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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
染色体重组对转基因大麦中 gfp基因表达的作用
苏琰1，2 黎华1 刘知晓1 张小蒙1 朱雪1 金赫日3 陈建民1
(1扬州大学生物科学与技术学院，扬州 225009;2安徽巢湖职业技术学院，巢湖 238000;3朝鲜元山农业大学生物技术系，江原道)
摘 要: 利用 5 种转绿色荧光蛋白基因(gfp)大麦不同株系及野生型大麦为材料，对不同转基因株系间以及转基因株系
与野生型植株间进行杂交，分别对不同世代植株的根尖、花粉中 gfp基因的表达量进行测定。结果表明，不同转基因株系间的
根尖、花粉的 gfp基因在表达量上存在差异，同一转基因材料的 gfp基因表达存在组织差异;gfp基因在杂交后代中作为一个显
性基因以孟德尔方式稳定遗传，不同染色体上的 gfp基因重组有利于提高转基因表达。
关键词: 绿色荧光蛋白 转基因遗传 转基因表达 大麦
The Effect of Chromosome Recombination on Transgene gfp Expression in
Transgenic Barley (Hordeum vulgare L．)
Su Yan1，2 Li Hua1 Liu Zhixiao1 Zhang Xiaomeng1 Zhu Xue1 Kim Hyok Il3 Chen Jianmin1
(1College of Bioscience and Biotechnology，Yangzhou University，Yangzhou 225009;2Chaohu Vocational and Technical College，Chaohu
238000;3Wonsan Agricultural University，Biotechnology Department，Kangwon Province，Emocratic Peoples Republic of Korea)
Abstract: Five transgenic barley lines with different expression levels of transgene gfp and a non-transgenic barley (Igri)were
used as parents to make every possible combinations of crosses． The gfp gene expressions were examined on root tips and pollen of F1，
F2progenies and their parents． The inheritance of foreign gene in transgenic plants was also studied． The intensity of gfp gene expres-
sion on root tips and pollen showed significant differences not only among transgenic barley lines but also among different organs for the
same transgenic barley lines． The gfp gene in the hybrid offspring acted as a dominant gene and inherited stably following Mendelian
model． The recombination gfp genes which were inserted into different chromosomes increased the transgene expression．
Key words: Green fluorescent protein Transgene inheritance Transgene expression Barley
收稿日期:2011-04-14
基金项目:国家自然科学基金项目(30471075) ，转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08002-011B)
作者简介:苏琰，女，硕士，研究方向:作物分子细胞遗传学;E-mail:suyan0706@ yahoo． com． cn
通讯作者:陈建民，男，博士，教授，研究方向:作物分子细胞遗传学;E-mail:jmchen@ yzu． edu． cn
自 1984 年有学者首次利用农杆菌 Ti 质粒将外
源基因导入烟草获得转基因烟草以来［1］，植物转基
因的研究和应用得到了迅猛的发展，产生的转基因
植物已涉及水稻［2］、大豆等多个物种，转基因研究
对于植物遗传改良正在发挥着革命性的作用。现代
转基因技术与传统的杂交育种方法相结合培育品
种，是当今植物遗传改良中的一种优良方法。转基
因植物中的外源基因在同种植物材料间比较容易杂
交转育，同一遗传背景材料所获的转基因植株，由于
转基因插入染色体的不同，相互间杂交可使转基因
所在染色体进行重组，进而获得转基因表达提高的
材料。另外，将外源基因导入转化频率高的受体中，
通过转基因受体与相关材料的杂交和回交转育，在
此过程中利用分子标记辅助选择而达到转基因转育
的效果。Bavage等［3］以转 gus基因的油菜和非转基
因材料进行杂交，发现单拷贝插入的外源基因在后
代材料中有 GUS活性的表达，说明外源基因能够稳
定遗传和转育。自 Chalfie 等［4］首次报道了绿色荧
光蛋白(gfp)基因在大肠杆菌(E． coli)中表达成功
后，gfp 作为一种报告基因已被用于水稻［5–7］、大
麦［8］和小麦［9］等植物转基因的研究。一般转基因
在转育过程中的存在和表达检测比较困难，而绿色
荧光蛋白的可见性可以很方便地研究转基因在转育
过程中的存在和表达。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
以转 gfp基因大麦与野生型大麦相互杂交，通
过对 F2根尖和 F1花粉中 GFP 的检测，探讨了转基
因遗传及染色体重组对转基因表达的影响［10］，但研
究所用材料为转基因插入的染色体是基本相同的株
系，难以确定转基因表达的变化与染色体重组间的
明确关系。本研究利用已明确转基因插入位置为不
同染色体的转 gfp基因大麦株系以及野生型大麦为
材料，对不同转基因株系间以及转基因株系与野生
型植株间进行杂交，分别对不同世代植株的花粉、根
尖中转基因 gfp 的表达量进行测量分析，以期通过
传统杂交进行转基因的遗传和染色体重组来研究转
基因的表达，为通过转基因技术和传统杂交方法相
结合进行植物遗传改良提供依据。同时研究转基因
沉默的机制，为如何克服转基因沉默提供依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
转绿色荧光蛋白(GFP)基因大麦株系 A、B、C、
D、F，由加拿大 Guelph 大学 Dr． Kasha 提供。A、B、
C株系由 sgfp 基因构建的 pAct11sgfp-1 质粒［11］转
化，D、F 株系由 pgfp 基因构建的 pMON30049 质
粒［12］转化，它们均通过基因枪轰击大麦品种 Igri 未
成熟花粉，然后经组织培养获得［13］。本研究材料为
经多代自交获得的 T5代转基因纯合体。
gfp基因在 A、B、C、D 和 F 株系大麦染色体上
的物理位置经荧光原位杂交研究已经确定。A 株系
的插入位置是第 7(5H)染色体长臂，B 株系的插入
位置是第 6(6H)染色体短臂和另一未确定染色体
的短臂。C株系是第 7(5H)染色体短臂;D 株系的
插入位置是第 7(5H)染色体短臂的近末段;F 株系
除了在第 7(5H)染色体长臂上有一插入位点外，在
第 5(1H)染色体短臂上还有另一插入位点［13，14］。
对照为无 gfp插入的大麦品种 Igri。
1． 2 杂交及荧光强度测量
以 B株系分别与 C、D、F株系和野生型大麦 Igri
(CK)进行正反杂交，即 B × C，C × B;B × D，D × B;
B × F，F × B;B × CK，CK × B(其中 B × C 未成功)。
并将 B × CK，CK × B的 F1代与 CK进行回交和检测
后代的根尖荧光。
花粉的荧光测量是亲本、F1各组合随机取 10
株，每株取 5 枚花药测量。花药放在滴有清水的载
玻片上挤出花粉，盖上盖玻片，在荧光显微镜(O-
lympus，BX51)下观察。利用软件(image-pro-plus
5. 0)在相同透光条件下对每粒花粉进行荧光强度
测量。GFP在大麦花粉中的表达表现为整个花粉粒
内都有绿色荧光，表达强时无空隙可见，弱时可见空
隙(将花粉荧光的灰度值小于 700 的花粉定为无
GFP表达，大于 700 的花粉为有 GFP 表达)。根尖
的荧光测量是亲本及各 F1组合取 100 粒种子，F2各
组合取几百粒种子不等，在培养皿中萌发，每一种子
取一根尖在相同透光条件下观察荧光表达强度。荧
光强度以软件给出的灰度值表示，数值越大则表示
荧光强度越强。以 Igri的荧光灰度值(低于 200)为
标准，超过此标准为有荧光，而低于此标准为无
荧光。
2 结果
2． 1 亲本根尖、花粉中的荧光表达
供试材料在荧光显微镜下观察，A、B、C 和 F 株
系表达荧光的根尖、花粉为亮绿色，不表达荧光的 D
株系、CK根尖无绿色(图 1)。从观察的快速及一致
性来看，根尖是检测 GFP最理想的器官。
A、B、C、D和 F分别表示 A、B、C、D和 F转基因株系;CK表示对照
图 1 供试材料的根尖、花粉中的荧光表达
不同转基因株系的 gfp 基因在根尖、花粉中表
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2011 年第 11 期 苏琰等:染色体重组对转基因大麦中 gfp基因表达的作用
达强度不同(表 1)。具有相同 pgfp 基因的 F、D 株
系，F株系 gfp基因在根尖表达最强，而在花粉中仅
有少量花粉表达，表达量一般。D 株系和对照的根
尖、花粉荧光强度基本相同而表现转基因沉默，各株
系的根尖荧光强度依次为 F ＞ C ＞ B≈A ＞ D。各株
系花粉的荧光强度也不一致，其荧光强度依次为 C
＞ A≈B ＞ F ＞ D。A、B、C 株系由 sgfp 基因转化而
来，根尖、花粉中均有 GFP 表达，C 株系在根尖的荧
光强度一般，而在花粉中高表达。相同 gfp 基因在
不同转基因系中表达强度不同，甚至出现转基因沉
默。另外，相同 gfp 基因在不同器官中的表达强度
也不同，表现了基因表达的组织特异性。由此可见，
转基因表达是比较复杂的，其原因与 gfp 基因在染
色体上的插入位点及其结构有关。
表 1 根尖、花粉中 gfp基因的表达强度
材料名称 根尖(平均值 ±标准差) 花粉(平均值 ±标准差)
A 457 ± 38 1 561 ± 283
B 464 ± 44 1 342 ± 258
C 641 ± 73 3 372 ± 194
D 150 ± 16 562 ± 39
F 2 169 ± 190 633 ± 39
Igri 146 ± 8 530 ± 41
2． 2 F1根尖、花粉中的荧光表达
2． 2． 1 F1根尖的荧光表达 已知 B 株系 gfp 基因
有一插入位点为第 6 染色体短臂，而 C、D、F株系均
在第 7 染色体上有 gfp插入位点，因此 B 株系与 C、
D、F株系杂交的 F1代中第 6 和第 7 染色体为 gfp 基
因的杂合体，对其根尖荧光强度进行测量(表 2) ，并
与其亲本进行比较，便可了解 gfp 基因的遗传方式
和在多个位点杂合状态时的 GFP 表达强度。结果
表明，所有 F1根尖均有 gfp 基因表达，B /D、B /C、B /
F组合的 F1荧光表达并未因 gfp 基因插入不同染色
体的数目增加而提高表达，荧光强度介于亲本荧光
表达值之间，B /CK 组合的 F1荧光表达值也介于亲
本荧光表达值之间，且相同组合 F1的正反交之间不
存在明显差异，说明 gfp 基因能通过有性杂交的方
式成功转育到野生型植株中，并能够正常表达。
表 2 F1根尖 gfp基因的表达结果
组合 根尖(平均值 ±标准差)
C × B 528 ± 26
B × D 279 ± 31
D × B 293 ± 33
B × F 1 604 ± 273
F × B 1 583 ± 279
B × CK 291 ± 14
CK × B 258 ± 8
2． 2． 2 F1花粉中的荧光表达及分离 F1的花粉中
染色体为单倍体，是 F1植株染色体分离和重组的结
果。花粉间荧光表达不同于根尖那样一致，因为转
基因 gfp将随着所在的染色体进行分离和重组，由
于不同杂交组合所涉及的转基因所在染色体不同，
F1花粉荧光的表达结果表现为单位点和两位点
遗传。
B × CK，CK × B的 F1植株减数分裂产生两种类
型花粉:有 gfp基因和无 gfp基因的染色体组成的花
粉，花粉粒的荧光表达值分布可分为两类，一类是荧
光值低于 700，平均值为 602 ± 45，无荧光表达;另一
类荧光平均值为 1 440 ± 308，与 B亲本荧光值接近。
经 χ2测验符合单位点遗传的理论分离比 1 ∶ 1(表
3)。B × D，D × B 的 F1植株中携带 gfp 基因的染色
体涉及两对染色体分离，以 B6 代表 B株系 gfp 基因
插入的第 6 染色体，D7 代表 D株系 gfp 基因插入第
7 染色体，“—”表示无 gfp基因插入的染色体(以下
相应组合分析类推) ，在理论上产生 4 种染色体重
组花粉(B6D7、B6—、—D7、— —) ，但 D株系 gfp 基
因沉默，表明 gfp所在染色体相当于对照，花粉粒的
荧光表达值分布为无荧光表达(平均值为 551 ± 71)
和与 B亲本荧光值接近(平均值为 1 459 ± 256)两
类。所以花粉有荧光和无荧光比例也为 1 ∶ 1(表
3)。B × F，F × B 组合的 F1植株中携带 gfp 基因的
染色体涉及 3 对染色体，理论上产生 8 种染色体重
组花粉 (F5B6F7、F5B6—、F5—F7、—B6F7、F5—
—、—B6—、— —F7、— — —) ，而实际测量的花粉
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
荧光表达强度主要分布也在两个区段，无荧光表达
(平均值为 677 ± 81)和与 B 亲本荧光值接近(平均
值为 1 397 ± 188)。F 株系的花粉本身荧光表达就
不强，B /F 组合 F1代产生 8 种基因型花粉，其中一
半具有 6H染色体，另一半没有 6H 染色体，与表现
有荧光和无荧光两种表型相一致，表明 6H 染色体
的 gfp基因在花粉中有荧光表达，否则无荧光，因此
花粉有荧光与无荧光的比例也表现为 1∶ 1 的单位点
遗传分离(表 3)。
表3 转基因大麦 F1花粉和 F2根尖的GFP表达单位点分离
器官 组合 有荧光 无荧光 χ2
花
B × CK 594 599 0. 02(1∶ 1)
CK × B 944 967 0. 27(1∶ 1)
根尖
B × CK 466 162 0. 21(3∶ 1)
CK × B 392 134 0. 06(3∶ 1)
花粉
B × D 427 397 1. 09(1∶ 1)
D × B 353 347 0. 05(1∶ 1)
根尖
B × D 386 141 0. 87(3∶ 1)
D × B 436 155 0. 47(3∶ 1)
花粉
B × F 789 773 0. 16(1∶ 1)
F × B 570 557 0. 15(1∶ 1)
X20. 05，1 = 3. 84 时，P = 0. 05
C × B 组合也产生 4 种染色体重组花粉
(B6C7、B6—、—C7、— —) ，由于 7H长臂和 6H短
臂上 gfp基因均表达且表达强度不同，因此花粉表
达荧光强度分布在 4 个区段，但 4 个荧光强度内的
花粉数量经卡方检测，并不符合期望的 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1，
而以灰度值 700 为界，有荧光与无荧光花粉的比
例符合 3∶ 1(χ2 = 0. 77) (表 4) ，表明花粉中 gfp 基
因的表达具有两对基因的重叠作用特点。
表 4 转基因大麦 F1花粉的 GFP表达双位点分离
器官 组合 ＜ 700
700 －
1700
1700 －
2700
＞ 2700 χ2
花粉 C × B
293 336 338 147 88(1∶ 1∶ 1∶ 1)
293 821 0. 77(3∶ 1)
X20. 05，1 = 3. 84 时，P = 0. 05
2． 3 F2根尖的荧光表达及分离
F1自交产生 F2，来自 B株系的第 6 染色体和其
他株系的第 7 染色体上的 gfp 基因将随这些染色体
的分离而发生重组，F2各个体的 gfp 基因所在染色
体的组成不同，个体根尖间荧光表达将不同于 F1而
出现分离，由于不同组合所涉及的染色体不同，F2根
尖荧光的表达及分离结果不同。
B × CK，CK × B的 F2植株表现有荧光表达与无
荧光表达两种表型。经 χ2测验实际结果符合单位
点遗传的理论值 3∶ 1(表 3)。B /D 组合涉及两对染
色体遗传，F2群体的基因型和表现型分布为: (9 /
16)B6—D7—(荧光)、(3 /16)B6— — —(荧光)、
(3 /16)— —D7—(无荧光)、(1 /16)— —(无荧
光)。实际测得有荧光和无荧光植株比例符合一对
等位基因的 3∶ 1 分离。由于 D 株系为转基因沉默，
B × D的 F2植株也表现出单位点遗传(表 3)
C /B 组合的 gfp基因也涉及第 6、第 7 染色体，
F2群体重组产生 9 种基因型可归类为: (9 /16)
B6—C7—、(3 /16)B6— — —、(3 /16)— —C7—、
(1 /16)— — — —。其中载有 gfp基因的第 6、第 7
染色体都纯合为 B6B6C7C7，理论上应占 1 /16，还有
一种是第 6、第 7 染色体上无 gfp 基因，根尖测量表
现为无荧光表达，理论上也占 1 /16;其余 7 种基因
型的荧光强度表现为分布在以上两种基因型的荧光
强度之间。实际测量结果表明，F2群体荧光强度呈
连续分布，在 924 株中，超过亲本表达量的植株为
54 株，无荧光表达的植株为 60 株，两种极端类型符
合理论期望，但总体不符合 9 ∶ 3 ∶ 3 ∶ 1 的分离比例。
然而如以灰度值 200 为界，荧光表达与无荧光表达
的比例则符合 15∶ 1 的遗传理论值(表 4)。和花粉
中的表达方式一样，gfp基因的表达具有两对基因的
重叠作用特点。
依据以上分析的方法，B /F 组合的 F2群体涉及
3 对染色体上的转基因位点分离，理论上共产生 27
种基因型。根据染色体上 gfp 基因位点数将 27 种
基因型分为 7 类，即从具有 0 个 gfp基因位点到 6 个
gfp基因位点。将荧光强度由弱到强分为 7 个区段，
并与 gfp基因位点数对应起来(表 5)。实际测量结
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2011 年第 11 期 苏琰等:染色体重组对转基因大麦中 gfp基因表达的作用
果显示 B /F组合的 F2群体各个体的荧光强度表现
连续分布，B /F 组合的正反交 F2群体在这 7 个区段
的分布比例较接近，并且出现了无荧光表达和高于
亲本荧光表达的植株，与理论上染色体的分离和重
组结果一致。但正反交 F2群体经卡方检测并不符
合 1∶ 6∶ 15∶ 20∶ 15∶ 6∶ 1 的理论分离比例。有可能是
gfp拷贝数与表达的复杂性，加上测量条件产生一定
的误差。有意义的是，出现了高于亲本荧光表达的
植株，表明不同染色体上 gfp 基因的累加并纯合对
该基因的高表达有一定作用。
表 5 转基因大麦 F2根尖的 GFP表达 3 位点分离
组合 ＜ 200 200 － 600 600 － 1000 1000 － 1400 1400 － 1800 1800 － 2200 ＞ 2200 χ2
B × F 3 354 137 504 231 148 54 582. 02
F × B 5 328 179 521 241 125 42 420. 61
理论比例 1 /64 6 /64 15 /64 20 /64 15 /64 6 /64 1 /64
3 讨论
3． 1 不同染色体上 gfp基因表达不同
目前，在植物基因转化所使用的方法中，外源基
因的插入均为随机性，即外源基因可插入不同的染
色体或相同染色体的不同位置。外源基因在转基因
植物及其后代的表达水平、遗传稳定性受外源基因
整合的位置、拷贝数和甲基化等多种因素的影
响［15］。本研究所用材料为转 gfp 基因的大麦，各个
独立转基因株系的荧光表达不同，与 gfp 基因插入
的染色体及其位置具有关系［8］。
在 B株系与野生型和其他株系的杂交后代花
粉、根尖荧光表达的分离分析中，B 株系均表现 gfp
基因单位点插入的特点。事实上 B 株系中 gfp 基因
插入染色体为 2 对［14］，在 B × CK、B × D、B × C 组合
的花粉分离中应表现为双位点，而实际结果表现为
单位点遗传，其原因可认为 B 株系中 gfp 基因插入
的 6H染色体在荧光表达中具有功能，而插入的另
一染色体在荧光表达中没有功能。该推测可由回
交后代分离结果得以证明，(B × CK)× CK 的后代
植株中根尖表现荧光的为 10 株、无荧光为 9 株，
(CK × B)× CK 的后代植株中根尖表现荧光的 13
株，无荧光为 12 株，均表现单位点的 1∶ 1 遗传分离。
花粉分离与回交后代分离结果的一致性表明，gfp 基
因插入的另一染色体在荧光表达中没有功能，其机
制可能还是与基因插入位置有关。
3． 2 染色体重组与转基因的遗传表达
通过对转基因正常表达系、转基因沉默系、野生
型及其互相杂交的 F1、F2进行荧光测量，结果表明
F1中均有 gfp 基因的表达，F2代发生了正常的遗传
分离，基本上符合孟德尔遗传。表明转基因插入受
体染色体后已经和受体基因组融为一体，作为一个
独立的基因在其后代中稳定遗传，而且纯合的转基
因系作为亲本在常规育种中是完全可以利用的。外
源基因的遗传在本研究中有两种方式:单基因位点
和多基因位点的遗传方式。在同一染色体上不同位
点插入 gfp基因的转基因植株间进行有性杂交，gfp
基因在杂交后代中以一个显性基因稳定传递［10］。
而本研究中，B株系 gfp 基因位于第 6 染色体，其他
转基因株系 gfp 基因位于第 7 染色体上。结果表
明，gfp基因插入不同染色体的转基因植株间进行杂
交，gfp基因在杂交后代同样以一个显性基因稳定传
递。而且不同染色体上 gfp 基因的累加并纯合对该
基因的高表达有一定作用。在利用转基因进行植物
遗传改良工作中，利用不同表达程度的转基因系之
间相互杂交，通过外源基因插入不同染色体间的重
组，从后代中选择转基因高表达的个体，可以提高转
基因方法进行植物遗传改良的效率。
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(责任编辑 狄艳红
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
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(责任编辑 马鑫)
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