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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
酿酒酵母菌核糖体
RNA沉降系数的初步研究
牟岱英 刘红 蔡生力 钟立强
(上海海洋大学 农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室 ,上海 201306)
　　摘 　要 : 　为研究酿酒酵母菌核糖体 RNA ( rRNA )的沉降系数 ,用酶解法和液氮研磨法裂解酿酒酵母菌的细胞壁 , Trizol
Reagent提取其总 RNA,同时提取小白鼠和斑马鱼的总 RNA进行比较。经紫外分光光度计检测和甲醛琼脂糖变性胶电泳后 ,
RNA纯度好 ,条带清晰 ,无弥散或降解现象。试验发现 ,与酶解法相比 ,用液氮研磨法破碎酿酒酵母菌细胞壁提取总 RNA所
用的成本低 ,时间少 ,产率和纯度高 ,适用于少量样品 RNA的提取。同时 ,酿酒酵母菌与斑马鱼和小白鼠总 RNA电泳图谱表
明 ,三者的“18S rRNA”在条带大小方面差异较小 ,而“28S rRNA”差异较大。利用分析型离心机测得的酿酒酵母菌两个较大
rRNA的沉降系数分别为 2417S和 1811S。研究结果表明了真核生物 rRNA种类的多样性。
关键词 : 　酿酒酵母菌 酶解法 液氮研磨法 甲醛变性胶电泳 沉降系数
Study on the Sedimentation Coeff ic ient of Ribosomal
RNA from Saccha rom yces cerevisiae
Mou Daiying L iu Hong Cai Shengli Zhong L iqiang
( Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources and Aquacultural Ecosystem Certified by
the M inistry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)
　　Abs trac t: 　 To study the sedimentation coefficient of ribosomal RNA from Saccharom yces cerevisiae, the enzymolysis method and
the liquid nitrogen grounding method combined with Trizol Reagent were used for total RNA extraction from Saccharom yces cerevisiae.
RNA extraction in M us m uscu lus Kunm ing and D anio rerio, was also involved in, which was set as control. The RNA concentration and
the A260 /A280 ratio were measured by the ultraviolet spectrophotometer, and the RNA integrity was checked by formaldehyde denaturing
gel. The A260 /A280 ratio ranged between 118 and 211 indicating that the RNA is relatively pure. Fractionation by agarose gel electropho2
resis revealed distinct bands, without obvious smearing or degradation. Compared with enzymolysis method, the liquid nitrogen grounding
method is less expensive and less time2consum ing, but gives higher yield and purity, and suitable for RNA isolation from small number
of samp les. The result of electrophoresis showed that“18S”bands of the three species are alike in size, while“28S”bands vary to some
extent. Analytical ultra2centrifuge was used to calculate the sedimentation coefficient of the two larger rRNA from Saccharom yces cerevisi2
ae, 2417S and 1811S, respectively1 These results showed the diversity of rRNA species among eukaryotic organism s.
Keywo rds: 　Saccharom yces cerevisiae Enzymolysis method L iquid nitrogen grounding method Formaldehyde denaturing gel
electrophoresis Sedimentation coefficient
收稿日期 : 2009209221
基金项目 :上海市教育委员会重点学科建设项目 (海洋生物学 ) (J50701)
作者简介 :牟岱英 (19832) ,在读硕士 ,研究方向 :海洋生物学 ; E2mail: daiyingmu24@126. com
通讯作者 :刘红 (19692) , E2mail: hliu@ shou. edu. cn沉降系数 ( S)可以用来表示核糖体 RNA的大小 ,在核糖体分类方面具有重要的作用。 rRNA 沉降系数的研究开始于 20世纪 50年代 ,酿酒酵母菌(S accharom yces cerevisiae)作为重要的模式生物 ,是 最早被研究的真核生物之一。然而关于其较大的两个 rRNA的沉降系数一直以来未能得到统一 :有的认为是 26S和 18S[ 1 ] ;有的认为是 25S和 18S[ 2～4 ] ;也有的认为酿酒酵母菌细胞质中含有 28S和 18S
2009年第 12期 牟岱英等 :酿酒酵母菌核糖体 RNA沉降系数的初步研究
rRNA ,线粒体含有 25S和 15S rRNA [ 5 ] ;有的则笼统
地认为真核生物两个较大的 rRNA的沉降系数都是
28S和 18S[ 6, 7 ]。以上说法均是后来研究者引用前
人的研究结果 ,而关于这些说法的最初研究资料 ,由
于年代久远 ,很难考证。
本试验在前人研究的基础上 ,利用新的研究
手段对酿酒酵母菌两个较大的 rRNA的沉降系数
进行测定。同时为了比较真核生物间 rRNA的大
小 ,提取斑马鱼和小白鼠的总 RNA 进行比较
研究。
1　材料与方法
111　材料
酿酒酵母菌来自本校微生物实验室 ,利用马铃
薯葡萄糖液体培养基 ( 20%马铃薯 , 2%葡萄糖 )
30℃,培养 12～16 h。昆明种小白鼠 (M us m uscu lus
Kunm ing)来自第二军医大学 ,斑马鱼 (D anio rerio)
购于上海南汇区观赏鱼市场。
112　试验器材
RNA制备中最关键的因素是尽量减少 RNA酶
的污染 ,所有提取 RNA所用到的器材和器皿都要进
行 RNase清除处理。具体方法参照《分子克隆实验
指南 》[ 8 ]。
113　试剂
RNA提取液 Trizol Reagent和 015～10 kb RNA
Ladder购自 Invitrogen公司。酵母菌破壁酶 Lyticase
购自天根生物公司。100 m l 011 M 磷酸钠缓冲液
(pH714) : 7714 m l 011 mol/L Na2 HPO4 , 2216 m l 011
mol/L NaH2 PO4。山梨醇缓冲液 :用 011 M 磷酸钠
缓冲液 (pH714)配制 112 M山梨醇。其它试剂包括
DEPC2H2 O、6 ×甲醛凝胶电泳加样缓冲液、10 ×
MOPS(32N2吗啡啉丙磺酸 )电泳缓冲液及 75%乙醇
的配制 ,参照《RNA Methodologies》[ 9 ]。甘油、氯仿、
异丙醇、甲醛和乙醇 ,均达到分析纯 AR标准 ,这些
试剂专用于 RNA提取。
114　RNA的提取
11411　酿酒酵母菌细胞壁的破碎 　解破壁法 :取对
数生长期的酿酒酵母菌 , 10 000 r/m in离心 20 s,弃
尽上清 ;向沉淀的酵母细胞中加入 300μl山梨醇缓
冲液和 50 U Lyticase,充分混匀 ,并在摇床上 220 r/
m in 30℃处理 1 h, 4 000 r/m in离心 10 m in,弃上清 ,
收集沉淀。液氮研磨破壁法 :收集对数生长期的酿
酒酵母细胞于 115 m l离心管中 , 10 000 r/m in, 30 s。
将培养基去除干净 ,每管加入 100μl DEPC水 ,混
匀 ,集中到 1个离心管中 ,将酵母菌的悬浮液转移到
研钵中 ,加液氮充分研磨。
11412　斑马鱼和小白鼠组织的预处理 小白鼠用
断颈法处死 ,取其肌肉组织 ;斑马鱼取其尾鳍部
分 ,将取好的组织 ( 50～100 mg)放到液氮中速冻
后研磨。
11413　用 Trizol Reagent提取总 RNA 将进行预处
理的酿酒酵母菌、斑马鱼和小白鼠的样品加入到盛
有 1 m l Trizol Reagent的离心管中 ,室温放置 5 m in,
使其充分裂解。按 200μl氯仿 /1 m l Trizol的比例
加入氯仿 ,剧烈振荡 15 s,室温放置 3 m in。4℃, 12
000 r/m in,离心 15 m in。取上层水相至另一离心管
中 ,按 500μl异丙醇 / 1 m l Trizol的比例加入异丙
醇 ,轻轻颠倒混匀 ,室温放置 8 m in。4℃, 12 000 r/
m in,离心 10 m in。弃上清 ,加预冷的 75%乙醇 1
m l,清洗沉淀。4℃, 8 000 r/m in,离心 5 m in。弃上
清 ,自然干燥 2 m in左右 ,待 RNA沉淀变成透明状
时 ,加适量的 DEPC2H2 O溶解。
115　RNA的浓度测定和纯度鉴定
取 2μl RNA样品 ,用 DEPC2H2O稀释至 70μl,
用上海尤尼柯 UV24802H紫外可见分光光度计测
A230值、A260值、A260 /A280值和 A260 /A230比值。以 A260
值计算其浓度。
总 RNA浓度 (μg/m l) = A260 ×稀释倍数 ×40
μg/m l
以 A260 /A280比值表示其纯度 ,比值在 119～211
之间 ,认为 RNA 的纯度较好 ;比值大于 212,表明
RNA已经降解 ;比值低于 118,则说明 RNA样品有
蛋白质或酚的污染。A260 /A230作为参考值 ,该值小
于 210,则表明裂解液中有异硫氰酸胍和β2巯基乙
醇的残留 [ 9 ]。
116　RNA完整性鉴定
通过 1%甲醛琼脂糖变性胶电泳进行 RNA完
整性分析。制胶、总 RNA 样品处理过程及电泳条
件 ,均参照《RNA Methodologies》[ 9 ]。RNA Ladder的
上样量为 1μl,其它每个泳道所加总 RNA量为 113
μg。电泳结束后将凝胶放入紫外凝胶成像系统中
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
观察。一般可以看到两条带 ,为方便起见 ,本试验将
分子量较大的条带称为 RNA大片段 ,分子量较小的
称为 RNA小片段。如果条带清晰 , RNA大片段的
量约为 RNA小片段的两倍 ,加样孔无发亮现象 ,且
总 RNA 在变性胶上均未出现拖尾、扩散等降解现
象 ,说明提取的总 RNA质量较高。
117　RNA大、小片段分子量的确定
用 Gene Tools软件进行凝胶分析 ,建立分子量
标准曲线 ,同时确定相关分子量的大小。
118　沉降系数的测定
用 Beckman Coulter公司 XL 2Ⅰ型分析超速离
心机测定沉降系数。样品用 150 mM KCl(经 0122
μm的微孔膜过滤灭菌处理 )稀释成 34μg /m l,转
速 35 000 r /m in, 20℃,每隔 1 m in照 1次相 ,离心
5 h。
2　结果与分析
211　总 RNA的产率与纯度
酿酒酵母菌 1总 RNA 的 A260 /A280不到 118,说
明其中有蛋白或酚的污染 ,而斑马鱼、小白鼠和酿酒
酵母菌 2的 A260 /A280值均为 118～211,表明所得的
RNA较纯。结果见表 1。
表 1 总 RNA的紫外分光光度计检测结果
样品 A230nm A260nm A280nm A260 /A230 A260 /A280
RNA浓度
(μg/m l)
斑马鱼 0. 149 0. 225 0. 121 1. 51 1. 86 315. 0
小白鼠 0. 217 0. 487 0. 269 2. 24 1. 81 681. 8
酿酒
酵母菌 1 0. 319 0. 581 0. 329 1. 82 1. 77 813. 4
酿酒酵
母菌 2 0. 585 1. 243 0. 618 2. 12 2. 01 1740. 2
注 :酿酒酵母菌 1用酶解破壁法提取的酿酒酵母菌总 RNA,
酿酒酵母菌 2用液氮研磨破壁法提取的酿酒酵母菌总 RNA
212　甲醛琼脂糖变性胶电泳检测 RNA的完整性
用变性胶检测 RNA的质量 ,结果斑马鱼、小白
鼠和酵母菌总 RNA条带清晰 , RNA大片段的亮度
约是小片段的 2倍 ,几乎没有降解。点样孔及其附
近也未发现有 DNA的污染 ,这说明 RNA质量较好。
结果见图 1。
图 1　总 RNA的 1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳图谱
213　分子量标准曲线的建立及 RNA大、小片段分
子量的测定
根据 RNA分子在凝胶中的电泳迁移率与分子
量的对数呈负相关 [ 10 ] ,利用 RNA Ladder各个片段
的分子量做分子量标准曲线 (图 2)。以 RNA Lad2
der分子量为参考标志 ,计算得到斑马鱼、小白鼠和
酵母菌的 RNA大片段和小片段的分子量。结果如
表 2所示。由于 1 kb单链 RNA≈ 314 ×105道尔顿 ,
因此酿酒酵母菌 RNA大片段和小片段的分子量分
别又可折算为 1119 ×106和 0161 ×106。
图 2　分子量标准曲线
表 2　RNA大片段和小片段的分子量
分子量 ( kb) 斑马鱼 小白鼠 酿酒酵母菌 1 酿酒酵母菌 2
RNA大片段 4. 2 4. 7 3. 5 3. 5
RNA小片段 1. 9 1. 9 1. 8 1. 8
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2009年第 12期 牟岱英等 :酿酒酵母菌核糖体 RNA沉降系数的初步研究
214　沉降系数的测定
离心后 ,用 Sedimentation Analysis软件对所得
到的数据和图像进行综合分析 ,分析结果表明酿酒
酵母菌 RNA 大片段和小片段的沉降系数分别为
2417S和 1811S,结果见图 3。据 Sp irin关系式 ,分子
量为 1 550 ×S211 [ 11 ] ,计算得出酵母菌 RNA大、小片
段的分子量分别约为 1126 ×106和 0167 ×106。
图 3 沉降系数的测定
3　讨论
311　酵母细胞破壁法的比较
酿酒酵母菌是具有细胞壁的真菌 ,由于其胞壁
含有几丁质、葡聚糖等多种成分 ,质地较坚硬 ,不易
将其充分破壁 ,因此分离提取其 RNA较为困难。常
用的酵母菌破壁方法有酶解法 [ 12 ]和玻璃珠法 [ 12 ] ,
还有用得较少的液氮研磨法 [ 13 ]。本试验用液氮研
磨法和酶解法两种方法裂解酵母菌的细胞壁后 ,用
Trizol Reagent提取酵母菌总 RNA。与酶解法比较 ,
液氮研磨法不但成本低 ,所用时间少 (约 1 h) ,而且
提取的总 RNA产率和质量都很高。试验证明 ,液氮
研磨破壁法结合 Trizol Reagent是一种较好的提取
酵母菌 RNA的方法 ,值得推广应用。
312　RNA沉降系数的测定
沉降系数的测定有两种方法。一种是利用线
性 —对数蔗糖密度梯度离心法 ,原理是物质在一定
浓度梯度的蔗糖溶液中离心时 ,其所在深度的对数
与其沉降系数的对数成线性关系 [ 14 ] ,但是因为蔗糖
密度梯度的制备费时且步骤繁琐 ,此方法应用较少。
另外一种是利用分析超速离心机测定沉降系数 ,离
心机装有的光学系统通过物质对紫外的吸收或折射
率的不同对沉降物进行监视 ,获得一系列的样品离
心图 ,根据沉降图可以作样品所含组分的定性分析。
与前者相比 ,该方法既简化了试验过程 ,又提高了准
确性。本试验用 Beckman Coulter公司 XL2Ⅰ型分析
超速离心机 , RNA 测沉降系数时用的是 KCl溶
液 [ 15 ] ,最后所测得的沉降系数为 2417S和 1811S,结
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果跟“25S”和“18S”这一说法接近。
313　RNA大、小片段的分子量
通过电泳图可以发现 ,斑马鱼和小白鼠的
RNA小片段分子量大小相近 ,酵母菌的略小一点 ,
但相差不大。相比之下 ,三者的 RNA大片段分子
量差异较大 ,最大的是小白鼠 ,其次是斑马鱼 ,酵
母菌的最小。
用 Gene Tools软件进行凝胶分析 ,得到斑马鱼
RNA大、小片段的分子量约为 412 kb和 119 kb,小
白鼠的约为 417 kb和 119 kb,酵母菌的约为 315 kb
和 118 kb,所得到的数据与电泳图观察到的结果相
一致。这种结果在一定程度上说明 ,大多数真核生
物间 RNA小片段分子量差异较小 ,而 RNA大片段
则差异较大 ,并且对于动物来说 ,动物越高等 ,其
RNA大片段分子量越大。这与 Loening[ 16 ]的发现相
一致。
试验中用两种方法计算了酿酒酵母菌 RNA大、
小片段的分子量 ,一种是根据 RNA分子在凝胶中的
电泳迁移率与分子量的对数呈负相关 ,得到的分
子量分别约为 1119 ×106和 0161 ×106 ;另外一种
是根据沉降系数与分子量的关系式 ,得到的分子
量分别约为 1126 ×106 和 0167 ×106。而 Loe2
ning[ 16 ]根据 RNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与
分子量的对数呈负相关 ,利用 E1 coli RNA分子作
为分子量标准 ,得到酿酒酵母菌 RNA大、小片段
的分子量分别约为 1130 ×106和 0172 ×106。由于
分子量标准及计算方法的不同 ,结果存在一定差
异 ,需要进一步试验研究 ,从而确定计算 RNA分
子量更为准确的方法。
试验结果进一步说明了真核生物 rRNA种类的
多样性 ,之前人们统称真核生物 rRNA都为 28S和
18S,现在看来该说法存在较大的局限性 ,应该予以
修正 ,需寻找一个更合适的方法来命名真核生物的
两个较大 rRNA。
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