引物 0. 3 μmol /L，dNTP 200 μmol /L。PCR
扩增反应程序:94℃预变性 5 min;94℃变性1 min，
52℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，38 个循环;72℃延
伸 7 min。PCR扩增产物在 1. 5%琼脂糖凝胶电泳
分析上，100 V 稳压电泳 2. 0 h，EB 染色，凝胶成像
系统观察、拍照。
经过初步的引物筛选，选用引物 UBC814(CTC
TCT CTC TCT CTC TA)进行 PCR 反应体系的建立
和优化。对影响 ISSR-PCR 扩增的主要参数设置了
不同的梯度:采用梯度 PCR模式，以 Tm值 52. 18 为
中心，生成了 48. 1℃、49. 2℃、50. 4℃、51. 6℃、
52. 8℃、54℃、55. 2℃ 7 个退火温度梯度;设计 10、
20、30、50、75、100、150 ng 7 个模板 DNA 用量梯度;
0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5U 7 个 Taq酶用量梯
度;0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7 μmol /L 7 个引
物浓度梯度;100、150、200、250、300、350、400 μmol /L
7 个 dNTP浓度梯度以及 31、34、37、40、43、46、49 7
个循环数。
2 结果与分析
2. 1 DNA检测
用 1%琼脂糖凝胶电泳，检测其完整性，由结果
(图 1)可以看到 1 条整齐的条带，无弥散的荧光出
现，加样孔清晰，表明所提取的 DNA样品较纯，基本
没有多糖等杂质，无降解和 RNA 污染。DNA 样品
在紫外分光光度计测定 OD260、OD280，OD260 /OD280比
值在 1. 65 － 1. 85 之间，符合 PCR的要求。
M． 15 000 DNA ladder;1 － 5．三角梅样品
图 1 三角梅 DNA电泳图
2. 2 退火温度对扩增结果的影响
退火温度不仅与引物序列有关，还与物种 DNA
的序列有密切关系，因此在进行 ISSR扩增优化之前
确定引物的退火温度非常重要［8］。退火温度不同，
产生错配的程度也不同，通常较低的温度在保证引
物与模板结合稳定性的同时，也会使引物与模板之
间未完全配对的一些位点间得到扩增，即产生一定
的错误扩增。因此，在允许的范围内，选择较高的退
火温度可减少引物和模板之间的非特异性结合，提
高 PCR 反应的特异性［9］。从 ISSR 随机引物
UBC801 － UBC900 中挑取若干个引物进行 PCR 扩
增的预备，从中选择 UBC814 作为体系优化的引物。
由图 2 中可见，温度低于 50. 4℃时，条带减少并模
糊;温度高于 52. 8℃时，片段减少，51. 6℃时，谱带
最清晰，多态性最好，由此确定引物 UBC814 的最佳
退火温度为 51. 6℃。
M. 2 000 DNA ladder;1 － 7．退火温度分别是 48. 1、49. 2、
50. 4、51. 6、52. 8、54、55. 2℃
图 2 退火温度对扩增结果的影响
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2. 3 模板 DNA用量对扩增结果的影响
PCR反应中对模板 DNA 浓度要求的范围通常
较宽，但研究表明，模板 DNA浓度过低，分子碰撞的
概率低，偶然性大，扩增产物无或不稳定;模板量过
高，会相应增加非特异性产物的扩增［10］。图 3 是模
板 DNA 不同用量的扩增结果。由图 3 可见，在
20 μL反应体系中，添加 10 － 30 ng 模板 DNA 的效
果最佳，DNA 浓度高于 50 ng 时，扩增出的条带减
少，在 20 － 30 ng 时条带最清晰。从节约成本和提
高扩增效果的角度出发，20 ng 的模板 DNA 用于三
角梅 ISSR-PCR扩增为最佳选择。
M. 2 000 DNA ladder;1 － 7． 模板 DNA 用量分别是 10、
20、30、50、75、100、150 ng
图 3 模板 DNA用量对扩增结果的影响
2. 4 Taq酶用量对扩增结果的影响
Taq酶使用量直接影响扩增反应的成功与否，
使用高浓度的 Taq 酶不仅提高了成本，而且容易
产生非特异扩增产物;而 Taq 酶浓度过低，则会导
致产物的合成效率下降。Taq 酶单位大小也对条
带的数量和强弱影响较大。由图 4 可见，随着所
加 Taq酶单位的逐渐增多，条带的数量开始急剧
减少，亮度也开始逐渐减弱。当 Taq 酶在 1. 0 －
2. 0 U时条带较清晰稳定，从经济角度考虑，选用
1 U的 Taq酶。
2. 5 随机引物浓度对扩增结果的影响
引物浓度的调整实质上是改变了引物和模板
配对的几率，从而影响扩增结果。引物浓度过低，
导致引物和模板的结合率降低，使扩增反应过早
终止，扩增条带很弱，甚至得不到可观察的结果;
引物浓度过高，引物与模板的非特异性配对增多，
出现非特异性扩增［11］。由图 5 看出，20 μL 反应
体系中，引物浓度低于 0. 2 μmol /L时，分子量相对
较小的条带较弱，引物浓度高于 0. 4 μmol /L时，分
子量相对较大的条带较弱，当浓度为 0. 3 μmol /L
时，条带较清晰稳定。因此选择 0. 3 μmol /L 为反
应体系的最佳引物浓度。
M． 2 000 DNA ladder;1 － 7． Taq酶浓度分别是 0. 5、1. 0、
1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5 U
图 4 Taq DNA聚合酶用量对扩增结果的影响
M． 2 000 DNA ladder;1 － 7． 引物浓度分别是 0. 1、0. 2、
0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7 μmol /L
图 5 引物浓度对扩增结果的影响
2. 6 dNTP浓度对扩增结果的影响
dNTP作为扩增的底物直接影响 PCR 扩增效
果。底物浓度过高，会导致 PCR 错配，从而使扩增
出现非特异性扩增，此外过量的引物浓度还会导致
引物二聚体的形成;底物浓度过低会影响合成效率，
甚至会因过早的消耗而使产物单链化，影响扩增效
果［12］。由图 6 可知，dNTP的浓度低于 200 μmol /L，
扩增产物明显减少或扩增出来的条带模糊不清，当
dNTP的浓度高于 300 μmol /L 时，扩增产物减少。
根据条带出现情况，选择 250 μmol /L为反应体系中
dNTP的浓度。
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2010 年第 7 期 李房英等:三角梅 ISSR反应体系的建立和优化
2. 7 循环数对扩增结果的影响
PCR的循环次数决定产量，次数太少，产物量极
低，次数太多，达到反应平台后，循环不会使产物明显
增加，反而引起非特异性扩增。不同物种适宜的循环
次数不同［13］，如小苍兰［3］为 35 次，腊梅［10］为 38 次。
循环数对三角梅 ISSR-PCR扩增的影响见图 7。由图
7可以看出，循环数低于 34次时，扩增谱带较弱，多态
性降低;循环数过高会使一些谱带亮度过强，掩盖了
弱带。34个循环扩增的谱带清晰，多态性好。
2. 8 优化反应体系的确定
通过试验，对三角梅 ISSR-PCR 反应体系进行
了优化，适合三角梅 ISSR分析的反应体系是 20 μL
体积中，模板 DNA 20 ng，引物 0. 3 μmol /L，dNTP
250 μmol /L，Taq酶 1. 0 U，10 × buffer(含 Mg2 +)2. 0
μL;PCR扩增程序是 94℃预变性 5 min;94℃变性
1 min，51. 6℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，34 个循
环;最后 72℃ 延伸 7 min。利用此优化体系，在
51. 6℃的退火温度下，对三角梅 6 个样品进行 ISSR-
PCR扩增。由图 8 可知，ISSR-PCR扩增得到较为清
晰稳定的 ISSR谱带，并具有较多条带。
M. 2 000 DNA ladder;1 － 7． dNTP 浓度分别是 100、150、200、
250、300、350、400 μmol /L
图 6 dNTP浓度对扩增结果的影响
M． 2 000 DNA ladder;1 － 7．循环数分别是 31、34、37、40、43、46、49
图 7 循环数对扩增结果的影响
M． 2 000 DNA ladder;1 － 6．三角梅 6 个品种
图 8 引物 UBC814 对三角梅 6 个
样品的 ISSR扩增结果
3 讨论
ISSR引物序列较长，退火温度较高，结合了
RAPD的操作简单和 SSR 的多态性好的优点，而且
它的重复性比 RAPD 高，在引物设计上比 SSR 技术
简单得多，无需预先知道 DNA序列即可用引物对其
进行扩增［14］。因此，ISSR 是一种理想的检测三角
梅种内遗传变异的分子标记。
ISSR分子标记是基于 PCR的标记，其反应结果受
到诸如退火温度、循环次数、模板 DNA 质量及浓度、
Taq酶用量、引物浓度、dNTP浓度等多种因素的影响。
因此，为了获得重复性和可靠性较高的 ISSR谱带，在
研究时都应建立起合适的反应体系并对其进行优化，
特别是第一次在某种生物上应用该项技术的时候。
同时还应注意尽可能的使用统一厂家的药剂和同一
仪器设备才能保证分析结果的重复性和可靠性。
本试验采用单因素试验设计，逐一研究各因素
不同处理水平对 ISSR-PCR 的影响，比较系统和精
细地研究了各主要因子的影响，建立了三角梅 IS-
SR-PCR优化反应体系。同时，本研究可为三角梅
种质资源分析、遗传图谱构建、遗传多样性分析、分
子标记辅助育种等研究提供借鉴。
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