全 文 ：中心复合设计法利用多项式，近似地把交互因素与试
验结果的关系函数化，从而得到整个区域上因素的最佳组
合和最优响应值［11-13］。选择的三种影响因素为丹参酮ⅡA
与鱼精蛋白质量比 (X1)、药物在乙醇中质量浓度 (g /mL，
X2)、乙醇与水体积比 (X3) ，均是在单因素考察的基础上
所确立的，其影响水平主要取决于制备过程中体系药物的
浓度、药物的成核速度以及载体鱼精蛋白的包裹能力，由
于影响因素 X1 和 X3 直接决定药物的终浓度和终体积，所
以具有更显著的影响意义。本实验中较优处方的实测值与
模型预测值接近，说明该试验因素选择的中心点符合试验
设计要求，所选取的因素为影响纳米粒制剂的主要因素，尽
管失拟项具有显著性差异，模型拟合效果稍差，但模型中各
因素的影响均较显著，而影响水平不显著，考虑到该优化水
平是基于单因素考察的结果而设定的，综合分析各影响因
素，其结果基本可信［14-15］。综上所述，三种因素对纳米粒的
包封率均有显著影响，并且具有交互作用，说明在处方和工
艺筛选上应用中心复合设计法具有良好的应用价值。
参考文献:
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广金钱草总黄酮成分不同提取方法的比较
罗 兰1， 张素中1* ， 黄月纯2， 卢小燕1， 黄燕媚1， 邵华宇1
(1． 中山大学新华学院，广东 广州 510520;2． 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405)
收稿日期:2014-07-08
基金项目:广东省科技计划项目 (2009B060700012)
作者简介:罗 兰 (1984—)，女，硕士，工程师，从事药物质量分析。Tel: (020)87065055，E-mail:zirolland@ 126． com
* 通信作者:张素中 (1969—) ，女，硕士，副教授，从事中药质量标准与指纹图谱研究。Tel: (020)87065055，E-mail:Zhangsz620
@ 163． com
摘要:目的 比较不同方法提取广金钱草中总黄酮成分的效果。方法 以总黄酮提取率及 HPLC 指纹图谱评价水提
法、醇提法、酶解法和半仿生法提取广金钱草的效果，紫外分光光度法测定总黄酮含有量，HPLC指纹图谱共有模式
评价各提取液中黄酮类共有成分的变化。结果 酶解法与醇提法的总黄酮得率都较高，其中前者对广金钱草的特征成
分夏佛塔苷的提取效果更好，而水提法与半仿生法的提取效果较差，尤以后者为甚。结论 4 种提取方法的效果依次
为酶解法 ＞醇提法 ＞水提法 ＞半仿生法。
关键词:广金钱草;总黄酮;水提法;醇提法;酶解法;半仿生法
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2015)11-2537-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 11. 047
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November 2015
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广金钱草为豆科植物广金钱草 Desmodium styracifolium
(Osb．)Merr． 的干燥地上部分，具有利湿退黄、利尿通淋
的功效，主治黄疸尿赤、热淋、石淋、小便涩痛、水肿尿
少［1］，主要分布于广东、广西、云南、四川、福建等地，
生于山坡、草地、土坎或灌木丛中，是两广地区大宗栽培
的药材。目前，已经有多种提取广金钱草总黄酮成分的方
法［2-6］，其中水提法和醇提法最常用［7-11］，但由于存在细胞
壁，故提取过程不完全，而酶解法和半仿生法都能破坏细
胞壁，提高有效成分的提取率，具有很大的应用价
值［12-16］，但至今仍鲜有相关的研究报道［17］。本实验分别采
用水提法、醇提法、酶解法和半仿生法来提取广金钱草总
黄酮成分，然后通过紫外分光光度法和高效液相色谱法进
行检测，从而选出最优的方法，为广金钱草制剂的生产以
及相关工艺的研究提供实验基础和参考。
1 材料与仪器
1. 1 材料 广金钱草 (清平市场和药店，共 10 批，批号
分 别 为 100311、 100517、 101027、 100621、 100328、
100910、100705、100612、100726、101008，产地广西)，
经中山大学新华学院张素中副教授鉴定为豆科植物广金钱
草 Desmodium styracifolium (Osb．)Merr． 的干燥地上部分。
1. 2 试剂 芦丁对照品 (纯度≥98%，中国药品生物制品
检定所，批号 10080-200707);纤维素酶 (酶活力 20 000
U /g，北京宁馨儿生物科技开发有限公司)。所用试剂均为
分析纯。
1. 3 仪器 UV-1102 型紫外分光光度计 (上海天美科学仪
器有限公司);CJS80 型高效粗粉机 (江阴市优协机械制造
有限公司) ;电热恒温水浴锅 (上海福玛实验设备有限公
司) ;FA2004N型电子天平 (上海精密科学仪器有限公
司);水浴恒温振荡器 (金坛市宏华仪器厂) ;Agilent 1200
HPLC色谱仪，包括四元梯度泵、柱温箱、二级管阵列检
测器、紫外检测器、Chemstation 工作站 (美国安捷伦科技
公司)。
2 实验方法与结果
2. 1 不同提取方法提取液的制备
2. 1. 1 水提法提取液的制备 称取干燥广金钱草粗粉 (过
20 目筛)10 g，加水 100 mL，浸泡 30 min，煮沸后文火慢
煎 40 min，趁热用 4 层纱布滤过，药渣加水 100 mL，煮沸
后再慢煎 30 min，趁热滤过，合并两次煎液，浓缩到 20
mL，50%甲醇溶解并定容至 50 mL，即得。
2. 1. 2 醇提法提取液的制备 称取干燥广金钱草粗粉 (过
20 目筛)10 g，加 65%乙醇 100 mL，回流两次，第一次 2
h，第二次 1. 5 h，合并两次提取液，浓缩到 20 mL，50%
甲醇溶解并定容至 50 mL，即得。
2. 1. 3 酶解法提取液的制备 称取干燥广金钱草粗粉 (过
20 目筛)10 g，加 10 倍量水混匀，再加入纤维素酶 0. 06
g，酶解 1 h (温度 50 ℃、pH 为 6)，然后用相对于粗粉 6
倍量的 80%乙醇溶液提取 1 h，冷却滤过，药渣加 5 倍量
60%乙醇回流 30 min，冷却滤过，弃去药渣，合并提取液，
浓缩到 20 mL，50%甲醇溶解并定容至 50 mL，即得。
2. 1. 4 半仿生法提取液的制备 称取干燥广金钱草粗粉
(过 20 目筛)10 g，选择 pH 为 2. 2 的磷酸氢二钠缓冲液
100 mL作为浸取剂，模拟胃肠道 pH，40 ℃下回流提取 3
次，每次 2 h，合并提取液，浓缩到 20 mL，50%甲醇溶解
并定容至 50 mL，即得。
2. 2 不同提取工艺的提取率比较分析
2. 2. 1 对照品溶液的制备 精密称取在 120 ℃下干燥至恒
重的芦丁标准品 20. 60 mg，置于 50 mL 量瓶中，加入 60%
乙醇适量，置水浴上微热溶解，放冷后以 60%乙醇稀释至
刻度，摇匀。再精密吸取 25 mL，置于 50 mL量瓶中，加水
稀释至刻度，摇匀，即得每 1 mL含芦丁 0. 206 mg的对照溶
液。
2. 2. 2 测定波长的选择 精密量取对照品溶液 3 mL，置于
25 mL量瓶中，加 30%乙醇至 6. 0 mL，再加 5%亚硝酸钠溶
液 1 mL，摇匀，放置 6 min，加 10%硝酸铝溶液 1 mL，摇
匀，放置 6 min。然后，加氢氧化钠试液 10 mL，再加 30%
乙醇至刻度，摇匀，放置 15 min，按紫外分光光度法进行扫
描。结果显示，在 508 nm处有最大吸收，故确定检测波长
为 508 nm。
2. 2. 3 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液 1. 0、2. 0、
3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0 mL，置于 25 mL 量瓶中，加
30%乙醇至 6. 0 mL，再加 5%亚硝酸钠溶液 1 mL，摇匀，
放置 6 min，再加 10%硝酸铝溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min。
然后，加氢氧化钠试液 10 mL，再加 30%乙醇至刻度，摇
匀，放置 15 min，以相应试剂为空白，在 508 nm 波长处测
定吸光度，以质量浓度 (C)为纵坐标 (y)，吸光度 (A)
为横坐标 (x) ，绘制标准曲线，得回归方程 y = 8. 771 9x +
0. 013，r2 = 0. 999 8。
2. 2. 4 供试品的制备 分别取“2. 1”项下 4 种提取液适
量，过滤，吸取续滤液 15 mL，适当浓缩，50%甲醇定容
至 5 mL，即得。
2. 2. 5 总黄酮提取率的测定 取各供试品适量，过滤，取
续滤液 4. 0 mL，置于 10 mL量瓶中，用 60%乙醇稀释至刻
度。再精密量取稀释液 1 mL，置于 25 mL 量瓶中，加 30%
乙醇至 6. 0 mL，再加 5%亚硝酸钠溶液 1 mL，摇匀，放置 6
min，加 10%硝酸铝溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min。然后，
加氢氧化钠试液 10 mL，再加 30%乙醇至刻度，摇匀，放置
15 min，以相应试剂为空白，在 508 nm波长处测定吸光度，
利用标准曲线计算样品的总黄酮提取率，计算公式为
总黄酮得率 = C × D × VW × 1000 × 100%
注:C为标准曲线上的黄酮含有量;D为稀释倍数;V为样
液体积;W为广金钱草粗粉质量
2. 2. 6 实验结果与分析 各批次总黄酮提取率见表 1，然
后以酶法提取为基准，比较相对提取率，见表 2。由表可
知，酶解法与醇提法的总黄酮提取率较高，并且其差异不
明显，而半仿生与水提法则较低，也无明显差异，并且均
只相当于酶解法与醇提法的 75%左右。
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表 1 4 种提取方法的总黄酮提取率 (x ± s)
批次 水提法 /% 醇提法 /% 酶解法 /% 半仿生法 /%
1 0. 346 ± 0. 008 0. 408 ± 0. 008 0. 438 ± 0. 008 0. 357 ± 0. 009
2 0. 343 ± 0. 005 0. 466 ± 0. 009 0. 563 ± 0. 009 0. 413 ± 0. 011
3 0. 375 ± 0. 007 0. 352 ± 0. 007 0. 470 ± 0. 011 0. 243 ± 0. 011
4 0. 345 ± 0. 008 0. 330 ± 0. 007 0. 441 ± 0. 009 0. 224 ± 0. 009
5 0. 386 ± 0. 009 0. 398 ± 0. 005 0. 483 ± 0. 004 0. 292 ± 0. 007
6 0. 333 ± 0. 010 0. 476 ± 0. 005 0. 447 ± 0. 005 0. 380 ± 0. 009
7 0. 457 ± 0. 006 0. 550 ± 0. 009 0. 538 ± 0. 007 0. 443 ± 0. 008
8 0. 452 ± 0. 008 0. 584 ± 0. 003 0. 542 ± 0. 002 0. 485 ± 0. 004
9 0. 377 ± 0. 005 0. 473 ± 0. 010 0. 475 ± 0. 005 0. 417 ± 0. 003
10 0. 382 ± 0. 003 0. 460 ± 0. 008 0. 477 ± 0. 009 0. 364 ± 0. 009
表 2 4 种提取方法的总黄酮相对提取率
批次 水提法 醇提法 酶解法 半仿生法
1 0. 789 0. 933 1 0. 817
2 0. 609 0. 828 1 0. 733
3 0. 798 0. 749 1 0. 517
4 0. 783 0. 749 1 0. 508
5 0. 800 0. 823 1 0. 605
6 0. 745 1. 065 1 0. 798
7 0. 851 1. 023 1 0. 824
8 0. 835 1. 079 1 0. 896
9 0. 794 0. 996 1 0. 877
10 0. 801 0. 965 1 0. 763
均值 0. 781 0. 921 1 0. 734
ＲSD /% 8. 54 13. 60 0 19. 35
3 广金钱草工艺的指纹图谱评价
3. 1 色谱条件 Zorbax SB-Aq 色谱柱 (250 mm × 4. 6 mm，
5 μm) ;流动相为乙腈 － 0. 2% 磷酸水溶液，梯度洗脱
(0 ～ 30 min，12%→14%乙腈;30 ～ 40 min，14%→16%乙
腈;40 ～ 55 min，16%→25%乙腈);检测波长为 270 nm;
柱温为 40 ℃;体积流量为 1 mL /min。
3. 2 供试品溶液的制备 同“2. 2. 4”项。
3. 3 方法学的考察
3. 3. 1 精密度试验 取供试品溶液 10 μL，连续进样 6 次。
结果，11 个共有峰的 ＲSD 值均小于 3. 0%，表明仪器精密
度良好。
3. 3. 2 稳定性试验 取供试品溶液 10 μL，分别在 0、
2. 5、5、7. 5、10、24 h 进样。结果，11 个共有峰的 ＲSD
值均小于 3. 0%，表明供试品溶液在 24 h内稳定性较好。
3. 3. 3 重复性试验 取同一批样品 6 份，按“3. 2”项下
方法制备供试品溶液，进样分析。结果，11 个共有峰的
ＲSD值均小于 3. 0%，表明该方法重复性良好。
3. 4 指纹图谱的建立与分析
3. 4. 1 样品检测 精密吸取各提取方法所得的供试品溶
液 10 μL，进样分析，指纹图谱相似度软件生成各提取法
的共有模式，见图 1。
3. 4. 2 各提取工艺的指纹图谱分析 各提取样品中均检出
11 个主要黄酮类指纹峰。为了对其相对提取率进行量化分
图 1 4 种提取方法的共有模式
析，分别对各供试液的实际峰面积按生药质量浓度 0. 1
g /mL进行折算，再以广金钱草酶提法试液的特征峰面积为
100%计，计算各提取工艺样品供试液的峰面积相对转移
率，结果见表 3。
表 3 各提取工艺样品供试液的峰面积相对转移率 (x ± s)
峰号 水提法 /% 醇提法 /% 酶解法 /% 半仿生法 /%
1 74. 12 ± 11. 78 87. 24 ± 24. 08 100 64. 98 ± 20. 32
2 63. 44 ± 15. 86 71. 59 ± 17. 06 100 57. 00 ± 13. 08
3 70. 37 ± 16. 38 80. 58 ± 19. 46 100 63. 04 ± 11. 50
4 58. 99 ± 9. 86 77. 41 ± 23. 01 100 55. 00 ± 14. 91
5 70. 12 ± 19. 13 86. 45 ± 22. 01 100 57. 34 ± 15. 04
6 37. 86 ± 6. 71 80. 15 ± 20. 69 100 28. 54 ± 9. 79
7 47. 01 ± 10. 85 89. 47 ± 26. 29 100 34. 25 ± 9. 31
8 40. 72 ± 5. 75 82. 54 ± 19. 11 100 42. 87 ± 10. 12
9 66. 33 ± 10. 81 79. 95 ± 25. 56 100 67. 14 ± 16. 52
10 76. 96 ± 8. 74 88. 18 ± 24. 00 100 78. 01 ± 18. 85
11 40. 70 ± 6. 22 99. 48 ± 14. 96 100 48. 35 ± 10. 35
3. 5 同一批样品不同提取方法的指纹图谱 由图 2 可知，
在广金钱草指纹图谱的 11 个特征峰中，4 种提取方法对提
取效果都有不同程度的影响。以最强峰夏佛塔苷 (5 号)
而言，其占总峰面积的比例达 25. 15%，酶解法效果最好;
次强峰 (9 号)及其余各峰占总峰面积的比例达 18. 41%，
醇提法效果比较好。可见，酶解法与醇提法的总黄酮提取
率相当，但它们对 HPLC 指纹图谱中各成分提取效果的影
响还是有一定差异的，而半仿生法和水提法对 11 个特征峰
的提取效果均不理想，尤以水提法最差。
图 2 同一批样品 4 种提取方法的重叠图
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4 讨论
酶解法与醇提法效果的差异不大，两者都用乙醇进行
提取，但前者用到了纤维素酶类来破坏广金钱草的细胞壁，
从而使提取率普遍提高。而半仿生法使用磷酸氢二钠缓冲
液，由于总黄酮成分的溶解性在酸性物质中增大，故该方
法的提取率略高于水提法。
根据广金钱草总黄酮的测定结果来进行指纹图谱的测
定，发现 4 种方法的保留时间相当，但峰面积以及相对峰
面积有明显差异。总体来说，酶解法和醇提法的峰面积比
较大，而且相近，而水提法和半仿生则比较小，两者相差
也不大。
综合总黄酮提取率及广金钱草指纹图谱特征峰的提取
效果，可知 4 种提取方法的效果依次为酶解法 ＞醇提法 ＞
水提法 ＞半仿生法。
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2015 年 11 月
第 37 卷 第 11 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
November 2015
Vol． 37 No． 11