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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
RNA干扰技术的研究进展
何菲 邹凡文
(重庆医科大学附属永川医院老年内科，重庆 400160)
摘 要: RNAi即 RNA干扰(RNA interfering)是近几年发现的一种由双链 RNA引起的基因沉默的现象，是目前分子生
物学领域研究的热点之一。就其作用机制、特点及其在疾病中治疗作用进展方面作一综述。
关键词: RNA干扰 作用机制 治疗作用
Advances in RNA Interference Technology
He Fei Zou Fanwen
(Yongchuan Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400160)
Abstract: RNAi(RNA interference)refers to the process of sequence-specific post-transcriptional gene silencing in animals and
plants initiated by double-stranded RNA(dsRNA)in the past few years． It is also the hotspot of the research in the realm of molecular
biology． This paper introduced the mechanism and summarized the new applications of RNAi in the therapy of diseases．
Key words: RNA interference Mechanism Therapy
收稿日期:2010-02-04
作者简介:何菲，男，本科，住院医师，研究方向:心血管内科;E-mail:cqlej001@ 163． com
通讯作者:邹凡文，女，本科，副主任医师，研究方向:心血管内科;E-mail:zfw1663@ yahoo． com． cn
美国科学家 Fire和 Mello 于 1998 年发表论文，
公布了有关 RNA 干扰(RNA interference RNAi)机
制的发现并因此获得 2006 年诺贝尔医学奖。以他
们的发现为基础，RNA 干扰技术近年来迅速兴起，
其前景被普遍看好。RNA干扰是一门新兴的基因
阻断技术，是一种双链 RNA(double-stranded RNA，
dsRNA)分子在 mRNA 水平上关闭相应序列基因
的表达或使其沉默的过程，也就是序列特异性的
转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，
PTGS)。它通过 21 － 23 nt 的 dsRNA 或发夹状
RNA(short hairpin RNAs，shRNAs)与特异性 mRNA
结合导致靶基因的降解，进而导致目的产物表达
的下调［1 － 5］。外源 dsRNA进入细胞后产生的小分
子干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)的反义
链和多种核酸酶形成了沉默复合物(RNA-induced
silencing complex，RISC) ，RISC 通过结合和切割
mRNA的作用而介导 RNA干扰的过程［1］。就其作
用机制、特点及在疾病中治疗作用进展方面作一
综述。
1 RNAi作用
1． 1 体现在 RNAi的机制两种水平上
1． 1． 1 转录水平 RNA 可以介导 DNA 的甲基化
(RNA-directed DNA methylation，RdDM)最早发现于
一种植物的类病毒系统。 dsRNA(double-strand
RNA)被降解成 21 － 23 个核苷酸长的小片段 RNA
时，这些小的 RNA分子在细胞核可以诱发同源序列
的 DNA甲基化［6］。这种序列特异性的甲基化的信
号与 RNA-DNA 结合有关［7］。当 dsRNA 含有与启
动子同源的序列，即可使同源靶启动子序列甲基化，
从而使靶启动子失去功能，导致下游基因沉默。非
致病病毒造成转录水平基因沉默相关的 RdDM 最
先发现于以菜花样花叶病毒，其 35S 启动子转录得
到含有胭脂碱合成酶启动子(NOSpm)序列的
NOSproRNA。在转基因烟草中，据报告未腺苷酸化
的 NOSpro dsRNA可以诱导同源 NOSpro DNA 的甲
基化，并使拷贝在转录水平上反式失活。在链胞霉
属，DNA的甲基化可能是异染色质的 siRNA介导的
2010 年第 7 期 何菲等:RNA干扰技术的研究进展
组蛋白 H3-K9 的甲基化，是由 H3 甲基转移酶催
化的［8］。
1． 1． 2 转录后水平 ①特异切割 dsRNA 的 RNA
酶Ⅲ家族核酸酶 Dicer 依赖 ATP 切割 dsRNA，将其
分解成具有 2 个核苷酸的 3悬端(overhang)的 19 －
21 bp小片段的双链 siRNA。②RISC(RNA 诱导的
沉默复合物 RNA-induced silence complex)识别并降
解 mRNA。RISC是一种蛋白-RNA效应器核酸酶复
合物。双链 siRNA 为 RISC 的重要组分，它依赖
ATP解旋导致 RISC活化，然后通过 Waston-Crick 碱
基配对识别底物 mRNA并与之结合，并自 siRNA 的
3端将 mRNA切割成小于 12 nt的片段使其降解［1］。
1． 2 miRNA
Dicer酶产生两类功能特异的小分子 RNA:siR-
NA和 miRNA(micro-RNA)。Tuschl 等在从果蝇胚
胎提取物的长的 dsRNA处理得到 siRNA的同时，得
到了 16 种 20 － 23 个核苷酸大小的短的单链 RNA。
这些 RNA由果蝇基因组编码并在 0 － 2 周的胚胎内
表达。它们具有潜在的调节基因表达的作用，被称
为 miRNA［9］。miRNA约 21 个核苷酸大小，为单链
结构，大多数 miRNA 与底物 mRNA 不完全配对结
合，它们并不改变 miRNA 的稳定性，而是通过抑制
翻译来使基因沉默［10］，但目前至少发现一种植物
miRNA(miR171)与底物 mRNA完全配对，这提示了
miRNA通过 RNAi途径调节基因表达的可能性［11］。
与 siRNA不同的是，由于 miRNA 为单链结构，其作
用不需要 ATP的存在。
1． 3 RNAi的放大效应
由于 RNAi 的机制在生物体的效应极其显著，
有研究显示，RNAi通路应该有相应的放大步骤。放
大效应可能的途径:①通过复制 dsRNA 或者 siRNA
进行。Nishikura 提出“过渡的 RNAi (transitive
RNAi)”的机制，即由原先的靶序列的上游序列延伸
形成新的 siRNA，继续降解同源的基因家族成员或
者切割 mRNA［12］。②多轮的 RISC 效应。③RdRP
(RNA诱导的 RNA多聚酶)的作用即植物和新秀丽
小杆线虫的 dsRNA 诱导的沉默都需要与 RdRP 相
似的蛋白质的参与［l］。RNAi 一般在体细胞发挥作
用，在 ego-1 表达的生殖细胞一种称为“随机降解
PCR”的放大模型却提示 RdRP 通过 siRNA 引导链
识别并结合 mRNA，产生一种双链 RNA 的 Dicer 酶
底物，以产生更多的 siRNA。
2 RNAi的生物学特点
2． 1 特异性
RNAi是转录后水平的基因沉默机制，有高度的
序列特异性，这使 dsRNA能够非常特异地诱导与之
序列同源的 mRNA降解，避免降解与目的 mRNA同
家族的其它 mRNA，从而实现对目的基因的精确
沉默［13］。
2． 2 选择性
外源性 dsRNA的转入只对成熟 mRNA 产生作
用，对 mRNA 前体没有或很少具有影响，以内含子
或启动子序列构成的外源 dsRNA无法引起 RNAi效
应;dsRNA的长度对 RNAi的效率有影响。
2． 3 高效性
只需少量 dsRNA 的引入便可抑制浓度是几倍
甚至几十倍的 mRNA 的降解［14］。可能的原因:①
RNAi存在级联放大效应［1］。相比普通的 siRNA，
shRNA产生的 RNAi 效应更强;②可能与 RdRP 的
作用有关，即在 RdRP 的作用下，dsRNA 得以复制，
从而产生更多的 dsRNA导致 mRNA降解［15］。
2． 4 可传播性和可遗传性
RNAi抑制基因表达的效应可以越过细胞界限，
在不同的细胞间长距离传递和维持。值得注意的
是，大于 30 nt的 dsRNA 在哺乳动物细胞中可产生
非特异的基因抑制效应，其可诱发细胞内的干扰素
系统，激活 RNA依赖蛋白激酶 PKR，使翻译起始因
子 2 的 a亚基(EIF2a)被磷酸化，导致翻译过程被阻
断，同时激活 RNA酶配体(RNaseL) ，诱导干扰素的
产生，从而抑制蛋白质的合成，导致细胞凋亡［16］。
然而，在胚胎干细胞或畸胎癌细胞系中不存在这种
干扰素效应，长的 dsRNA 仍可引起基因特异性的
RNAi。
2． 5 抑制作用迅速
RNAi基因的表达发生在转录后，通过细胞质中
同源 mRNA的快速降解，最终使该基因缺少 mRNA
而无法产生蛋白质产物。
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2． 6 稳定性较强
siRNA分子式 3端有突出的非配对碱基的双链
分子，在细胞内可稳定存在 3 － 4 d，半衰期远长于反
义寡聚核苷酸。
2． 7 操作简单
较之传统的技术难度高、费用高、试验周期长的
探针杂交、基因敲除等方法，RNA 干扰技术操作相
对简单，效果明显。另外，RNAi 还有对靶 mRNA 的
切割位点确定性和高穿透性等特点。
3 RNA干扰技术在疾病中的应用
3． 1 病毒感染性疾病治疗中作用
RNAi具有抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、防
止自私基因序列过量增殖等作用，为抗病毒研究和
临床治疗提供了一条重要的全新的途径。借助
RNAi技术治疗病毒感染性病症是 RNAi 技术在病
症应用方面的主要内容与研究领域。
3． 1． 1 人类免疫缺陷病毒(HIV) Sharp 等［17］领
导的研究小组首次将 RNAi技术应用于干预人类免
疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)基
因，发现用 RNAi抑制宿主细胞的受体即 HIV 赖以
进入宿主细胞的人 T细胞 CD4 分子，使大多数细胞
表面 CD4 分子表达减少，并可有效地阻止病毒传
播，抑制 HIV 感染。故 HIV 是人类最早应用 RNAi
技术进行治疗研究的病症。在 HIV 的治疗中，由于
病毒基因序列变异太快，而出现 siRNA 逃逸现象。
为避免出现这种现象，一种策略是应至少选用 2 段
以上针对不同靶序列的 siRNA;另一种策略是针对
HIV的受体或协同受体。如 Qin 等［18］将 HIV-1 协
同受体 CC chemokine receptor 5(CCR5)特异性的
shRNA通过慢病毒载体导入外周血 T 淋巴细胞，可
以对这些细胞的 CCR5 基因的表达产生高达 10 倍
的抑制作用，且作用时间可持续两周。Capodici
等［19］将靶向抵抗 HIV-1 的 siRNA 双链转染入培养
细胞中后能特异性抑制 HIV-1 感染细胞株 CD4
(+)T细胞，同时还发现在 T 细胞株和原代淋巴细
胞中该 siRNA 能有效的抑制 HIV-1 的基因表达和
增殖。Martinez 等［20］以 siRNA 抑制宿主细胞表面
的 HIV协同受体 CXCR 和 CCR5 的表达，取得了类
似的结果。
3． 1． 2 肝炎病毒 McCaffrey［21］用 RNAi 成功抑制
了乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因的复
制与表达。将 HBV质粒和能抑制同源 HBV基因表
达的小发夹结构 RNA(small hairpin RNAs，shRNA)
一起转染入小鼠肝脏进行 RNAi，Northern 和 South-
ern Blotting检测发现 HBV的 RNA 和蛋白表达水平
明显降低，HBV表面抗原(HbsAg)在培养细胞中降
低 94． 2%，在小鼠血清中降低 84． 5%;通过免疫组
检测 HBV核心抗原(HbcAg)降低了 99%。这意味
着 RNAi技术为抑制肝炎基因和感染的基因治疗提
供了新的手段。在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，
HCV)的研究与治疗方面，McCaffrey 等［21］把 HCV
中的 NS5B(non structural protein 5B)片段与能表达
荧光素酶(luciferase)的基因片段融合一起，将其与
抑制 NS5B基因表达的合成的 siRNA共转染入活体
小鼠的肝脏中。这样通过检测荧光素酶的量就能了
解此 siRNA靶向作用于 NS5B 的情况。结果表明，
由于 siRNA靶向作用于 HCV病毒的 NS5B 区域，从
而使荧光素酶的表达量下降了 75%以上，而如果共
转染的是小发夹状 dsRNA，即 shRNA，则荧光素酶
的表达量下降率可达 98% 以上。Randall 等［22］、
Wilso等［23］、Kapadia 等［24］均在各自的试验中得到
了类似的结果，即特异的 siRNAs能够有效的沉默体
外培养的人肝细胞中的 HCV基因。
3． 2 在肿瘤治疗中应用
肿瘤是多基因、多因素疾病，是多个基因相互作
用的基因网络调控的结果。传统技术诱导的单个癌
基因的阻断往往不可能完全抑制或逆转肿瘤细胞的
生长，因此，也很难达到预期的治疗效果，而 RNAi
技术则不同，RNAi 技术能够同时抑制多个不同基
因，而且抑制效果互不干扰，此外 RNAi 识别可以精
确到一个核苷酸，对由野生型点突变形成的癌基因，
如 ras，p53 等，能够产生准确有效的封闭效果，野生
型基因则不受影响。利用 siRNA 干涉技术特异地
抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使
这些基因保持在静寂或休眠状态，而且抑制效果互
不干扰，从而有望达到抗肿瘤作用。
在白血病和淋巴瘤的研究中，Wilda 等［25］应用
RNAi成功地阻止了慢性髓性白血病和急性淋巴母
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细胞瘤瘤细胞的生长分化。Cioca 等［26］分别转染针
对 cRaf 和 Bcl2 的 siRNA 进入多株人白血病细胞
后，两者的蛋白质水平显著降低，沉默 cRaf 表达后
抑制了 TPA 诱导 HL60 细胞发生单核细胞样分化。
Brummelkamp等［27］利用逆转录病毒载体将 siRNA
导入肿瘤细胞中，特异性地抑制了癌基因 Kras
(V12)的表达，在急性髓性白血病的研究方面也取
得了可喜的成果。Means 等应用 RNAi 技术成功地
阻断了 MCF7 乳腺癌细胞中异常表达的与细胞增殖
分化相关的核转录因子基因 spl 的功能。Elbashir
等［4］用人类宫颈癌 Hela细胞作为研究对象，将体外
合成相应的特异性 siRNA 转染入癌细胞中，检测其
前后的变化，结果发现其靶向 mRNA 所表达的蛋白
质的量比转染前降低了 90%。Lin 等［28］利用 RNAi
技术使 Bcl2 基因静寂，从而抑制了前列腺癌 LNCaP
细胞的生长，并可见到染色体浓缩、基因组 DNA 断
裂等细胞凋亡的特征性变化。Schi-jver 等［29］使用
高度特异的 RNAi 技术，沉默前列腺腺癌 LNCaP 细
胞中 FASE 的表达，FASE 的沉默抑制了 LNCaP 细
胞的生长和最终导致其凋亡，而不会影响非恶性的
上皮成纤维细胞的生成能力。
RNAi提高抗癌药敏感性及辐射敏感性。Wang
等［30］发现抗辐射的乳腺癌细胞 MCF7 及其它抗辐
射的细胞中过氧化物酶家族的成员之一———perox-
iredoxinⅡ在电离辐射后表达增加，提示其在消除辐
射后细胞产生的活性氧中扮演了重要角色。然而，
干扰 peroxiredoxin Ⅱ的表达后只能部分逆转细胞的
抗辐射性，提示其可能不是导致细胞抗辐射的惟一
原因。多药耐药基因 MDR1 编码的 P-糖蛋白，是导
致肿瘤细胞化疗耐药的主要原因。针对 P-糖蛋白
的 shRNA 干扰表达载体能有效提高结肠癌细胞对
细胞毒性药物的敏感性。在小鼠体内肝癌模型中，
shRNA 可有效逆转 MDR1 的表达和功能［31］。人类
乳头状瘤病毒 HPV 激活 E6 和 E7 癌基因导致宫颈
癌，并使 p53 途径失活。针对 E6 设计的 siRNA 可
同时作用于 E6 和 E7，重新激活 p53 途径及使宫颈
癌对顺铂敏感［32］。干扰非耐药基因的表达也可以
增强肿瘤药物的作用。如 Hu 等［33］研究也发现，干
扰 HER2 的稳定表达质粒载体，在体内外均能增强
表柔比星的抗瘤作用。
4 结语
虽然 RNA干扰技术在医学领域得到了广泛的
应用，但是有许多亟待解决的问题，如 RNAi 作用的
确切机制、siRNA 跨膜扩散的分子基础及寻找定向
导入 siRNA的手段等。所以，今后的研究重点集中
在 RNAi作用的机制及如何进一步完善 RNAi技术。
随着这些问题的解决，RNA 干扰技术必将推动临床
治疗快速发展。
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