全 文 ：△通信作者。主管中药师
蛇莓提取物对肝癌 H22小鼠的抑瘤作用及机制
伍世恒，龚又明△
广东省中医院药学部(广州 510120)
【摘要】 目的 研究蛇莓提取物对肝癌 H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及其机制。方法 建立 H22肝癌移植瘤小鼠
模型，随机分为空白组、模型组、阳性对照组及给药组(包括低剂量组、和高剂量)，每组 12 只。模型组均每天生理
盐水腹腔注射，给药组根据体重腹腔注射自制蛇莓提取物溶液，低剂量组为 8 mL /kg，高剂量组为 12 mL /kg;阳性
对照组根据体重腹腔注射环磷酰胺，剂量为 20 mg /kg，每组均连续给药 10 d。观察蛇莓提取物对荷瘤小鼠肿瘤生
长情况的影响及肿瘤抑制率;测定蛇莓提取物作用后荷瘤小鼠肝功能指标:ALT、AST和 GGT的含量;免疫组织化
学法检测蛇莓提取物作用后 H22荷瘤组织 Bcl － 2、Bax的表达;显微镜下进行肿瘤病理切片观察。结果 高浓度蛇
莓提取物能显著抑制肿瘤生长，其抑制率为 22. 11%;与模型组比较，蛇莓提取物高、低剂量组均能使 H22荷瘤小鼠
肝功能指标 ALT、AST、GGT显著下降(P ＜ 0. 05);与模型组比较，蛇莓提取物高、低浓度组瘤组织中 Bcl － 2 染色 D
值显著降低(P ＜ 0. 05)，Bax染色 D值显著增高(P ＜ 0. 05);蛇莓提取物能够减少肿瘤组织坏死，以高浓度作用更
明显。结论 自制蛇莓提取物对 H22肿瘤细胞生长有一定的抑制作用，能改善肝功能指标，其作用机制可能与促
进肿瘤细胞表达 Bax蛋白，抑制 Bcl － 2 表达有关。
【关键词】 蛇莓;肝癌 H22;抗肿瘤;作用机制
蛇莓为蔷薇科蛇莓属植物 Duchesnea indica(An-
dr．)Focke的全草，别名蛇泡草、龙吐珠、三爪风、鼻血
果等。蛇莓属植物主要有 4 种，分别为蛇莓、蛇莓(原
变种)、皱果蛇莓及小叶蛇莓，分布于亚洲南部、欧洲及
北美洲，我国主要有蛇莓和皱果蛇莓 2 种［1］。全草供
药用，有清热解毒、活血散瘀、收敛止血作用，又能治毒
蛇咬伤，敷治疔疮等，并用于杀灭蝇蛆。蛇莓中主要含
有三萜以及三萜皂苷类化合物、黄酮类化合物、甾醇类
化合物、酚酸、有机酸类化合物等［2 － 3］。近年来因为蛇
莓的广谱抗肿瘤作用，受到医药学者的广泛关注［4］，研
究表明，蛇莓水提取物对小鼠移植瘤 S180、H22和 S37
的生长有明显抑制作用［4］，且能抑制人结肠癌 ＲKO 细
胞悬浮生长［5］，说明蛇莓具有较强的抗肿瘤作用，但对
其作用机制的研究未见报道，2014 年 6 月至 2015 年 1
月，本研究探讨蛇莓提取物对荷瘤小鼠肿瘤生长情况
的影响及肿瘤抑制作用，观察肿瘤的病理切片，并从凋
亡相关蛋白的表达层面上探索其作用机制。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 药物与试剂 自制蛇莓提取物溶液，由蛇莓中
提取，经过去脂，水沉，精制后制成，为微黄色透明液
体。肝癌 H22瘤株(由广东省医学科学院提供);注射
用环磷酰胺［江苏恒瑞医药(批号 10012241)，100 mg
规格］;胎牛血清(广东省中医科学研究院提供，美国
GIBCO生产);胎牛血清(浙江天抗，批号:140628，优
级);ＲPMI － 1640 培养液(Thermo Fisher 公司，批号:
NYE1280);谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷
氨酰转肽酶(GGT)试剂盒(由广东省中医科学研究院
提供，建成生物生产);兔抗鼠 Bcl － 2、Bax 单克隆抗体
(美国 Santa Cruz公司);SABC 试剂盒(武汉博士德生
物技术公司)。
1． 1． 2 实验动物 昆明种小鼠 (合格证号:
44007200012065)，SPF级，雌雄各半，8 ～ 12 周龄，体重
(20 ±2)g，由广东省中医科学研究院实验动物中心提供。
1． 1． 3 仪器 BBS － DDC － A 超净工作台(山东博科
生物有限公司);TG16 － WS 高速台式离心机(杭州汇
尔仪器);显微镜(日本 OLYMPUS 公司);5% CO2培养
箱(Thermo 科技)。
1． 2 方法
1． 2． 1 H22荷瘤肝癌移植小鼠模型的建立 取传代约
7 ～ 8 d，肿瘤生长良好的小鼠，在超净工作台下抽取腹
腔积液，生理盐水稀释细胞悬液，于显微镜下计数后，
调整 H22肝癌细胞浓度至 1． 0 × 10
7·mL －1。然后取
0. 2 mL细胞悬浮液接种于小鼠右侧腋后线皮下，并密
切观察肿瘤生长。
1． 2． 2 分组与给药 取成功造模小鼠 60 只，雌雄各
半，随机分为空白组(不予任何措施)，模型组，环磷酰
胺组(阳性对照组)，给药组(包括低剂量组和高剂量
组)，每组 12 只。模型组均每天生理盐水腹腔注射，给
药组根据体重腹腔注射自制蛇莓提取物溶液，低剂量
组为 8 mL /kg，高剂量组为 12 mL /kg;环磷酰胺组根据
体重腹腔注射环磷酰胺，剂量为 20 mg /kg，每组均连
续给药 10 d。并记录小鼠的外观、体重、死亡时间和
数量。
1． 2． 3 H22荷瘤小鼠肝功能指标测定 于末次给药 24
h 后，眼球取血，分离血清，使用试剂盒测定血清中
ALT、AST、GGT含量。
·0031· 广东医学 2016 年 5 月 第 37 卷第 9 期 Guangdong Medical Journal May 2016，Vol． 37，No． 9
DOI:10.13820/j.cnki.gdyx.2016.09.004
1． 2． 4 蛇莓提取物 H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用 采
用电动游标卡尺测量瘤体长径和短径，以长径和短径
均值的平方表示肿瘤大小，隔天 1 次，并每天观察荷瘤
小鼠的生长情况。在末次给药 24 h 后，记录小鼠体
重，然后颈椎脱臼处死。取肿瘤块称重，记录荷瘤动物
生长情况，绘制肿瘤生长曲线并计算肿瘤生长抑制率。
公式如下:
肿瘤生长抑制率(%)=
模型组平均瘤重 －治疗组平均瘤重
模型组平均瘤重
× 100%
1． 2． 5 H22荷瘤小鼠肿瘤组织 Bcl － 2、Bax蛋白的表达
肿瘤组织块经 4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋，4 μm
厚连续切片，按 SABC 试剂盒操作说明行 Bcl － 2、Bax
的免疫组化检测。实验采用免疫组织化学染色和计算
机图像定量分析，对各实验组小鼠肿瘤组织内 Bcl － 2
和 Bax两种蛋白的表达水平进行检测。光镜下以恒定
倍数选取一定视野摄像，将图片输入计算机，应用图像
分析软件进行图像分析，得到 Bcl － 2 及 Bax 染色强度
的平均光密度值(D)。用平均光密度值代表组织中特
定蛋白表达水平的高低。光密度是反映物体对光的吸
收率的一个参数，是光线透过物体前后光损失量与入
射光的比值，能客观的反映物体颜色的深浅程度。
1． 2． 6 肿瘤病理组织的观察 剥离肿瘤组织，进行病
理切片，显微镜下进行观察。
1． 3 统计学方法 以上所有数据均以 珋x ± s 表示，采
用 SPSS 16. 0 统计软件统计。方差齐采用单因素方差
分析;方差不齐则采用 t检验。
2 结果
2． 1 蛇莓提取物对 H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用 蛇
莓提取物对肝癌 H22荷瘤小鼠肿瘤有一定抑制作用，以
12 mL /kg剂量更为明显，与模型组比较差异有统计学意
义(P ＜0. 05)，但其作用不及环磷酰胺组。见表 1。
表 1 蛇莓提取物对肝癌 H22荷瘤小鼠瘤重及
生长抑制率的影响(n = 12) 珋x ± s
组别 瘤重(g) 肿瘤生长抑制率(%)
模型组 2． 85 ± 0． 320△ －
环磷酰胺组 1． 63 ± 0． 410 * 42． 81
低剂量组 2． 47 ± 0． 440△ 13． 33
高剂量组 2． 22 ± 0． 370 ＊△ 22． 11
* 与模型组比较 P ＜ 0. 05;△与环磷酰胺组比较 P ＜ 0. 05
2． 2 蛇莓提取物对 H22荷瘤小鼠肿瘤生长情况 实验
各组小鼠的成瘤率为 98%以上，肿瘤生长曲线见图 1，
结果表明，随着时间延长，小鼠肿瘤不断长大，模型组
10 d达到(42 ± 3. 4)mm3;10 d后低浓度和高浓度蛇莓
提取物处理组小鼠的瘤体体积分别为(36. 5 ± 3. 7)
mm3 和(34. 2 ± 4. 5)mm3，其中高剂量组瘤体体积明显
低于模型组，有明显差异(P ＜ 0. 05)，而阳性组小鼠的
瘤体体积为(28. 4 ± 4. 2)mm3，抑瘤作用最强。
图 1 蛇莓提取物对 H22荷瘤小鼠肿瘤生长情况
2． 3 蛇莓提取物对 H22荷瘤小鼠肝功能指标的影响
与空白组比较，模型组 H22荷瘤小鼠肝功能指标 ALT、
AST、GGT等均显著上升(P ＜ 0. 05);与模型组比较，蛇
莓提取物高、低剂量组均能使 H22荷瘤小鼠肝功能指标
ALT、AST、GGT显著下降(P ＜ 0. 05);与环磷酰胺组比
较，蛇莓提取物高、低剂量组中 H22荷瘤小鼠肝功能指标
ALT、AST、GGT明显降低(P ＜0. 05)。见表 2。
表 2 蛇莓提取物对 H22荷瘤小鼠肝功能指标的影响(n = 12)
(珋x ± s)U /L
组别 ALT AST GGT
空白组 44． 66 ± 12． 06▲△ 85． 43 ± 17． 22▲△ 15． 12 ± 1． 25▲△
模型组 135． 17 ± 20． 57＊△ 229． 04 ± 31． 47＊△ 43． 25 ± 3． 27＊△
环磷酰胺组 95． 13 ± 17． 24＊▲ 196． 34 ± 24． 31＊▲ 42． 02 ± 4． 09＊▲
低剂量组 60． 584 ± 16． 98＊▲△ 143． 75 ± 46． 11＊▲△ 33． 4 ± 3． 00＊▲△
高剂量组 56． 58 ± 17． 44＊▲△ 134． 88 ± 39． 26＊▲△ 32． 53 ± 4． 17＊▲△
* 与空白组比较 P ＜ 0. 05;▲与模型组比较 P ＜ 0. 05;△与环磷酰
胺组比较 P ＜ 0. 05
2． 4 蛇莓提取物对 H22荷瘤小鼠瘤组织内 Bcl － 2 和
Bax蛋白表达的影响 蛇莓提取物高、低浓度中瘤组
织中 Bcl － 2 染色 D值明显低于模型组(P ＜ 0. 05);Bax
染色 D 值明显高于模型组(P ＜ 0. 05);与环磷酰胺组
比较，蛇莓提取物高、低浓度中瘤组织中 Bcl － 2 染色 D
值较高，而 Bcl － 2 染色 D值较低。见表 3。
表 3 蛇莓提取物对 H22荷瘤小鼠瘤组织内 Bcl － 2 和
Bax蛋白表达的影响 (珋x ± s)D
组别 Bcl － 2 Bax Bcl － 2 / Bax
模型组 0． 15 ± 0． 01△ 0． 06 ± 0． 01△ 2． 5△
环磷酰胺组 0． 05 ± 0． 01* 0． 24 ± 0． 03* 0． 21*
低剂量组 0． 10 ± 0． 02＊△ 0． 11 ± 0． 01＊△ 0． 91＊△
高剂量组 0． 08 ± 0． 01＊△ 0． 13 ± 0． 02＊△ 0． 62＊△
* 与模型组比较 P ＜ 0. 05;△与环磷酰胺组比较 P ＜ 0. 05
2． 5 病理学观察 经 HE 染色后镜下观察，模型组肿
瘤细胞生长旺盛，片状坏死区面积较小。环磷酰胺组
发现大片的细胞坏死区;治疗组可见不同程度的片状
坏死区，瘤组织内及其周围微血管均减少，其中以高剂
·1031·广东医学 2016 年 5 月 第 37 卷第 9 期 Guangdong Medical Journal May 2016，Vol． 37，No． 9
量给药组的组织坏死区最少。见图 2。
A:模型组;B:环磷酰胺组;C:低剂量组;D:高剂量组
图 2 小鼠 H22瘤组织病理切片(HE，× 400)
3 讨论
目前具有抗癌作用的中药已成为研究热点，不少
中药既具有抗肿瘤作用，又能改善器官损伤，特别是复
方中药在上述领域的应用，是很有发展前景的。而蛇
莓作为抗肿瘤中药广泛应用于临床，效果明显，本实验
室自制蛇莓提取物，由蛇莓中提取，经过去脂，水沉，精
制后制成，化学成分比较明确，如能开发成有效制剂，
将具有良好的实用价值和应用前景。本研究将从药效
学的角度考察蛇莓提取物抗肿瘤作用，为其临床应用
与制剂开发提供药理学依据。
临床上，抗肿瘤药物具有一定药效作用的同时不
良反应较大，结合肿瘤药在临床上应用情况，本研究在
考证蛇莓提取物抗肿瘤作用同时，选取了 ALT、AST 和
GGT等肝功能指标，评价其对肝脏的不良反应。在正
常条件下，ALT、AST 和 GGT 主要存在于肝细胞内，血
清中的含量较低。但是，当肝脏产生损伤、炎症反应
时，肝细胞受损，ALT 和 AST 进入血清，使血清中两者
的含量升高。同时为了进一步明确蛇莓提取物抗肿瘤
的作用机制，本实验从凋亡相关蛋白的表达层面上探
索其对 Bcl － 2 和 Bax 蛋白的影响。Bcl － 2 家族蛋白
是细胞凋亡过程中发挥主要调控作用的一类因子，根
据其功能分为两类:一类抑制细胞凋亡，以 Bcl － 2 为
代表;另一类促进细胞凋亡，以 Bax、Bad 为代表。这些
Bcl － 2 家族蛋白通过二聚体网络的形式相互作用，调
控细胞的凋亡，不同二聚体间的精细平衡决定了细胞
是继续存活还是走向死亡［6］。Bax 蛋白可以与 Bcl － 2
分子形成异二聚体，抵消 Bcl － 2 的抗凋亡作用，从而
促进细胞走向凋亡。
实验结果表明，蛇莓提取物对肿瘤细胞生长有一
定的抑制作用，能改善肝功能指标，其作用机制可能与
促进肿瘤细胞表达 Bax 蛋白，抑制 Bcl － 2 表达有关。
说明蛇莓提取物抗肿瘤作用明显，且毒副作用低是一
种较为理想的抗肿瘤药物。
参考文献
［1］ 张聪子，童巧珍． 蛇莓的研究进展［J］． 中医药导报，2013，
23(4):963 － 965．
［2］ 李晔，刘娜． 蛇莓属植物的化学成分及其生物活性研究进展
［J］． 中国卫生产业，2014，7(3):194 － 195，198．
［3］ 王予祺，常琪． 蛇莓化学成分和药理作用的研究进展［J］． 世
界科学技术 －中医药现代化，2007，9(2):107 － 109．
［4］ 王海英，张翠． 蛇莓的药用研究进展［J］． 上海医药，2009，
30(2):67 － 69．
［5］ 胡兵，沈克平，史秀峰，等． 蛇莓对人结肠癌 ＲKO 细胞失巢
凋亡作用的实验研究［J］． 世界中西医结合杂志，2013，8(1):
69 － 72．
［6］ 张百红，岳红云，李新民． 苦参碱对胃腺癌细胞 SGC －
7901Bcl － 2 表达的影响［J］． 中国肿瘤临床与康复，2000，7
(3):34 － 35．
(收稿日期:2015 － 03 － 24 编辑:朱绍煜)
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