全 文 ：生物杖术通银
技 术 与 方 法 石净0 1 E 曰阴灾从 O G Y B U L L E 刀 N 2 X 旧 年 增 刊
PCR 一D G G E 和 FA M ES技术在土壤微生物多态性
研究中的应用
王林 闯 贺超 兴 张志斌
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所 ,北京l侧x81)
摘 要: 将 PCR 一D G G E 和 FA拟诬s等生物技术新方法用于土壤徽生物分析可有效的克服传统培养方法的局限性 , 为土
壤徽生物多样性 群落结构及动态变化的研究提供了更全面 可靠的方法 , 受到了国内外研究者的重视 本文综述了
PC R 一D G GE 和 FA州LE s技术的原理及其在土堆徽生物多样性 群落结构及动态变化方面的应用效果 , 指出了实际应用存在的
问题
关扭词: PC R 一 D G G E FA 拟[E s 土攘徽生物 多态性分析 应用
A P P lica ti o n of P C R 一D G G E a n d F A M E s T ech ni q u e s in th e
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K 6y wo ld : PC R 一D G G E F A M LE s So d 而 cro b es Th e div ers ity an al 15 A PP lica tio n
微生物在土壤中种类繁多 , 数量巨大 , 如何真
正地把它们在土壤中的类型分布表现出来 , 一直以
来都是困扰着人们的难题 传统的方法是将土壤溶
液接种于一定的培养基上 , 培养基培养可生长出菌
落 ,通过对菌落形态 数 目和一些生理生化特性的
分析来反映微生物的种类和多少 这种方法简单易
操作 ,但由于培养基的限制 ,很难全面的评估出微
生物的多样性 ,只能反映一些 主要 的和适应培养基
条件生长的微生物种类 , 不能深人的研究微生物的
生态功能及动态变化过程
近些年来有机农业的发展 ,使人们对微生物在
物质循环方面的作用日益重视 , 大量的分子生物学
技术不断地被应用到微生物研究 中 , 为土壤微生物
的鉴定及多态性研究提供 了更多更好 的方法 其 中
以 D N A 指纹图谱为基础的微生物分类方法最多 ,
有单链构象多态性分析(SSC P) 限制性片段长度多
态性分析 (RF 廿) 随机扩增 D N A 多态性分 析
(R A PD) 扩增片段长度多态性分析(A F廿 ) 变性梯
度凝胶电泳(D G G E) 温度梯度凝胶电泳(TG G E) 等
随着环境问题的 日益突出和人们对农产品质
量品质要求的逐步提高 , 土壤微生物的多样性及其
动态变化越来越受到科学家们的关注和重视 ,成为
收稿 日期:2(X 拍一03 一13
羞金项 目: 国家 863 什划项 目(2仪拓AA loZ4 21) , 国家科技支摊计划项目(Zo 8BADA 6B03 )和农业部行业科技项目(ny hyZx o7一0 7)
作者简介 :王林闯(1983 一),男 ,硕士研究生 ,研究方向:设施有机蕊菜和土城徽生物 ;E- .11:wl cs l网 163 .com
通讯作者 :贺超兴 ,研究员 ,博士 , 硕士生导师 ,专业方向:蔬菜精准有机栽培技术研究;E 一耐 1:he hao 幻夕 12 6. co m
114 性物杖术通稚 刀勿te chno 如盯 2 (X 为 年 增 刊
当前国内外研究的热点领域 , 以期从中寻求突破
因而 ,针对土壤微生物多样性的研究技术方法随之
得到了很大的改进 , 除了一些分子生物学技术的引
人 , 近年来基于生物化学技术发展起来的 FA M E 谱
图分析方法对土壤微生物多样性的研究也产生了
极大的促进作用 建立在细胞组分水平上的脂肪酸
甲酷分析方法(FA M Es )为土壤微生物群落结构的研
究提供了一个简便 准确的方法 本文通过对现有
研究方法的综述 , 旨在为将其应用于设施有机农业
中对土壤微生物的分析提供理论依据
1 甚本原理
1.1 变性梯度凝胶电泳(D G GE)
D G GE 技术即变性梯度凝胶 电泳 (n enat画ng
脚 dient 罗 1 eleetro 帅ore sis) 是由 Fisheer 和 玩rm an于 1979 年首先提出并将其用于基因突变位点的检
测中 l,l, 19 3 年 M 叮zer等 l,]首次将 D GG E 技术与
PC R 结合应用于微生物生态学研究中 它是基于
D NA 碱基组成和序列的不同而将 D N A 分离的 由
于双链 D N A 分子中 A T 碱基之间有 2 个氢键 , 而
G C 碱基之间有 3 个氢键连接 , 因而在变性剂的作
用下 A T 碱基较 G C 碱基容易被打开而发生解
链 所以不同的 D N A 双链解链时需要 的变性剂浓
度也不同 当双链 D NA 分子在含浓度梯度变性剂
(尿素 甲酞胺) 聚丙烯酞胺凝胶中进行电泳时 , 到
达一定的变性剂浓度会开始发生解链 ,部分解链的
D NA 分子的迁移速度随解链程度增大而减小 ,最
后使具有不同序列的 DN A 片段滞留于凝胶的不同
位里 , 电泳结束时 ,形成相互分开的带谱 ,从而将不
同序列的 DN A 分子分离开来 只要选择的电泳条
件如变性剂梯度 电泳时间 电压等足够精细 ,理论
上甚至认为有一个碱基差异的 D NA 片段都可被分
开
用 D G G E 进行微生物多态性 的研究时 ,为了使
关系比较亲近的品种能够得到分离 , 就需使 目的序
列能够完全解链 ,在 PC R 扩增目的片段时 ,需在某
一引物的 5 端人为掺人一段约 30 ~50 个碱基的
G C 序列 , 称之为 G C 夹 , 用以调节目的序列的解
链行为 , 以防止有些 D NA 分子在变性剂 的作用下
完全解链成单链 ,而不能实现相互分离
PC R 一D G GE 在土坡微生物多态性研究中的一
般技术步骤如下 :(l) 土壤样品采集 ;(2) 样品总
D N A 的提取及纯化 ;(3 ) 样品 16s rD N A (或 18SrD -
N A )片段 PC R 扩增 ;(4 )通过 D GG E 分离 PC R 扩增
产物 ;(5)DG G E 图谱显示 ;(6) 条带与图谱分析
1.2 脂肪酸甲酣分析方法(FA M E s)
脂肪酸甲醋(Fatty ac id m e断 l es te rs )分析法即
FA M E 分析法是基于磷脂系生物细胞膜的重要组
成成分 ,而不同微生物的细胞膜所含有的磷脂脂肪
酸组成和含量有不同 ,其组成和含量具有种属特异
性 ,可以代表某一种类微生物的存在 , 因而可以将
其作为一种生物标记物用于微生物种类的检测 磷
脂构成的变化能够说明环境样品中微生物群落结
构的变化 ,可以对微生物群落进行识别和定量描述
l3] 生物体内细胞中磷脂的含量通常可认为是相对
显著恒定的 ,样品中微生物的组成和数量的变化是
引起 FA M E 谱图发生变化的主要原因 l1 另外 ,磷
脂不是细胞内的贮存物质 , 细胞死亡后 , 其中的磷
脂化合物会马上消失 , 因此 FA M Es 分析方法检测
到的都是活的微生物群体 FA M Es分析方法首先
利用有机溶剂将样品中的磷脂脂肪酸提取出来 , 然
后进行分离纯化 , 标记 , 再通过气相色谱等仪器分
析 ,得到样品的磷脂脂肪酸组成图谱 ,进而得到不
同脂肪酸的含量和种类 ,最后根据谱图中脂肪酸甲
醋的多样性 ,利用相关的数据库和相关的计算机分
析软件 ,便可鉴定出样品中微生物的种类或微生物
群落结构组成的多样性
FA M E , 分析方法在土壤微生物多态性研究中
的一般技术步骤 :(l) 采集样品;(2) 脂肪酸提取 ;
(3)脂肪酸纯化 ;(4 )脂肪酸甲基化 ;(5) 气相色谱
分析 ;(6) FA M E 图谱分析
2 在土坡微生物研究中的应用
2.1 PC R 一D G G E 在土壤橄生物多态性研究中的
应用
土壤是一个非常复杂的体系 ,要想弄清土坡徽
生物的生物及生态效应难度很大 ,土壤中存在的一
些特异物质更增加了对土壤微生物群体研究的难
度 PC R一DG G E 技术提供了一个快速的方法 ,可以
用于研究和比较不同体系下的微生物群体的结构 ,
而不需要用传统的平板培养方法阎国内外的一些
研究者已经利用 PC R一D G G E 对土壤微生物群体开
2O( 为 年 增 刊 王林闯等:PCR一D GC E 和 FA M Es技术在土壤微生物多态性研究中的应用 1 15
展了一些基础方面的调查 , 明确了在不同的环境
空间 时间下微生物群体的变化和差异
通过 PC R 一D G G E 可以对土壤微生物群体的结
构进行分析 ,农业土壤 ,植物根际 , 森林 草地 丘
陵 稻田 油田 果园 湿地 沙漠等等几乎每一种土
壤环境下的细菌群体都已通过 PC R 一D G GE 而被检
测16 通过这些研究对各种各样的土壤环境下的土
壤微生物群体的复杂性进行了列举和比较 D G G E
不依赖微生物的培养 , 其可以得到比传统的培养方
法更大的微生物多样性 PC R 一D GG E 方法可以用
来检测不同农业管理措施l7.幻和不同农药的应用19, 10]
对土壤微生物群体结构的影响 结果表明 ,不同的
处理可以选择性地丰富某些微生物的数量而导致
微生物群体结构发生变化 A il so n M c ai g 利用
D GG E 方法对三种类型草地的细菌多样性进行了
比较 , 同时也对没改进的和经过改进的草地土壤用
克隆方法进行了比较l] 结果表明 ,通过对 D GGE
图谱进行分析确实揭示出了三种草地类型中的细
菌群体结构的差异 ,改进了的草地样品中的细菌的
多样性比没改进的草地样品低 , 半改进的草地样品
中细菌与其它两个草地样品相比 ,具有较少的多样
性和较低的组内变化 为判断根际效应对植物的依
赖性和这一效应是否会因连续两年种植同样的作
物而增加 , K . Sm al a 利用 D G GE 技术对 田间生长
的草毒 , 油菜和土豆三个寄主植物的根际病原菌菌
群进行了分析圈,结果 D G GE 指纹图谱显示出了植
物依赖性变化 ,根际中数量相对丰富的细菌群体在
第二年变得更显著 ,油菜和土豆的根际微生物群体
的 DG G E 图谱彼此比较类似 , 另外还观察了根际细
菌在数量和组成上的季节变化 ,从根际图谱中切离
的主要序列带显示 60 % 以上的带类似革兰氏阳性
菌
卜元卿等通过模拟稻秸还田条件 , 对土壤中直
接提取的 DN A 的 165 rD NA V 3 可变区的扩增产物
进行 D G GE 分析 3] ,结果表明稻秸能够增加土壤 中
细菌的多样性 , 并且随着培养期的延长 ,施有稻秸
的处理中土壤细菌群落多态性的变化远远复杂于
对照土坡 ,还发现在稻秸刺激下 ,不同土壤类型的
细菌群落多态性高峰期出现时间也不同 孟庆杰等
应用 变性梯 度凝胶电泳方法对 黑土区 3 种生态 系
统和豆田 3 种施肥制度下土壤细菌多样性进行了
研究114] ,结果表明 :土壤细菌多样性以草地最高 ,其
细菌丰富度和 sh alm on 多样性指数均高于农田和
裸地 ;在豆田土壤中 ,长期不施肥的土壤细菌丰富
度和 sh an no n 多样性指数最高 ,其次为长期化肥配
施有机肥 , 长期单施化肥最低 钟文辉等采用 PC R -
D GG E 方法研究了长期施用无机肥对土壤微生物
群落多样性的影响阴 结果发现 ,在种植双季稻 连
续 13 年施用不同无机肥后 , 土壤中细菌 古菌 放
线菌和真菌的群落结构发生了较大的变化 未种植
水稻的土壤与种稻土壤间四类微生物的带谱相似
性只有 33% 一6 % 施磷肥的处理 N P PK N PK 之
间微生物群落结构相似性较高 , 4 类微生物的带谱
相似性高达 75 % 一81 % 施氮钾肥 不施肥处理与
施磷肥处理间土壤微生物群落结构的差异较大 ,其
四类微生物的带谱相似性分别为 69 % 一7 % 5 %
~7 7%
上述研究均表明 , 采用 PC R 一D G G E 方法分析
土壤微生物在有机农业和根 际微生物环境 研究中
对于探明其动态变化具有良好应用效果
2. 2 FA M E , 在土壤微生物多态性研究中的应用
cav ise il 等 16 对经过常规翻耕玉米地的土壤样
品进行了 FA M E 图谱的研究 ,发现来 自同一地块的
土壤样品具有高度的可再现性 Pa nk hurs tl 71用 M IDI
系统对来自不同农艺管理措施的土壤的 FA M E 图
谱进行了分析 ,发现不同的 FA M E 图谱标志着不同
的管理措施导致的微生物群体组成的变化 为证明
种有不同作物的两个农业土壤的 FA M E 图谱存在
差 异 , A .M . Ibe kw e an d A .C . K en ne dy 收 集 了两个
不 同地方分别种有小麦 大麦 豌豆 牧草和毛雀麦
草 的根际土进行脂肪酸分析tl81 , 主成份 分析结果显
示两土壤在 PC I上存在 42% 的差异 , 在 PC Z 上存
在 19 % 的差异 ;因子分析结果 显示来 自各种植物品
种的根际微生物群体可能会依赖于植物品种而不
同,大 田的根际土显示 出最高 的脂 肪酸浓度 , 同时
大田样品中的脂肪酸浓度比温室样品表现出更高
的可变性 ; 所鉴定的革兰氏阳性菌存在的丰度是
als:0 ,115:0,a17:0 和 117:0 近似在根际和非根际土
壤之间 , 以短链经基脂肪酸(10 :03 0 H 和 12 :O30 H)
和环丙烷基脂肪酸(cy l7 :0) 为特征的革兰氏阴性菌
116 健物教术透报 B勿姗加 城盯 2 (X 为 年 增 刊
在根际土中的含量比非根际土高 ,这标志着细菌群
体中的一个可能的变化 , 即所研究的各植物种类的
根际土中含有较多的革兰氏阴性菌和较少的革兰
氏阳性菌 Kandel er等 19通过对重金属污染的土壤
微生物的脂肪酸图谱进行分析 ,发现经长时间重金
属污染后 ,土壤中真菌/细菌的比值上升 ,其原因可
能是真菌具有耐重金属污染的能力 ,同时也发现,在
富含重金属的淤泥和粘土中,微生物量有明显的减
少
3 技术应用中存在的问题
虽然新技术对于解决分析土壤微生物具有快
速动态等优点 ,但实际操作中对这些技术的应用也
存在一些不足和缺陷 , 例如 PC R一D G G E 技术方法
在土壤总 D NA 的提取上及后续的 PC R 扩增上都
存在一定的问题 , 表现为土壤总 D NA 提取的方法
很多 ,它们在 D N A 提取的总量 质量和效率上存在
一定的差异 , 因而需对 D N A 提取方法做进一步的
优化和标准化 同时 PC R 扩增能够使具有多个操
纵子的细菌 DN A 形成不同的序列分离开 , 而导致
过高估计微生物多样性的可能性 此外 DG G E 对微
生物的数量还有一定的限制 , 只有至少占整个菌落
细菌数量 1% 的类群才能够被检测到l2] 因此需要
对不 同材料的 PC R 一D G GE 试验条件进行优化或与
其他技术方法相结合 , 才能弥补所存在的缺陷 ,减
少误差 ,提高测定的精确度
同样对膜脂分析的 FA M Es 方法也具有一定的
局限性 ,主要表现为只能定量描述环境中的微生物
群体 ,不能在菌种和菌株水平精确的描述环境中的
微生物种类 ,在群落结构及动态变化的研究中易受
环境因素变化的影响 冬利在实际应用中还需对环
境因素进行控制 ,使其标准化以及与其它方法结合
来打破其存在的局限
4 结语
近 20 年来我国设施蔬菜栽培面积发展很快 ,
为新鲜蔬菜的周年供应提供了有力的保障 ,但连年
栽培大t 施用化肥农药也带来了一系列的问题 如
设施蔬菜产t 偏低 营养品质差 经济效益低 ,特别
是土城的连作障碍 土壤微生物区系失调导致的土
传病虫害和土壤次生盐演化等问题严重影响了设
施农业的可持续发展
针对有机肥不足和土壤地力下降 , 研究者们也
采取了一系列措施来提升地力 近年来我们研制开
发了设施蔬菜有机土栽培技术123 , 采用将农作物秸
秆等生物质经腐熟后还田的方法 ,增加了土壤有机
质 , 改善了根际理化环境不仅可以改善蔬菜品质 ,
节省生产成本阴, 还可有效的克服设施栽培通常存
在的土壤易板结 土传病害频发 连作障碍和地下
水污染等缺陷 为发展有机农业 , 提高有机栽培下
的养分利用率 ,我们来在育苗中接种丛枝菌根真菌
(A M F) 圈 , 研究表明接种 AM F 可以在一定程度上
增加蔬菜抗逆性 , 提高产量和改善蔬菜营养品质 ,
减少化肥和农药用量 , 保护生态环境 ,提高经济效
益 ~ ]这些结果表明除了有机土栽培基质理化性
质的改善和菌根增加根系吸收面积的影响外 , 土壤
微生物在营养 吸收和物质转化方面起到 了很大 的
作用 , 因此采用先进的技术方法对土壤微生物的群
落结构 多样性及动态变化进行研究分析 ,对于探
明其作用机理具有重要意义
目前 对根 际土壤 微生 物 DN A 的 PC R 一DG G E
技术和对微生物膜脂分析的 FA M E s技术在土壤微
生物多样性及动态变化 的研究中被大量应用 ,取得
了很好的应用效果 , 它们在一定程度上有效地克服
了传统培养方法的局限性 , 使我们获得了更为完全
和可靠的信息 ,大大拓展了人们对土壤微生物多样
性 群落结构和组成及动态变化的深人了解 , 为科
学研究提供 了新的分析途径
总之 , PC R 一D G GE 和 FA M Es 分析技术作为土
坡微生物研究领域的应用新技术 ,在实际操作中虽
然还存在一定的问题 , 但随着技术的进步 ,其应用
日趋广泛 , 他们 自身也会得到不断的改进 发展和
优化 ,必将在土壤微生物研究中发挥更大的作用
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