全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
19去甲类固醇激素检测方法研究进展
姜金庆1, 2 张海棠 1 王自良 1 王建华 2
( 1河南科技学院动物科学学院,新乡 453003; 2西北农林科技大学动物医学院,杨凌 712100 )
摘 要: 综述了 19去甲类固醇激素检测的筛选法、定量法和确证法,探讨了多残留同时检测试纸条和蛋白质芯片等最
新技术。
关键词: 筛选法 定量法 确证法 试纸条 蛋白质芯片
Detection Progress for 19Norsteroids
Jiang J inqing
1, 2
ZhangH a itang
1 W ang Z iliang1 W ang Jianhua2
(
1
College of Animal Science,H enan Institute of Science and T echno logy, X inx iang 453003;
2
College of VeterinaryM edicine, N orthwestA&F University, Yangling 712100)
Abstrac:t The screen ing assay s, quantitative ana ly sis and identification m ethods for 19Norste ro ids detec tion w ere rev iew ed, and
automa ted mu ltiana ly te de tection strip assay, prote in chip techno logy and other la test techniques we re pred ic ted.
Key words: Screen ing assays Quantita tive ana ly sis Identification m ethods Test strip P ro tein ch ip
收稿日期: 20091216
基金项目: 十一五 国家科技支撑计划重大项目 ( 2006BAK02A21 /1)
作者简介:姜金庆,男,在读博士,研究方向:分子免疫学和药物残留检测; Em ai:l jjq5678@ 126. com
通讯作者:王自良,男,博士,教授,主要从事动物性食品安全生物技术研究
19去甲类固醇是甾环结构上脱去第 19位碳
原子而形成的内源性和外源性蛋白同化激素, 主
要用来治疗人的消瘦性疾病、骨质疏松症、蛋白
质缺陷型疾病和烧伤等。它们也能增加瘦肉的
增长, 减少脂肪贮积, 进而提高饲料转化效率和
瘦肉生产率,所以 19世纪 50年代以后在食源性
动物的生产中曾被大量使用 [ 1 ]。运动员服用后,
可增加肌肉力量, 结合适度的运动和饮食, 可提
高比赛时体内雄性激素荷尔蒙的含量, 进而提高
运动成绩 [ 2]。但由于它们具有很强的毒副作用,
因此从 1986年开始, 欧盟委员会就禁止运用生
长促进类药物育肥家畜 , 禁止在肉食性动物中以
促进生长为目的来使用自然或人工合成的激素,
以保护消费者避免因食用激素的残留物或其代
谢物而引起的发育问题、神经问题、遗传毒性和
癌症问题 [ 3 ]。中国的家畜育肥过程中也曾被非
法大量使用, 因此中国政府从 2002年起就禁止
它们在生产中使用 [ 4]。我国国家食品药品监督
管理局在 2007年兴奋剂目录公告中对 19去甲
睾酮及多种蛋白同化制剂的代谢产物 19去甲雄
酮 ( 19NA )的检测限是尿液中浓度检测上限或比
值上限是 2 ng /mL。就此类蛋白同化激素的检测
技术进行综述和展望, 为探索新型、高效和实用
的检测方法提供参考。
1 理化分析方法
依据去甲类固醇激素的物理和化学性质, 如熔
点、沸点、不同溶剂中的溶解度、分子量大小、分子基
团衍生物、共轭形式等, 将其进行定性和定量分析的
方法。主要包括高效液相色谱法 ( HPLC ), 薄层层
析法 ( TLC) ,毛细管电泳法 ( CE ), 气相色谱 质谱法
( GCMS),液相色谱 质谱法 ( LCMS)等方法。
11 气相色谱法 ( GC)
1965年, B eckett等第一次运用高灵敏度的气相
色谱仪 ( gas chromatography, GC )对运动员滥用药物
进行检测。1972年墨尼黑奥运会时 Manfred Donike
使用气相层析仪结合对氮原子具有专一性的碱火焰
电离检测器 ( a lkali flame ion izat ion detector)检测兴
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
奋剂和鸦片类药物 [ 5]。 1991年, B agnati等 [ 6]建立
的气相色谱条件可检测 19去甲睾酮、睾酮、群勃龙
等蛋白同化激素。用免疫亲和柱净化测尿液, 羧甲
氧基胺、五氟甲溴和 N, O双 (三甲基硅 )三氟乙酰
衍生。固定相为 CP S il 5 CB毛细管柱 ( 25m ) ,流动
相为氦气,负离子化学电离, 检测限达到 0. 02- 0.
06 g /kg,回收率为 35% - 87% [ 6]。气相色谱具有
高效、快速、高灵敏度、样品用量小等独特优点,曾广
泛应用于体育运动会的兴奋剂检测。
12 高效液相色谱法 (HPLC )
19世纪 80年代, 高效能液相层析法 ( h igh per
fo rmance liqu id chromatog raphy, HPLC )开始应用于
去甲类固醇激素的分析和检测。 1989年, Haasnoot
等 [ 7]用高效液相色谱法检测牛组织和尿液当中的
19去甲睾酮及其代谢物 19去甲睾酮。组织样
加 Tris缓冲液后用枯草杆菌肽酶 A水解,加 Amber
lite XAD2,尿、肝脏和肾脏用 葡糖苷酸酶 /芳基硫
酸酯水解, 采用柱切换技术, 用免疫亲和色谱柱净
化, Chrompack C18柱痕量富集。固定相使用 Chrom
spherC18柱 ( 5 m ),流动相为水 /乙腈 ( 65+ 35), 检
测限达 0. 05 g /kg, 回收率为 44% - 82% [ 7]。2008
年 4月,汤艳荣等 [ 8]介绍了一种以小颗粒填料 (粒径
小于 2 m )和超高压系统 (压力大于 105 kPa)为特
征的超高效液相色谱 ( u ltraperform ance liqu id chro
matography, UPLC )进行抗生素和激素检测的方法,
并对 UPLC和 HPLC进行了比较。但此检测方法会
产生交叉反应及假阳性,无法达到检测要求,因此主
要用作筛选和定性。
1. 3 薄层层析法 ( TLC)
薄层层析是将吸附剂或者支持剂 (有时加入固
化剂 )均匀地铺在一块玻璃上,形成薄层, 把欲分离
的样品点在薄层上,然后用适宜的溶剂展开,使混合
物得以分离的方法。 1989年, van Look等 [ 9]用层方
法检测牛脂肪中 30余种激素。将样品用正已烷提
取,溶液分配,固相萃取净化。固定相用硅胶 60,流
动相为氯仿 /丙酮和环已胺 /乙酸乙酯 /乙醇,双相层
析展开,检测限达 1- 10 g /kg。薄层层析是一种
微量、快速的层析方法,可用于纯物质的鉴定, 混合
物的分离、提纯及含量的测定, 非常适合残留物检测
的筛选。
1. 4 毛细管电泳法 ( CE)
1981年, Jorgenson和 Lukacs奠定了毛细管电
泳法理论,它是在内部充满缓冲液,两端施加高压的
石英管中, 使荷电粒子在电场作用下发生迁移。
2008年, Q i等 [ 10]用免疫亲和柱收集尿液中的 19去
甲睾酮,睾酮和甲睾酮, 然后用毛细管电泳法进行分
离检测,添加回收率可达 88% - 94%。
1. 5 气相色谱 质谱法 ( GCMS)
1983年在委瑞內拉首都卡拉卡斯举行的泛美
运动会,来自德国的 Don ike[ 11]及其实验室团队开始
利用气相层析质谱仪进行同化性类固醇的检测。
1991年, Bagnati和 Fane lli[ 12]用 GCMS方法检测猪
尿液和猪肉当中 19去甲睾酮、睾酮和群勃龙。将
标准品用羧甲基羟胺肟化反应, 然后用五氟苯甲基
溴化物进行衍生化反应, 并制作免疫原获取针对药
物的抗体。用此抗体制作免疫亲和柱捕获样品中的
检测物,负离子化学轰击法进行 GCMS检测, 检测
限可达 pg以下。 2005年, Seo等 [ 13]用 GCMS法同
时测定肌肉中雌二醇, 睾酮等多种激素。样品用甲
醇水超提,冷冻后过滤脱脂, C18固相萃取,检测限
可达 0. 1- 0. 4 g /kg。随着仪器的改进,更加先进
的离子监控法 ( SIM )和多离子吸附质谱法 ( GC /M S /
M S /M S)也逐渐引入。 1999年, Dehenn in等 [ 14] 用
GC /HRMS方法可以检测到 1 pg /mL。此技术被国
际奥林匹克委员会 ( IOC )所授权的国际反兴奋剂实
验室所采用,可以灵敏地检测到人尿液中 06 ng /mL
的内源性 19NA。 2008年, Yamada等 [ 15] 报道一种
GC /M S /MS方法同时检测马尿中蛋白同化类固醇主
要代谢物的方法。尿液水解后,进行固相柱提取,提
取的残留物用叠氮基三甲基硅烷衍生化,衍生物进
行离子收集,气相色谱串联质谱法检测,获得了它们
的色谱图和产品离子光谱, 目标物的检测限是 5–
50 ng /mL,平均回收率和变异系数分别为 71. 3%–
104. 8%和 1. 1%– 9. 5%。
气象色谱质谱法灵敏度高,定性准确,可以确定
化合物的分子量、分子式, 甚至官能团,适合同时检
测去甲类固醇激素和其代谢物,被用作确认手段。
1. 6 液相色谱 质谱法 ( LCMS)
2000年, K im等 [ 16]建立一种高效液相色谱法串
联质谱法 (HPLC /M S /M S)检测马血浆中 19去甲睾
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2010年第 4期 姜金庆等: 19去甲类固醇激素检测方法研究进展
酮及其酯类的方法, 19去甲睾酮的检测限达到
0. 16 ng /mL,浓度范围为 0. 1- 50 ng /mL。 2007年,
Pozo等 [ 17]用酶水解,液相提取的办法进行了尿液中
34种蛋白同化激素的添加回收实验, 其中有 29种
激素含量检测至 1- 10 ng /mL, 都达到了检测限。
2008年, G race等 [ 18 ]建立一种 LC /M S /M S检测公马
尿液中 19去甲睾酮硫酸盐的方法, 来监控比赛中
是否使用了去甲类固醇激素。
液相色谱质谱法结合了 LC高分离能力和 MS
很强的结构鉴定能力两者的优点, 是复杂混合物分
析的有效手段。与 GCMS相比,液质联用可检测不
易挥发的化合物且不需衍生化,排除了气相色谱离
子束的干扰,以电喷射和气压化学离子法进行离子
软化, 有效提高了检测限, 是去甲类固醇激素进行确
认检测常用的手段之一。
2 免疫学检测方法
理化分析方法花费高,需要专业的技术人员,过
硬的实验条件和昂贵的仪器,操作时,前期准备工作
时间长且需要知道可靠的标准品和已知的化学结
构。而免疫学检测方法建立在抗体对抗原的分子识
别上, 其主要优点是抗原抗体的亲合力高、检测快
速、简单、经济实用、容易操作, 能够实现对生物液体
的小体积检测,是所知的最灵敏的方法之一。主要包
括放射性免疫分析法 ( RIA),酶联免疫检测 ( ELISA ) ,
化学发光免疫检测 ( CLISA ), 免疫层析试纸条, 生物
传感器等方法。
2. 1 放射性免疫分析法 ( RIA)
1976年加拿大蒙特利尔奥运会上, Dugal[ 19 ]实
验室开始使用放射性免疫分析法检测蛋白同化性类
固醇激素。 1989年, M acdouga ll等 [ 20]报道一种 R IA
结合 HPLC法检测斗犬血液中 19NT含量,以确定
其是否注射过苯丙酸诺龙等去甲类固醇激素。将苯
丙酸诺龙 1. 5 mg /kg肌肉注射到一只小猎犬和德
国犬后,进行 7 d的监测。在硅胶板上用二氯乙烷 /
甲醇作流动相,结果表明注射后 1 - 3 d时,可检测
到 20 ng /mL。
RIA的不足之处是使用的放射性化合物会对工
作人员的安全造成威胁,而且假阳性率较高,限制了
它的使用。
2. 2 酶联免疫检测 ( ELISA )
1989年, Degand等 [ 21]建立一种 ELISA方法检
测牛尿中 19去甲睾酮和群勃龙等激素。将标准品
衍生化后与 BSA和 OVA偶联制备免疫原和包被
原, 以 HRP为显色剂, 将标准品BSA免疫兔制备多
抗, 牛尿中 19去甲睾酮和群勃龙的添加回收试验
( IC50值 )可以检测到 8和 11 ng /L。检测方法只需
2. 5 L尿液,检测时间不到 2 h,显示出良好的重复
性和准确性。1991年 van Look等 [ 22]建立一种竞争
性 ELISA检测 19NT的主要代谢物 1719NT。将
17NT肟化反应后偶联 BSA 制备兔抗血清, 使
17NT与 17NTCMOHRP竞争, 以 TMB为底物
进行显色反应。牛尿中空白和添加回收实验检测到
0. 98- 4 000 pg /孔。 2006年, Lu等 [ 23]用 ELISA检
测牛尿中睾酮,甲基睾酮和 19去甲睾酮及其代谢物的
含量,以确定青年母牛是否注射过 19去甲睾酮。通过
棋盘法确定包被原,抗体和二抗浓度,不进行牛尿水解
和提取, 3种激素的检测限分别达到7. 4 2. 9 pg /mL,
26. 6 8. 2 pg /mL和 3. 1 1. 9 pg /mL。
ELISA具有简单, 快速, 检测限低, 重复性好等
优点,这导致其逐渐成为一种替代 ( R IA )的方法。
23 化学发光免疫检测 ( CLISA )
2003年, Roda等 [ 24]报道一种快速、灵敏的 19
去甲睾酮 384孔化学发光酶联免疫分析试验。将
19NT琥珀酸衍生物与 OVA偶联制备兔 19NT的
多克隆抗体,衍生物偶联 HRP作为标记物。抗体在
384孔聚苯乙烯板上固定, 化学发光酶底物 ( Super
S igna lEL ISA Fem to) 3 m in温育后检测 HRP标记的
19NT的活性。运用传统的光电倍增管为基础的微
量滴定板光度计在几分钟内可完成测定,如果使用
灵敏的 CCD微光探测摄像机仅需 1 m in。所建立的
方法完全符合精确度要求 (批内和批间 CV < 10% )
和准确度要求 (平均回收率为 94% - 112% ),尿液基
质中的检测线为 0. 03 ppb ( 1. 1 10- 9mol/L )。化学
发光法降低了检测限,减少了分析时间,试剂体积与
传统的 96孔酶标板相比, 减少了 5倍, 所建立的方
法适合大批量检测尿液样品中的 19去甲睾酮并降
低了费用。
2007年, L i等 [ 25]报道用竞争性的免疫荧光分
析法 ( TRFIA )检测水产动物组织中 19去甲睾酮残
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
留,检测限达到 0. 08 ng /g, 检测结果和 ELISA检测
结果显示出较好的相关性。所建立的 TRFIA方法
检测水产动物组织中残留得到液相色谱串联质谱法
LC /M S /MS)的验证。
2. 4 免疫层析试纸条
2007年, L iu等 [ 26]研制出一种用兔多抗制备的
免疫层析试纸条。在硝酸纤维素薄膜的样品垫上结
合标记有金标颗粒的抗 19NT多克隆抗体, 检测线
上结合包被原 ( 19NTOVA ), 质控线上结合二抗
(羊抗兔 IgG)。所建立的定性检测方法,检测时间
不到 15m in,用肉眼阴性 /阳性判定结果, 检测线可
达 200 ng /mL,非常适合于现场快速检测。用猪尿
进行加标添加回收试验来验证试纸条的灵敏性,并
与 LC /M S /MS确证检测方法进行对比,获得了满意
的效果。
2. 5 生物传感器
生物传感器是传感器技术与免疫分析技术
相结合的方法。 2007年, C onnee ly等 [ 27 ]报道一
种以 EL ISA为基础的免疫免传感器来检测牛尿
中 19去甲睾酮和甲基睾酮。将睾酮 BSA ( 1
800倍稀释 )固定到电极的工作区域, 19去甲睾
酮 25 L从 1 mg /mL开始稀释进行阻断试验, 抗
19去甲睾酮 (浓度 11 600) 25 L混合到一起,
抗兔 IgGHRP 11 000稀释, 底物为 TMB过氧化
氢, 电极上放 10 L混合物。DEK247屏幕打印机
连结的 30个电极可以同时打印, 计算器和第一
层参考电极包含有 50% 的银和 50% 的碳 ; 第二
层参考电极含有 5% 的氯化银, 运行通道以 PVC
为支持, 覆盖上绝缘材料, 只有顶层和底层不覆
盖, 工作电极含有碳粉约 16 mm 2面积。尿液中
19去甲睾酮用 EL ISA检测时, EC50值为 2. 01 ng /
mL, LOD值为 5. 6 pg /mL, 同样条件改用免疫传
感器时, 分别为 253 pg /mL和 47. 8 pg /mL, 最低
检测限为 1 ppb, 线性范围是 0003 - 40 ng /mL,
回归系数是 0. 991 6。免疫传感器所获得的 EC50
值比 EL ISA获得的值大约低 3倍, 而且精确, 准
确和稳定。
这种 SPEs免疫传感器是间接法,可以进行大批
量生产,价格便宜, 不要求复杂的样品前处理, 将来
有可能微型化为手提式器械,在屠宰时现场检测家
畜体内激素水平,并成为广泛监测程序的一部分 [ 27]。
3 展望
3. 1 检测物质和体样的选择
不同的家畜和动物,根据功能和用途不同,应有
重点地分样检测。食源性动物去甲类固醇激素残留
检测时应以检测其代谢物为主,主要检测 19NA, 其
次是 19NE和 17NT。骞马和斗犬等竞技性动物
应以检测 19NT为代表的去甲类固醇激素等原化合
物为主, 检测标准以 2 ng /mL判定阳性较妥,但应充
分考虑家畜性别,是否怀孕, 种公畜和家畜发情期等
因素的影响。1998年, M cEvoy等 [ 28]详细研究了牛
肌肉注射 19去甲睾酮月桂酸酯后血浆, 尿液和胆
汁中存留量和持续时间, 结果表明胆汁存留时间最
长, 且 19NA存留量最大。结合其它代谢研究的结
论, 以为竞技性动物以骞前检测尿液和血液为主,而
对于以促进生长为目的食源性动物应以检测胆汁和
肌肉中含量为主。
3. 2 检测方法
现有的去甲类固醇激素检测方法当中,免疫学
方法作为筛选法, 液相色谱法和气相色谱法等作为
定量法, LCMS和 GCMS等作为确证法得到学者的
公认。随着抗去甲类固醇激素高亲和力和灵敏度单
克隆抗体的获得, 免疫学检测结论与 LCMS和 GC
MS检测结论相关度极大提高, 因此免疫学新技术
将得到广泛应用。
3. 2. 1 改进 LCMS和 GCMS检测的样品处理程
序 传统的去甲类固醇激素样品前处理包括调整样
品的 pH,离子强度和浓度,然后进行固相萃取,液相
萃取,水解 (酵素水解、化学水解 )或化学衍生 (矽
化、乙酰化、烷化 ), 以达到减少基质的干扰,提高检
测限的目的。这种样品前处理程序费时、费力、花费
高, 而用免疫亲和柱进行前处理特异性强, 速度快。
2008年, Q i等 [ 10]用毛细管电泳法检测牛尿中 19去
甲睾酮等激素时,样品前处理就是使用免疫亲和柱。
它是用免疫原免疫兔子获取多克隆抗体,然后将特
异性抗体共价结合到溴化氰活化的琼脂糖凝胶柱
4B上,以获取免疫亲合柱的稳定相,再用甲醇 /水混
合物对目的检测物进行萃取。
3. 2. 2 改进免疫检测试纸条的性能,研制多残留检
测试纸条 2007年, L iu等 [ 26]研制出的兔多抗制备
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2010年第 4期 姜金庆等: 19去甲类固醇激素检测方法研究进展
的免疫层析试纸条检测限只有 200 ng /mL, 而 2007
年我国对雄性蛋白同化激素的主要代谢物 19NA
在运动员尿液中的检测限是 2 ng /mL。1998年 IOC
要求男性运动员检测上限是 2 ng /mL, 而女性为
5 ng /mL
[ 29 ]。对食源性动物激素残留一般参考意大
利对于类固醇激素的检测标准, 即 2 ng /mL[ 30] , 因
此 200 ng /mL检测限的试纸条达不到应用目的。将
来可以用高亲和力和高灵敏度的单克隆抗体制备试
纸条, 提高检测限至 2 ng /mL, 以便于生产使用, 而
且可以研制多残留检测试纸条。
2008年, Zhu等 [ 31]报道一种具有宽广特异性的
单克隆抗体可以同时检测 12种氟喹诺酮药品, 其对
氟哌酸和培氟沙星可以检测到 25 ng /mL, 其它 10
种氟喹诺酮可以检测到 50 ng /mL。鉴于去甲类固
醇激素结构的相似性,且 17去甲睾酮 (NT ) , 19
去甲雄酮 ( 19NA ), 19去甲本胆烷醇酮 ( 19NE )等
19NT的代谢物结构类似,所以研制高亲和力, 宽广
特异性的单克隆抗体同时检测十几种去甲类固醇激
素试纸条,进行食源性动物和运动员尿样的初次阳
性筛选,然后再用 LC /M或 GCMS进行确证具有十
分重要的意义。
多残留检测试纸条的另外一个研究方向是将
NSO细胞与不同种类去甲类固醇免疫鼠脾细胞的
多次融合,制备出能抗多个激素的单克隆抗体。用
此杂交瘤细胞制备的腹水研制出的试纸条, 可以标
记多个激素的检测线,进行多残留同时检测。
3. 2. 3 蛋白芯片技术 蛋白质芯片是一种高通量、
高灵敏度、高特异性且微型化的蛋白质分析技术,它
是继基因芯片后发展起来的一项 21世纪高新技术,
它由蛋白芯片、蛋白芯片识别仪、专用软件 3部分组
成。其原理是将已知的蛋白以预先设计的方式固定
在尼龙膜、玻璃、硅片等载体上,组成密集的分子排
列,当荧光、免疫金等标记物的靶分子与芯片上的探
针分子结合后,通过激光共聚焦扫描或光耦合元件
( CCD )对标记信号的强度进行检测, 从而判断样本
中靶分子的数量以达到一次试验同时检测多种生物
样品的目的。
2009年 3月, K lo th等 [ 32]研制出一种蛋白质芯
片应用于食品中药物残留检测。其化学发光微点阵
平台在进行多道免疫检测时相对独立, 在工作循环
周期中,蛋白质芯片、点喷系统和分析软件能自动化
校样和检测浓度含量。他们第一个试验检测的是青
霉素 G, 在牛奶中加标检测含量达到 1. 1 ng /mL, 并
在一个通道中可重复检测 47次, 检测时间只需
6m in。 2009年 7月,他们用研制的蛋白质芯片检测
鲜牛奶中 13种不同的抗生素。检测原理是间接竞
争化学发光微点阵免疫测定法 ( CLM IA ) ,将蛋白质
芯片建立在氧桥活化的 PEG芯片表面,上面可直接
竞争结合抗生素或其衍生物, 使用蛋白芯片识别仪
可连续检测 50个循环 [ 33]。
末来的蛋白质芯片技术会对生物学、医学、环境
监测、食品检测等将产生巨大的影响, 也必将是 19
去甲类固醇激素检测的研究方向之一。
参 考 文 献
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