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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
GST-HRB融合蛋白的表达与纯化
刘丽杰 高学娟 刘小会 陈妙娟 朱森 刘朗夏
(暨南大学生命科学技术学院，广州 510632)
摘 要: 构建 GST-HRB重组质粒，进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定。利用 PCR扩增及基因重组技术，以 pcDNA-3. 1-
HRB为模板扩增出 HRB全基因序列，并将其插入带有 GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体 pGEX-6P-1 中，构建
GST-HRB融合蛋白表达质粒。然后，将重组质粒 GST-HRB转化至大肠杆菌 Rosseta 进行融合蛋白的表达。利用 GST 琼脂糖
珠进行融合蛋白的纯化，最后应用 SDS-PAGE电泳和 Western blotting鉴定纯化的融合蛋白。结果表明，成功构建 pGEX-6P-1-
HRB原核表达载体，表达及纯化了 GST-HRB融合蛋白。
关键词: GST-HRB 构建 融合蛋白 表达 纯化
The Expression and Purification of GST-HRB Fusion Protein
Liu Lijie Gao Xuejuan Liu Xiaohui Chen Miaojuan Zhu Sen Liu Langxia
(College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632)
Abstract: It was to construct a GST-HRB recombinant plasmid，and identify fusion protein． Using PCR and recombinant DNA
technology，HRB full gene sequence was amplified from template pcDNA-3. 1-HRB and inserted into the prokaryotic expression vector
pGEX-6P-1 with tag GST(glutathione sulfurtransferase)． The recombinant vector was then transformed into the E． coli Rosetta strain to
produce the GST-HRB fusion protein，which was purified through a Sepharose-Glutathione column，and verified by SDS-PAGE and
Western blotting using an anti-GST polyclonal antibody． We successfully constructed the GST-HRB plasmid，produced and purified the
GST-HRB fusion protein，which would lay a foundation for further research of HRB protein．
Key words: GST-HRB Construction Fusion protein Expression Purification
收稿日期:2011-06-29
基金项目:广东省自然科学基金项目(9151065004000005) ，中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(21609705，21609317)
作者简介:刘丽杰，女，硕士研究生，研究方向:微生物功能蛋白;E-mail:liulijie0406@ 126． com
通讯作者:刘朗夏，男，博士，教授，研究方向:蛋白质相互作用与癌症发病分子机理;E-mail:langxialiu@ gmail． com
HIV是获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病原
体。目前，HIV感染严重威胁人类健康，随着其感染
范围的不断扩大，至今已有超过 6 500 万人被感染，
累计有近千万人死亡［1］。HIV 主要有 1 型和 2 型，
大多数 AIDS 是因为感染 HIV-1 而引起的［2］。HIV
感染可对血脂造成影响［3］，并能特异性侵犯 CD4 + T
淋巴细胞，引起机体免疫功能严重受损，尤其损伤细
胞免疫功能，因此 HIV感染者最易发生各种机会性
感染，是造成死亡的主要原因。而如何控制 HIV 病
毒的感染当前已经成为一个研究的热点和难点。目
前，已经有文献报道，人类免疫缺陷病毒 Rev结合蛋
白(Human immunodeficiency virus Rev-binding pro-
tein，HRB)是协助 Rev 发挥作用的细胞因子，分子
量为 60 kD，能够促进 HIV 的 RNAs 从核周区释放
到胞质中［4］。而 HRB正是定位在细胞的核周区，此
部位也是囊泡运输所发生的场所［5 － 7］。
Rev是 HIV-1 复制所必需的，Rev 活性的抑制
将会干扰病毒的产生。基于此，一些研究学者试图
通过减少 Rev的表达量或阻断其功能来干预病毒的
复制能力［8］。然而，到目前为止，此策略未起到明
显的抗病毒效果［9，10］。另外，有文献报道，HRB 是
HIV-1 复制的一个必需因子，突变或干扰掉 HRB 基
因将会抑制病毒的产生［4］。更有意义的是，缺失
HRB对细胞的生存能力影响不大［7］，因此，HRB 将
成为新的抗病毒策略中一个引人注目的靶标。
2011 年第 11 期 刘丽杰等:GST-HRB融合蛋白的表达与纯化
为更好地研究 HRB 在病毒复制过程中发挥的
作用，进而找到控制病毒侵袭人体的有效方法，本研
究拟扩增 HRB 全长基因，构建含 HRB 基因的
pGEX-6P-1-HRB 重组质粒，转化至 E. coli Rosseta
感受态，并对表达的蛋白进行纯化和鉴定，为进一步
研究 HRB蛋白在病毒细胞中的生物学作用以及与
其他蛋白质的相互作用提供试验基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 主要试验设备 凝胶扫描成像系统(美国
Bio-Rad公司) ，梯度 PCR 仪(美国 Bio-Rad 公司) ，
THZ-C恒温振荡器(太仓市实验设备厂) ，垂直电泳
槽(美国 Bio-Rad公司) ，台式高速冷冻离心机(德国
Eppendorf公司) ，琼脂糖水平电泳仪(北京市六一仪
器厂)。
1. 1. 2 主要试剂 限制性内切酶 SmaⅠ，XhoⅠ，T4
连接酶，DNA Marker 及 PCR 扩增试剂盒均购自
TaKaRa公司;质粒提取、纯化及酶切片段回收试剂
盒均购自天根公司。标准低分子量蛋白购自 Phar-
macia公司。PCR引物由上海生工生物技术有限公
司合成。GST融合蛋白纯化树脂购自 GE Healthcare
公司。
1. 1. 3 质粒与菌株 质粒 pcDNA3. 1-HRB 由法国
巴黎第六和第七大学的教授 Mathilde Chaineau 惠
赠;载体 pGEX-6P-1(载体大小为 4 900 bp)及大肠
杆菌 DH5α、Rosseta为本实验室所保存。
1. 2 方法
1. 2. 1 目的基因的获得 根据 HRB 基因序列和
pGEX-6P-1 空载的多克隆位点(图 1) ，设计合成一
对引物。上游引物 5端加入 Sma Ⅰ酶切位点，下游
引物 5端加入 Xho Ⅰ酶切位点。引物序列如表 1 所
示。以 pcDNA3. 1-HRB为模板，PCR 扩增融合目的
基因片段。琼脂糖凝胶电泳鉴定后，进行回收并
纯化。
图 1 pGEX-6P-1 的多克隆位点图谱
表 1 构建 GST-HRB重组质粒的上下游引物设计
引物名称 引物序列(5 － 3)
GST-HRB-F AATTATCCCGGGTATGGCGGCCAGCGCGAAG
GST-HRB-R CCGCGGCTCGAGCTATAAGAAAGGATTGGT
1. 2. 2 感受态细胞的制备 参照文献［11］，取
－ 80℃冻存 DH5α菌株划线接种于不含任何抗生素
LB琼脂培养皿，37℃倒置培养过夜;挑取 E. coli 单
菌落，接种于 20 mL LB 液体培养基中，37℃振荡培
养过夜至对数生长中后期;按 1 ∶ 100 比例接种于
50 －100 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养 2 － 3 h
至 OD600值 0. 4 － 0. 6;将菌液转移至预冷 50 mL 无
菌离心管，4℃，4 000 r /min，离心 10 min，收集菌体;
取 2 － 3 mL新配0. 1 mol /L的 CaCl2溶液将菌体沉淀
均匀打散，再加入20 mL的 0. 1 mol /L CaCl2溶液，冰
浴 5 － 10 min，4℃，4 000 r /min 离心 10 min;同时，
配制含 15%甘油的 0. 1 mol /L 的 CaCl2溶液 5 mL
(冻存液) ;用 5 mL 冻存液重悬菌体，然后分装，标
注并冻存于 － 80℃超低温冰箱，备用。
1. 2. 3 pGEX-6P-1-HRB重组质粒的构建与鉴定
因内切酶 SmaⅠ和 XhoⅠ的酶切温度不同，故采用
顺序酶切方法，先用 SmaⅠ分别单酶切载体 pGEX-
6P-1 以及基因 PCR片段，30℃酶切后，进行回收;再
用 XhoⅠ单酶切回收的 pGEX-6P-1 和基因片段
HRB，37℃酶切后，再次回收。回收后的 PCR 产物
与载体连接。连接产物转化大肠杆菌 DH5α感受态
细胞，抽提质粒后，用 SmaⅠ和 XhoⅠ进行酶切分
析，琼脂糖电泳检查是否插入大小正确的目的片段，
并对阳性重组表达质粒进行测序，其测序结果与
GenBank数据进行比对，此质粒命名为 GST-HRB。
1. 2. 4 GST-HRB融合蛋白的诱导表达 根据稀有
密码子软件分析，HRB 基因含有大量的稀有密码
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子，故使用大肠杆菌 Rosetta 表达蛋白(Rosetta 是专
门用于表达含有稀有密码子融合蛋白的菌株)。将
GST-HRB 质粒转化大肠杆菌 Rosetta 感受态细胞
中，37℃过夜培养后挑取单菌落，在 10 mL LB 培养
液中 37℃振荡培养过夜;次日，按 1∶ 50 的比例接种
于 10 mL LB液体培养基中，培养至 OD600吸光度值
达到 0. 6 － 0. 8，取出 1 mL的菌液作为阴性对照，剩
余菌液加入异丙基-β-硫代半乳糖(Isopropyl-β-D-1-
thiogalactopyranoside，IPTG)至终浓度 0. 1 mmol /L，
室温诱导 5 h;离心收集菌体，加入 80 μL 1 × SDS缓
冲液裂解，100℃煮 10 min 各取 10 μL 进行 SDS-
PAGE电泳，考马斯亮蓝染色分析蛋白表达情况。
1. 2. 5 GST-HRB融合蛋白的纯化 根据蛋白纯化
结果先后使用超声裂解和温和裂解两种方法。超声
裂解方法步骤如下:离心收集菌体，加入含有蛋白酶
抑制剂(PI)和 PMSF 的 RIPA 裂解液，冰上裂解 10
min后超声波破菌，离心收集上清。参照文献［11］，
温和裂解菌体步骤如下:100 mL细胞培养物重悬于
4 mL PBS，加入 80 μL溶菌酶至终浓度 1 mg /mL，冰
上放置 30 min;加入 10 mL 含 0. 2% TritonX-100 的
PBS，剧烈振动混匀;然后加入 8 μL DNase 和 7 μL
RNase至终浓度 5 μg /mL，4℃，孵育 10 min，离心收
集上清，加入 DTT至终浓度 1 mmol /L。按照 GE 公
司 GST Fusion Protein Spin Purification Kit说明书，纯
化过程包括填柱、结合和洗涤。填柱:0. 5 mL 的
GST珠子悬液，静止 30 min，待其沉降完全，10 倍柱
体积的 PBS清洗柱子;结合:将裂解上清上柱;洗涤:
10倍柱体积 wash buffer 清洗纯化柱，然后 3 倍柱体
积 elution buffer洗脱蛋白，利用 SDS-PAGE电泳及后
续的Western blotting分析蛋白的纯化情况。
1. 2. 6 Western blotting 鉴定表达蛋白 按照 West-
ern blotting方法以及抗 GST蛋白抗体试剂说明书进
行，将蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，转移至 PVDF 膜，
转膜时间为 1 h，1 × TBST洗膜 3 次，10 min /次，5%
脱脂奶粉室温封闭膜 1 h 后，用兔源的 GST 多克隆
抗体，4℃，孵育过夜。次日，1 × TBST 洗膜 3 次，
10 min /次，兔二抗(1 ∶ 2 000)室温孵育 30 min 后，
1 × TBST洗膜 3 次，10 min /次，ECL显色，压片。
2 结果
2. 1 GST-HRB融合蛋白表达质粒的构建
以 pcDNA3. 1-HRB 为模板，经 PCR 扩增全长
HRB，长约 1 689 bp，与预期值相符(图 2-A) ，凝胶
回收试剂盒回收 PCR 产物(图 2-B)。经 SmaⅠ和
XhoⅠ顺序酶切 pGEX-6P-1 和 PCR 产物，载体大小
约为 4 900 bp，HRB的 PCR产物约为 1 689 bp，与预
期一致(图 2-C)。连接产物转化 DH5α 感受态，经
酶切鉴定筛选出含目的基因片段的阳性克隆(图 2-
D)。将酶切鉴定正确的质粒进行 DNA 测序鉴定，
结果显示各碱基均按正确顺序组装成全长的目的
DNA 编码序列，未发生碱基的错配和缺失现象，与
GenBank数据完全一致，证明 HRB 基因片段已成功
插入 pGEX-6P-1 表达载体。
2. 2 GST-HRB融合蛋白的表达
因 HRB 基因含有大量的稀有密码子，将 GST-
HRB质粒转入 DH5α感受态，发现该融合蛋白不能
被诱导表达(结果未显示) ，故使用专门表达含有稀
有密码子融合蛋白的菌株 Rosetta。将测序鉴定正
确的重组质粒转化大肠杆菌 Rosetta 感受态，挑取阳
性克隆过夜培养，次日，接种活化的菌液 1∶ 50 的比
例扩大培养，当 OD600达到 0. 6 － 0. 8 时，加入 IPTG
至终浓度为 0. 1 mmol /L，室温诱导 5 h。取样，进行
SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色。结果(图 3)显
示，加入 IPTG 前，GST-HRB 融合蛋白表达不明显;
加入 IPTG诱导 5 h 后，GST-HRB 融合蛋白的条带
已清晰可见。融合蛋白分子量大小在 87 kD 左右
(HRB单体分子量约 60 kD，加 GST标签蛋白 27 kD
共约 87 kD) ，与预期一致。
2. 3 GST-HRB融合蛋白的纯化
表达 GST-HRB 的 Rosetta 菌液分别进行超声
裂解和温和裂解，两者的上清纯化结果如图 4 所
示。超声裂解菌体后，纯化得到的 GST-HRB 融合
蛋白中混有较多的杂蛋白(图 4-A) ，而温和裂解
法处理后(图 4-B) ，杂带明显减弱，推测因为超声
裂解法相对比较剧烈，导致了大量断裂蛋白片段
产生。温和裂解法更有利于 GST-HRB 蛋白的
纯化。
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2011 年第 11 期 刘丽杰等:GST-HRB融合蛋白的表达与纯化
A:PCR扩增 HRB基因，1 － 5． PCR扩增产物;B:PCR产物回收，1． HRB 的 PCR回收产物;C:pGEX-6P-1 空载及
PCR产物顺序酶切回收，1，3．空载及 PCR产物经 Sma I单酶切后回收;2，4．回收的空载及 PCR产物再经 Xho I
酶切回收;D:HRB重组质粒双酶切鉴定，1． pGEX-6P-1;2．重组质粒1号;3．重组质粒2号;4．酶切的 pGEX-6P-1;
5．重组质粒 1 号双酶切;6．重组质粒 2 号双酶切;7．酶切的 PCR产物，大小约 1 689 bp;M． DNA marker
图 2 GST-HRB重组质粒的构建
M．蛋白 Marker;1．未诱导;2． IPTG诱导
图 3 IPTG诱导 GST-HRB融合蛋白表达
A．超声裂解法纯化 GST-HRB融合蛋白，1．上清中 GST-
HRB的纯化，＊． 蛋白杂带;B． 温和裂解法纯化 GST-
HRB融合蛋白，1．上清中 GST-HRB的纯化;M． Marker
图 4 GST-HRB融合蛋白的纯化
2． 4 GST-HRB融合蛋白的鉴定
由于 pGEX-6P-1在多克隆位点上游带有 GST标
签蛋白，可与相应抗体结合，因此采用抗 GST 多克隆
抗体进行检测。经 Western blotting 检测证实该融合
蛋白可与 GST 多克隆抗体发生特异性反应，结果如
图 5所示，大约在 87 kD位置有清晰的目的条带。
3 讨论
HRB蛋白是协助 Rev发挥作用的细胞因子，能
够促进 HIV 的复制和扩增［10］，在 HIV 发生发展过
程中起着重要的作用。为了进一步研究 HRB 参与
HIV发生发展的分子机制，本研究构建了 pGEX-6P-
M．蛋白质分子量标准;1． GST-HRB融合蛋白
图 5 Western blotting分析纯化的 GST-HRB蛋白
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
1-HRB质粒并纯化了 GST-HRB 蛋白，为进一步研
究 HRB的生理功能打下基础。
首先，在构建 pGEX-6P-1-HRB 重组质粒过程
中，我们克服了一些难题。在引物设计方面，由于
HRB cDNA起始和结尾的碱基序列特征以及 pGEX-
6P-1 空载体多克隆位点的特征，所设计引物的 G +
C含量比较高，上游引物的 Tm 值为 100℃，下游引
物的 Tm值为 92℃，试验过程中通过 Tm 温度梯度
PCR方法确定最佳的 Tm 值为 63℃。另外，由于
pGEX-6P-1 空载体多克隆位点相对比较少，以及
HRB的碱基序列特征，致使可选择的限制性内切酶
比较少，我们最终选择了 XhoⅠ和 SmaⅠ两个内切
酶。需要说明的是 SmaⅠ酶切后产生平末端，影响
后面酶切产物的连接效率，而且有同裂酶 XmaⅠ。
另外，由于 XhoⅠ和 SmaⅠ的酶切温度不同，选择顺
序酶切的方法，先采用 30℃ 4 h进行 SmaⅠ单酶切，
分别回收空载和 PCR 产物，再利用 37℃ 4 h XhoⅠ
单酶切回收上一步的空载和 PCR 产物。最后经过
连接、转化、抽提质粒以及双酶切鉴定，成功构建了
pGEX-6P-1-HRB重组质粒。
其次，在 GST-HRB融合蛋白的表达与纯化过程
中，同样出现了一些难题。GST-HRB 融合蛋白的表
达方面，由于 HRB 全基因中的稀有密码子较多，致
使 GST-HRB不能在普通的大肠杆菌 DH5α 中进行
表达。为此，我们选用了大肠杆菌 Rosseta 菌株，该
菌株能较好地表达含有较多稀有密码子的融合蛋
白。在纯化方面，由于该融合蛋白自身的一些特性，
我们不能按常规方法得到较纯的 GST-HRB 融合蛋
白。试验过程中，我们将超声菌体裂解法改为温和
的多次冻融菌体裂解法，然后将得到的菌体上清上
柱纯化。纯化的蛋白经 SDS-PAGE电泳和考马斯亮
蓝染色分析，得出温和菌体裂解法更好，增加了
GST-HRB融合蛋白的纯度。我们认为温和裂解法
对 GST-HRB融合蛋白的破坏性较小，能够有效地减
少 GST-HRB融合蛋白的断裂片段。
4 结论
本课题成功构建了 pGEX-6P-1-HRB 重组质
粒，通过诱导其在大肠杆菌中表达及后续的纯化
试验，成功获得了纯化的 GST-HRB 融合蛋白，为
以后深入研究 HRB 蛋白的奠定了基础，如利用
GST pull down 技术研究 HRB 与其它蛋白的相互
作用(包括直接的相互作用)以及 GST pull down
技术结合质谱仪在各种生理条件下筛选细胞中与
HRB 结合的蛋白质。
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