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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
人甲状旁腺激素 ( 1234)二联体与人血清
白蛋白融合蛋白的构建及表达
张梅　邬敏辰　金坚
(江南大学医药学院 ,无锡 214122)
　　摘 　要 : 　构建人甲状旁腺激素 (1234)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的表达载体 ,并表达得到该融合蛋白。通过设计
强特异性的引物 ,利用重叠 PCR技术 ,定向定量的拼接得到 hPTH (1234)二联体 2HSA融合蛋白的基因 ;将构建好的融合基因
插入表达载体 pP IC9K,大量扩增重组质粒 ,并用 Sa l I线性化 ,电击转化毕赤酵母 GS115,经组氨酸缺陷和 G418抗性双重筛选
得到阳性转化子 ;挑选阳性转化子进行甲醇诱导表达。测序结果表明得到的重组质粒 pP IC9K2hPTH (1234)二联体 2HSA与目
标设计完全一致 ;基因组 PCR鉴定结果证明成功构建了 hPTH (1234)二联体 2HSA融合基因的毕赤酵母 ( GS115)表达系统 ;
SDS2PAGE电泳表明融合蛋白获得了表达 ,尿微量白蛋白试剂盒测定甲醇诱导表达 3d后融合蛋白的产量为 127 mg/L。
关键词 : 　人甲状旁腺激素 (1234)二联体 　人血清白蛋白 　融合蛋白 　构建及表达
Construction and Expression of Recombinant Fusion
Prote in hPTH ( 1234) a’a 2HSA
Zhang Mei　W u M inchen　J in J ian
( School of M edicine and Pharm aceutics, J iangnan University, W uxi 214122)
　　Abs trac t: 　 It was to Construct exp ression vector of the gene of recombinant fusion p rotein hPTH (1234) a’a 2HSA and obtain the fu2
sion p rotein. Two hPTH (1234) gene with different 5’and 3’ tails were obtained from the p lasm id pP IC9K2PTH (1284) 2HSA by overlap2
p ing PCR technology. Then, the concatenate and HSA was fused by the same technology. The fused gene including HAS gene was
cloned into vector pP IC9K. The p lasm id pP IC9K2hPTH ( 1234) a’a 2HSA was linearized, and transformed into GS115 strain of p ichia
pastoris by electroporation. Then, the recombinant strains were screened by G418 resistance. The PCR results showed that the p lasm id
pP IC9K2hPTH (1234) a’a 2HSA was constructed and transformed into GS115 successfully. Fusion p rotein can exp ress and the p roduction
was 127 mg/L induced by methanol for 3 days.
Key wo rds: 　Concatenate of human parathyroid hormone　Human serum album in　Fusion p rotein　Construction and exp ression
收稿日期 : 2009201212
作者简介 :张梅 (19842) ,女 ,硕士 ,主要从事基因工程制药研究
通讯作者 :邬敏辰 (19622) ,男 ,教授 ,主要从事酶工程研究 ;金坚 (19602) ,男 ,教授 ,主要从事融合蛋白药物的设计、药效学和药理学研究　　人甲状旁腺激素 ( human parathyroid hormone,hPTH)是由人甲状旁腺细胞分泌的调节钙磷代谢的重要肽类激素之一 [ 1 ] ;它通过与受体结合后激活腺苷酸环化酶和蛋白激酶 C活性来影响骨代谢 [ 2 ] ;小剂量间歇性应用 PTH会刺激骨合成 ,有效的治疗骨质疏松症 [ 3 ]。成熟的 PTH有 84个氨基酸残基 ,但早在 20世纪 70年代末 Tregear等 [ 4, 5 ]就证明氨基端1234肽就能保持完整的钙磷调节作用 ,保留天然hPTH所有可测的生物活性 ,具有抗骨重吸收和促 骨形成的双重作用 ,能够很好的预防和治疗妇女绝经后骨质疏松症。由于 hPTH (1234)分子量非常小 ,体内代谢速度相当快 ,为了达到治疗效果 ,常常需要频繁大剂量用药 ;昂贵的价格和频频用药造成的不便严重限制了它的应用。人血清白蛋白 ( human serum al2bum in, HAS)由 585个氨基酸残基组成 ,人们借助这种既有维持血浆渗透压功能 ,又在人体内没有酶学和免疫学活性的大分子蛋白来充当它的载
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
体 ,可使它不易被肾小球滤过 ,延长其血浆半衰期
到 20 d左右 [ 6 ] 。
基因串联体技术是将数个目的基因首尾相
连的串联起来 ,常常用于获取足够的 DNA 片段
或基因的表达产物 [ 7 ] 。由于 hPTH在体内是通过
受体与配体相互结合的方式产生生理作用 ,药物
中配体量的增加 ,在理论上无疑会使药物与受体
结合的机会增加 ,从而起到增强活性和稳定性的
作用。
本研究利用基因工程手段将 hPTH (1234)二联
体与 HSA定向定量地融合在一起 ,中间不加任何连
接肽 ,定向插入分泌型表达质粒载体 pP IC9K,重组
质粒线性化后电击转化巴斯德毕赤酵母 GS115,通
过平板和摇瓶筛选获得了遗传稳定且表达量高的
GS115 /pP IC9K2hPTH (1234)二联体 2HSA重组子 ;并
对重组毕赤酵母分泌表达目的融合蛋白进行了初步
的研究。
1　材料与方法
111　材料
JM109 /pPIC9K2PTH (1284) 2HSA (江南大学沈微
老师提供 ) ;大肠杆菌 JM109、酵母分泌型表达质粒
DH5α/pP IC9K、毕赤酵母 GS115 (H IS4 Mut + ) (本实
验室保藏 ) ; pTG192T PCR 产物克隆系统 (捷瑞生
物 ) ;酵母抽提物、蛋白胨、酵母氮基 YNB、质粒抽提
试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒 (上海生工生物工程
技术服务有限公司 ) ; Pyrobest DNA聚合酶、限制性
内切酶、100 bp DNA Ladder Marker、1 kb DNA Lad2
derMarker(大连宝生物工程有限公司 ) ;尿微量白
蛋白检测试剂盒 (上海名典生物公司 ) ;所有引物由
上海生工生物工程技术服务有限公司代为合成 ;所
有测序服务由上海生工生物工程技术服务有限公司
完成。
112　方法
融合基因构建的总思路如图 1所示。
11211　hPTH (1234)二联体基因的合成 　用质粒抽
提试剂盒提取 JM109 /pP IC9K2PTH ( 1284 ) 2HSA 中
的质粒 ,以提取得到的质粒为模板 ,分别利用上游引
物 P1下游引物 P2和上游引物 P3下游引物 P4,
PCR扩增得到 PTHa′的基因和 PTHa的基因 ;产物
通过 2. 0%的琼脂糖凝胶电泳分析。
图 1　融合基因的构建
　　利用重叠 PCR连接两个 hPTH ( 1234)片段 :反
应的体系为两种回收产物各 1μl, 2. 5 mmol/L 的
dNTP 4μl, 10 ×Pyrobest Buffer 5μl, 5 U /μl的 Py2
robest DNA聚合酶 0. 5μl,加双蒸水补齐 50μl。反
应的条件 : 94℃预变性 2 m in; 94℃变性 30 s, 44℃退
火 30 s, 72℃延伸 15 s,循环 10次 ; 72℃最终延伸 1
m in。反应结束以后 ,立即加入上游引物 P1和下游
引物 P7,改变退火温度为 54℃,延伸时间为 20 s,继
续进行 PCR扩增 30次。用 2. 0%的琼脂糖凝胶分
析重叠 PCR 反应的产物 ,以 100 bp DNA Ladder
Marker作为 DNA分子量标准 ,用 PCR胶回收试剂
盒回收大小为 300 bp左右的目标片段 ,即为 hPTH
(1234) 二联体的基因。用 T4 DNA 连接酶连接
hPTH (1234)二联体基因和 pTG192T载体 ,连接产物
热击转化 JM109感受态细胞 ;转化菌涂布在含 X2
Gal, IPTG,氨苄青霉素的 LB琼脂平板上 , 37℃培养
过夜 ;挑取白色菌落接种至装有 2 m l LB液体培养
基的小试管中 , 37℃培养过夜 ,提取质粒 ,以提取的
质粒为模板 ,用 PCR扩增的方法鉴定二联体基因是
否插入到 T载体中 ;挑取 PCR鉴定为阳性菌送上海
生工进行 DNA测序鉴定。
11212　HSA基因的扩增 　以 P5、P6为上游引物和
下游引物 ,以质粒 pP IC9K2PTH ( 1284) 2HSA为模板
扩增出 HSA 的基因。反应的体系为 pP IC9K2PTH
(1284) 2HSA 1 μl, 10 μmol/L 的引物各 1 μl, 2. 5
mmol /L的 dNTP 4μl, 10 ×Pyrobest Buffer 5μl, 5 U /
μl的 Pyrobest DNA聚合酶 0. 5μl,加双蒸水补齐 50
μl。条件 : 94℃预变性 4 m in; 94℃变性 45 s, 54℃退火
30 s, 72℃延伸 2 m in,循环 30次 ; 72℃最终延伸 10
m in 。用 0. 7%的琼脂糖凝胶分析 PCR反应的产物。
11213　融合基因表达载体的构建 　利用重叠 PCR
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2009年第 7期 　　　张梅等 :人甲状旁腺激素 (1234)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的构建及表达
技术融合 hPTH (1234)二联体基因和 HSA基因。反
应的体系为 1. 2. 1和 1. 2. 2中的 PCR扩增产物各 1
μl, 2. 5 mmol/L的 dNTP 4μl, 10 ×Pyrobest Buffer 5
μl, 5 U /μl的 PyrobestDNA聚合酶 0. 5μl,加双蒸水
补齐 50μl。反应条件 : 94℃预变性 3 m in; 94℃变性
45 s, 54℃退火 30 s, 72℃延伸 2 m in,循环 8次 ; 72℃
最终延伸 7 m in。反应结束以后 ,立即加入上游引物
P1、下游引物 P6各 1μl,继续进行 PCR循环 26次。
用 0. 7%的琼脂糖凝胶分析重叠 PCR反应的产物 ,
以 1 kb DNA LadderMarker作为 DNA分子量标准 ,
用 PCR胶回收试剂盒回收大小为 2 000 bp左右的
目标条带 ,纯化好的目标片段和载体 pP IC9K分别
用 EcoR I和 N ot I双酶切 ,琼脂糖凝胶电泳纯化并
回收双酶切片段 ,用 T4 DNA连接酶 16℃过夜连接 ,
热击转化 JM109感受态细胞 ;转化菌涂布在含 100
μg/m l氨苄青霉素的 LB琼脂的平板上 , 37℃培养过
夜 ;挑取转化子抽提重组质粒 ,用 PCR扩增的方法
鉴定融合基因是否插入到了表达载体中 ,对阳性菌
进行 DNA测序鉴定。
11214　hPTH ( 1234)二联体 2HSA 重组酵母表达系
统构建及鉴定 　活化并过夜培养 JM109 /pP IC9K2
hPTH (1234)二联体 2HSA ,提取质粒 ,经 Sa l I线性化
后 ,电击转化毕赤酵母 GS115感受态细胞 ,转化物
涂布于含 0. 25 mg/m l G418的 MD (1. 34% YNB, 4
×1025 %生物素 , 2%葡萄糖 , 1. 5%琼脂 )平板上 ,
30℃培养至长出菌落 ,挑取所有的长出的菌落到含
0. 5 mg/m l G418的 YPD平板上 , 30℃培养 2～3 d。
挑取长势好的菌落到 20 m l液体 YPD 培养基中 ,
30℃过夜培养 ,提取重组 GS115全基因组 DNA ,用
Invitrogen公司提供的 aox1, 5′引物 ( 5′2GACTGGT2
TCCAATTGACAAGC23′) 和 3′引物 ( 5 ’2GCAAATG2
GCATTCTG ACATCC23′)按如下条件进行 PCR 扩
增 : 94℃变性 1 m in, 57℃退火 90 s, 72℃延伸 2 m in,
循环 35次。0. 7%琼脂糖凝胶电泳检测结果 ,鉴定
出阳性重组子。
11215　融合蛋白的诱导表达 　将 GS115 /pP IC9K2
hPTH (1234)二联体 2HSA接种到装有 25 m l BMGY
(100 mM磷酸钾 , pH 6. 0, 1. 34% YNB , 4 ×1025 %生
物素 , 3%甘油 )的 250 m l三角瓶中 , 215 r/m in, 30℃
培养 24h,沉降菌体 ,弃去上清 ,加入 30 m l BMMY
(100 mM磷酸钾 , pH 6. 0, 1. 34% YNB, 4 ×1025 %生物
素 , 2. 5%甲醇 )。每 24 h补加一次甲醇 ,诱导 72 h。
SDS2PAGE检测重组融合蛋白的表达情况。采用 5%
浓缩胶及 12%分离胶的不连续垂直平板电泳 ,考马
斯亮蓝 R2250染色。用尿微量白蛋白测试试剂盒测
定发酵上清中融合蛋白的表达量。
2　结果与分析
211　hPTH (1234)二联体 cDNA的克隆
以重组质粒 pP IC9k2PTH ( 1284) 2HSA 为模板 ,
分别利用上游引物 P1、下游引物 P2、上游引物 P3下
游引物和 P4进行 PCR扩增 ,得到约 180 bp的 PTHa
’和约 120 bp 的 PTHa。2. 0%琼脂糖凝胶电泳对
PCR产物进行分析 ,以 100 bp DNA Ladder Marker
作为标准 ,结果见图 2。
1. 100 bp DNA LadderMarker; 2. PTHa′; 3. PTHa
图 2　电泳检测 PCR扩增结果
利用重叠 PCR技术 ,将纯化了的两个单体片段
在体外连接起来 ,得到大小约为 300 bp的片段 (图
3)。将二联体基因片段与 pTG192T克隆载体连接 ,
转化 JM109大肠杆菌 ,蓝白班筛选 , 3号泳道为挑选
出的阳性菌的 PCR结果 ,以 PTH1和 PTH7为引物 ,
扩增得到了大小与二联体片段一致的目的条带 ,说
明构建重组质粒成功。
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1. 100 bp DNA LadderMarker; 2. 重叠 PCR反应产物 hPTH (1234)
二联体 ; 3. PCR扩增方法鉴定二联体基因是否插入到了 T载体中
图 3　电泳检测重叠 PCR结果及 PCR鉴定 T载体构建情况
212　HSA基因的克隆
以 P5、P6为上游引物和下游引物 ,从重组质粒
pP IC9K2PTH (1284) 2HSA上 PCR扩增出 HSA基因 ,
大小用 0. 7%的琼脂糖凝胶分析 PCR反应的产物 ,
以 1 kb DNA LadderMarker作为 DNA分子量标准 ,
在 1 800 bp左右的位置有明显的目标片段 (图 4)。
213　融合基因表达载体的构建
二联体融合基因在 EcoR I和 N ot I位点插入表
达载体 pP IC9K,得到的重组表达载体的物理图谱 ,
如图 5。以重组表达质粒为模板 , P1、P6分别为上
1. 1kb DNA LadderMarker; 2. PCR反应的产物
图 4　HSA基因的琼脂糖凝胶电泳结果
下游引物 , PCR扩增法鉴定融合基因是否成功插入
到表达载体中 ,结果显示在 2 000 bp的位置 ,得到了
于预期一致的产物 ,如图 6。
214　重组酵母表达系统的构建和 PCR鉴定
线性化的重组质粒电转入毕赤酵母 GS115,经
G418筛选得到能耐受 0. 5 mg/ m lG 418重组菌若干
图 5　质粒 pP IC9K2hPTH( 1234) 22HSA物理图谱
1. 1 kb DNA LadderMarker; 2. 重叠 PCR反应产物 ; 3. PCR
扩增方法鉴定融合基因是否插入到了表达载体中
图 6　阳性转化子的 PCR鉴定结果
株 ,用 Invitrogen公司提供的通用引物 AOX 1,进行
阳性转化子基因组的 PCR鉴定 ,结果如图 7。
215　融合蛋白的诱导表达
重组融合蛋白的 SDS2PAGE凝胶分析结果如图
8所示。尿微量白蛋白测试试剂盒测定发酵上清中
融合蛋白的量为 127 mg/L发酵液。阳性转化子甲
醇诱导 72 h, SDS2PAGE检测重组融合蛋白的表达
情况。采用 5%浓缩胶及 12%分离胶的不连续垂直
平板电泳 ,考马斯亮蓝染色 ,可以得到 75 kD的融合
蛋白 ,如图 8。用尿微量白蛋白测试试剂盒测定发
酵上清中融合蛋白的表达量为 127 mg/L。
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1. 阳性转化子 ; 2. 1 kb DNA LadderMarker;
3. 空 pP IC9K质粒转化的转化子
图 7　PCR验证电转化结果
1. 蛋白质分子量标准 (低 ) ; 2、3. pP IC9K空质粒转化
的 GS115; 4～7. 重组质粒转化的不同阳性菌株
图 8　蛋白电泳分析 G418抗性菌株的发酵上清液
3　讨论
本研究运用多拷贝基因制备技术和融合蛋白技
术来提高活性片断的表达产量、生理活性和稳定性。
截取了 PTH全基因序列中有调节骨代谢活性的 1～
34位多肽片段 ,既去除了不必要甚至有负作用的部
分 ,又缩短了表达多肽链的长度 ;小分子蛋白或多肽
表达时经常会遇到表达量不高 ,表达产物不稳定 ,表
达产物的纯化不易操作等困难 ;采取了两种手段来
弥补这些缺点 :一是构建二联体 ,即在基因水平上构
建它们的串联体基因 [ 8 ] ,改善重组蛋白的稳定性和
提高表达量 ,间接的提高它的活性 ;二是和人血清白
蛋白融合 [ 9 ] ,以 HSA这种大分子蛋白作为外援药物
的载体 ,延长 hPTH的半衰期。
串联基因的构建常常是各个单体之间首尾随机
连接的 ,得到的产物一般较杂 ,而且对回收的目的片
段进行 PCR扩增时引物的特异性不高 ,也很难扩增
出单一的目的片段。为了克服这个困难 ,特别设计
了引物 P1和 P7,不直接利用单体的 5′末端序列和
3′末端序列为上下游引物扩增二联体片段 ,而是分
别延伸出若干个核苷酸序列 ,同时考虑双酶切连接
和重叠 PCR的需要 ,设计特异性强的引物 ,扩增出
单一的二联体片段 ,既引入所需要的限制性酶切位
点 ,又定向定量的连接单体片段。
HSA是人体血浆中含量最多的蛋白质成分 ,分
子量大 ,在体内代谢时间长。以 HSA为载体可以改
变 PTH的代谢动力学特性 ,还可以避免相应的免疫
清除反应 ,使药物的血浆浓度更加稳定 ,达到提高药
物疗效和减少用药次数的目的。
融合蛋白之间不加任何连接肽 ,可防止机体酶
系统对连接肽和甲状旁腺激素的降解 ,避免现今尚
存争议的连接肽毒理评价问题 [ 10 ]。此外 , HSA融合
载体的加入使得后期目标蛋白的分离纯化变得更加
简单方便。
参 考 文 献
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3　刘娟 ,王斌 ,张杰. 药物生物技术 , 2004, 11 (3) : 203～206.
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160 (2000) : 135～147.
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43～49.
6　 Lucas LH, Price KE, Larive CK. J Am Chem Soc, 2004, 126 (43) :
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