全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-05-30
作者简介：冯晶晶（1980-），女，硕士研究生，研究方向：基因工程
通讯作者：吕茂民，Tel：010-66932223；E-mail：maominlv@126.com
巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母，是一种有效的外源基因表达系统，许多外源蛋白已经在毕赤酵母
中成功地表达 [1~4]。 但是毕赤酵母每个转化子表达外源蛋白的能力差异极大，由于所表达蛋白的特性不同，
有些重组酶类可以通过底物分解法快速筛选高表达转化子，而对于多数外源蛋白，其高表达转化子的筛选
非常困难。 通常，利用抗性压力筛选或构建多拷贝基因的方法来获得高表达菌株，这些筛选方法极为费时
费力。 因此，建立一种快速、便捷的筛选高表达菌株的方法尤为重要。
1997 年 McGrew 等 [5]首先建立了一种免疫筛选法，在该方法的基础上进行了适当的改进，并应用本研
究室构建的表达载体 pPIC9-Endostatin 进行了高通量转化子的筛选，证实了该方法的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
重组质粒 pPIC9-Endostatin 为本室构建；宿主菌 GS115 为本室保存；山羊抗人内皮抑素抗体购自 R＆D
一种快速筛选酵母高表达菌株的新方法
冯晶晶 1，2 赵媛媛 1 杨梅 1，3 吕茂民 1
（1军事医学科学院野战输血研究所，北京 100850；2吉林农业大学生物技术学院，长春 130021；
3扬州大学生物科学与技术学院，扬州 225009）
摘 要： 为建立一种快速筛选酵母高表达菌株的方法，将生长在固体培养基上的新转化的表达菌落原位转移到醋
酸纤维素薄膜上，再利用硝酸纤维素薄膜原位捕获醋酸纤维素薄膜上的蛋白，然后用免疫印迹的方法检测原位转印到硝
酸纤维素膜上菌落分泌蛋白，根据免疫印迹的强弱进行高表达菌株的筛选。结果显示，经过菌落原位转印和免疫印迹显
色，显色信号强的菌落表达量相对较高。因此，双膜法原位检测是一种快速、高效的筛选酵母高表达菌株的方法。
关键词： 酵母 原位双膜法 筛选
A Novel Method for Rapid Screening the High-level Expressing
Pichia pastoris Transformants
Feng Jingjing1，2 Zhao Yuanyuan1 Yang Mei1，3 Lv Maomin1
（1Institute of Transfusion Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850；2College of Biotechnology，Jilin
Agricultural University，Changchun 130021；3College of Biological Science and Technology，
Yangzhou University，Yangzhou 225009）
Abstract： In order to establish a method for rapid screening the high-level expre sing transformants，the
transformants on the solid medium were transferred onto cellulose acetate filter，and then the secreted protein of
transformants on cellulose acetate filters were captured by nitrocellulose filter in site. The immunoblotting was performed
using corresponding antibody，and the high-level expressing transformants can be selected according to immunoblotting
figure. result indicated that according to immunoblotting coloration dot，the high-level expressing transf mants was
selected. The darker dot was high-l vel ran formants expressed. Therefore，the immunological based double filters
screening method is a rapid way to detect high-level expressing ransformants.
Key words： Pichia pastoris Immunoblotting Screening
2008年第 6期
公司 ；碱磷酶标记兔抗山羊 IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司 ；醋酸纤维素膜 （CA，φ77mm，孔径
0.45μm）、硝酸纤维素膜（CN，φ77mm，孔径 0.45μm）购自九鼎高科过滤设备有限公司；碱磷酶显色试剂盒
购自博润德生物科技发展中心；其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 转化子的制备
将重组质粒 pPIC9-Endostatin 线性化。 通过电转化法将该线性化质粒转入 GS115 宿主菌中，将转化菌
涂布于 MD/His-板（1.34%YNB，4×10-5%生物素，2%葡萄糖，2%琼脂粉），置于 30℃温箱中，孵育 2～4d 至转
化子出现。
1.3 转化子转膜
1.3.1 将醋酸纤维素膜（0.45μm，φ77mm）放置在转化子上，用玻璃涂布器轻轻地将滤膜按压直至滤膜完
全潮湿且没有气泡，使转化子转移至醋酸纤维素膜上。
1.3.2 将硝酸纤维素膜放置在 BMMY 固体培养基 （1%酵母提取物 ，2%蛋白胨 ，100mM 磷酸盐缓冲液
pH6.0，1.34%YNB，4×10-5%生物素，1%甘油，2%琼脂粉）上，将带有转化子的醋酸纤维素膜（带有转化子的
面向上）放置在硝酸纤维素膜上，将平板倒置于 30℃温箱中孵育 18h。
1.3.3 将醋酸纤维素膜移去，放置在 MD/His-平板上 4℃保存。
1.4 转印膜显色
1.4.1 将硝酸纤维素薄膜取下，用含 1%BSA 的 TBST，37℃封闭 2h 后 TBST 洗膜 3 次（10min/次）。
1.4.2 加入山羊抗人内皮抑素抗体（1：500 倍稀释，5μl 抗体用 5ml 含 1%BSA 的 TBST 稀释）室温孵育 2h
后 TBST 洗膜 3 次（10min/次）。
1.4.3 加碱磷酶标记兔抗山羊 IgG（用含 1%BSA 的 TBST 1：500 稀释）室温孵育 2h 后 TBST 洗膜 3 次（每
次 10min）。
1.4.4 按碱磷酶显色试剂盒说明书配制显色工作液（工作液：NBT：BCIP=50：1：1），将上一步骤处理后的膜
进行显色反应。
1.5 表达菌株的挑选及验证
根据免疫印迹显色结果， 从平板上挑选对应显色较强的不同转化子的克隆， 分别进行诱导表达，每
24h 取表达上清，连续诱导表达 6d，进行结果验证。
2 结果
2.1 转化子的生长
目的质粒转化入 GS115 宿主菌 2～4d 后，每块 MD/His-平板上长出约 20～100 个转化子。
2.2 转化子的筛选
将转化子菌落转移至醋酸纤维素薄膜上以后，置于 BMMY 平板上，于 30℃诱导表达。 硝酸纤维素薄膜
捕获透过醋酸纤维素薄膜的酵母分泌的蛋白，根据免疫
印迹显色的强弱鉴定转化子表达水平的高低（各显色点
对应于醋酸纤维素薄膜的相应菌落）。 结果显示不同菌
落的显色强度有明显差异（图 1），而且许多菌落在硝酸
纤维素薄膜上找不到相应显色点，说明这些菌落表达较
弱或基本无表达。
2.3 转化子表达量的鉴定
根据免疫印迹显色结果从醋酸纤维素膜上分别挑
取 A 和 B 对应的转化子菌落接种液体培养基进行诱导
表达， 取培养上清用 BCATM Protein Assay 试剂盒进行蛋白含量的测定， 结果表明免疫印迹显色强度与诱
图 1 阳性转化子的 pPIC9-EndoAlbu/GS115 的表达
A、B 为染色最深的转化子
冯晶晶等：一种快速筛选酵母高表达菌株的新方法
（下转第 174页）
169
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
（上接第 169页）
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(h) A (µg/ml) B(µg/ml)
0 143.7 126.7
24 276.3 230.1
48 286.8 269.5
72 321.3 300.1
96 398.1 347.6
120 552.3 515.7
144 502.8 473.4

表 1 不同时间内不同酵母转化子总蛋白的表达量导表达水平成正相关（表 1）。
3 讨论
外源基因在毕赤酵母中表达的一个关键环节是
高表达菌株的筛选。 在免疫筛选法的基础上进行部
分改进，建立了基于免疫印迹的原位双膜筛选法。 通
过将固体培养基上的转化子转移到醋酸纤维素薄膜
上， 再用硝酸纤维素薄膜原位捕获分泌在醋酸纤维
素薄膜上的蛋白， 然后用免疫印迹的方法原位筛选
转化子分泌的蛋白，根据显色程度可以直观地反映转化子菌落表达蛋白的能力。
以重组人内皮抑素为例开展了原位双膜法筛选高表达转化子的探索，试验结果显示：免疫印迹显色强
的转化子菌落其表达量相对较高，初步验证了此筛选方法是可行的。
应用原位双膜法可以实现酵母转化子的高通量筛选，根据免疫印迹显色的强弱可以非常直观、快捷地
筛选出高表达转化子菌落，对于其它类型的酵母高表达转化子的筛选工作也具有一定的借鉴意义。
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5 McGrew JT，Leiske D，Dell B，et al.Gene，1997，187（2）：193~200.
及分离为产脂肪酶菌株的菌种改良以及脂肪酶的高效基因工程菌的构建奠定了基础。
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