全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
新技术在农药微生物降解中的应用
杨柳 陈少华 赵川 钟国华
(农药与化学生物学教育部重点实验室 华南农业大学昆虫毒理研究室,广州 510642 )
摘 要: 近年来,分子生物学及基因工程的迅猛发展,克服了农药微生物降解传统研究中存在的障碍, 为农药微生物降
解的研究开辟了新的途径。综述了固定化技术、基因工程、多菌复合体的构建以及细胞表面展示技术在农药微生物降解中的
应用, 并对新技术在农药微生物降解中的应用前景作出了展望。
关键词: 固定化 基因工程 多菌复合体 细胞表面展示
Application of New Technology in PesticideM icrobialDegradation
Yang L iu Chen Shaohua Zhao Chuan Zhong Guohua
(K ey Laboratory of Pesticide& Chem ical Biology, M inistry of Education, Laboratory
of Insect Tox icology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)
Abstrac:t Recent years, the rapid developm ent o fm o lecular b io logy and genetic eng ineer ing has becom e a new w ay form icrob ia l
deg radation o f pestic ide to overcom e the ba rrier o fm icrob ial degradation pestic ide in trad itiona l research. This paper introduced applica
tion of techn ique of imm ob ilized, genetic eng ineer ing, create flo ra of m icrobe and techn ique o f su rface display in m icrob ia l deg rada tion of
pestic ide. The prospec t of resea rch and app lication we re a lso rev iewed.
Key words: Imm ob ilization Genetic eng ineering F lora o f m icrobe Ce ll surface disp lay
收稿日期: 20091123
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30871660) ,广东省科技计划项目 ( 2008B 020900007)
作者简介:杨柳,男,硕士研究生,研究方向:农药生物降解
通讯作者:钟国华,副教授, Em ai:l guohuazhong@ scau. edu. cn
农药在控制农林业病虫害过程中发挥了重要的
作用, 但与此同时,农药残留给生态环境和农产品带
来了严重的污染。有机农药的大量使用, 使粮食、蔬
菜、瓜果等农药残留超标,污染严重, 给非靶生物带
来危害,对人类的健康造成了严重的威胁。因此,环
境中农药污染受到了越来越多的关注, 如何消除农
药残留,成为迫切需要解决的问题。
农药残留污染可通过微生物生物修复技术所控
制 [ 1] ,利用微生物降解农药残留已成为研究热点,
与其它方法相比,微生物降解具有降解速度快、操作
简单, 成本低、无毒、无残留、无二次污染等优点,是
降解农药残留的一种安全、有效、廉价的方法。然而
微生物降解农药残留研究中仍存在一些需要解决的
问题。近年来,随着分子生物学及基因工程等的迅
速发展,各种生物学技术不断涌现都为克服微生物
降解农药存在的问题提供了必要的条件, 使农药微
生物降解应用于实际成为现实。例如,利用固定化
技术可以保持降解菌或降解酶的在环境中的活性,
为降解菌或降解酶应用到实际当中提供了保障; 采
用基因工程手段构建高效降解菌, 改造降解菌的各
种性质使其更加适应环境,进而提高降解效率;多菌
复合体的构建克服了单一菌株降解不彻底的问题;
细胞表面展示技术克服了降解菌与农药残留之间接
触的障碍,避免了蛋白质纯化过程的繁琐步骤,提高
了降解酶的降解效果。综述了几种新技术在农药降
解菌研究中的应用,旨在对今后农药微生物降解的
研究提供参考。
1 固定化微生物技术的应用
固定化微生物技术是 20世纪 80年代兴起的一
种新型生物技术, 它通过采用化学或物理的手段将
游离细胞或酶定位于限定的空间区域内,使其保持
活性并可重复利用,具有利于提高生物反应器内的
2010年第 3期 杨柳等 :新技术在农药微生物降解中的应用
微生物细胞浓度和纯度,并保持高效菌种,二次污染
小等特点。利用固定化技术固定具有降解能力的微
生物和酶,然后用来处理对被农药污染的土壤或水
体,具有良好的发展前景。
1. 1 固定化细胞的应用
细胞固定化是指应用物理或化学的手段将游离
的细胞定位于限定的空间区域并使其保持活性,并
可反复使用的一种技术。一般固定化微生物技术大
致可分为吸附法、共价结合法、交联法和包埋法 4大
类。包埋法是微生物固定化最常用的方法。应用固
定化微生物技术处理、降解污水中的农药成为一个
新的研究领域。张丽青等 [ 2]将工程菌 DH5固定
化后, 固定化细胞在 3 h内对 1 000 mg /L的甲基对
硫磷降解率高于 65%。海藻盐用作包埋剂最多,如
用藻朊酸钠盐将 P seudomonas aeruginosa包埋得到
降解丙烯酰胺固定化细胞 [ 3] ; H a等 [ 4]用海藻酸钙
包埋得到降解蝇毒磷固定化细胞降解率是游离细胞
的 5倍。国内也取得了一些研究成果, 如谢明杰
等 [ 5]将 1株氯苯高效降解菌作为研究对象, 以海藻
酸钠为包埋剂,以氯化钙为固定剂制成固定化小球,
对氯苯的降解效果良好;朱鲁生等 [ 6 ]以莠去津降解
菌 HB5为研究对象, 采用海藻钠包埋研究制得固
定化细胞对莠去津的降解率可达 90%。
1. 2 固定化酶的应用
用微生物所产生的酶来处理农药残留, 避免了
因使用微生物对环境造成的危害。一些酶类比该酶
产生菌对农药有更好的降解效果, 特别是在低浓度
情况下酶的降解作用更有优势。Munnecke[ 7]将对
硫磷水解酶固定于多孔玻璃微粒制成固化酶, 固化
酶对对硫磷的 Km为 10 g /mL,净化率达 90%。用
共价结合的方式将对硫磷水解酶固定于硅胶微粒,
也具有良好的活性和稳定性 [ 8]。高慧丽等 [ 9]采用
溶胶凝胶法将乙酰胆碱酯酶固定在醋酸纤维膜上,
再将酶膜固定在聚四氨基钴酞菁 ( pCoTAPc)修饰
的玻碳电极 ( GCE)上, 对有机磷农药 (对硫磷、辛硫
磷、氧化乐果 )进行检测, 检测限分别可达 20
10
- 9
mo l/L、14 10- 9 mol/L和 11 10- 8mol/L;林
淦等 [ 10]把海藻酸钠溶液与甲氰菊酯降解酶均匀混
合,注入氯化钙溶液使其交联、聚合形成凝胶, 则形
成内包甲氰菊酯降解酶凝胶的固定化酶。
2 基因工程在农药降解菌中的应用
2. 1 农药降解基因工程菌的构建
随着基因工程的迅猛发展,人们希望通过基因工
程手段将农药降解酶基因或降解质粒克隆到合适的
宿主菌中并使其高效表达,构建降解谱广、降解彻底
的工程菌,为生物降解农药开辟新途径。通过分析污
染物生物降解的机制以及阻碍污染物降解的相关因
素,可以从 3个角度来构建高效基因工程菌 [ 11 ]: 一是
通过重组互补代谢途径、改变污染物代谢产物流向和
同源基因体外随机拼接来优化污染物的降解途径;二
是通过重组表面活性剂编码基因和重组污染物跨膜
转运基因来提高污染物的生物可利用性;三是通过
重组微生物抗性机制相关编码基因来增强降解性微
生物的环境适应性。K im等 [ 12]将对硫磷降解 Burk
holderia spJBA 3的基因片段克隆到大肠杆菌
DH10B中,并使其表达;杜欣军等 [ 13 ]利用土壤 DNA
提取技术,克隆出有机磷农药降解基因,使其在大肠
杆菌中大量表达,并获得高效重组表达蛋白。
发现具有较高降解活性的酶之后, 找到控制合
成此酶的基因,将其进行基因改造,使其酶的各种性
质得到优化,从而增强对环境的适应能力。然后利
用基因工程手段将农药降解酶基因或降解质粒克隆
到合适的宿主菌中并使其高效表达构建高效农药降
解菌,可提高降解菌降解农药的能力。Chang等 [ 14]
将从农杆菌得到的 opdA和从黄杆菌 (F lavobacterium
sp. )中得到的 opd分别构建了原核表达质粒, 并分
别转到大肠杆菌 E. coli DH10B中表达,对其表达产
物进行了研究。
利用基因工程将编码降解不同降解酶的基因克
隆到同一细胞中,并使其高效表达,能同时降解多种
不同类型农药。如 Lan等 [ 15]将 F lavobacterium sp.
的有机磷水解酶基因和 Culex p ip iens中的羧酸酯酶
基因 b1克隆在同一个细菌中,使其共表达, 两种基
因表达得到的酶的分子量分别为 35 kD和 65 kD。
这种工程菌可以同时降解有机磷农药、氨基甲酸酯
类农药和拟除虫菊酯类农药。
另外, 原生质融合技术在构建高效农药降解菌
中应用广泛。选择对自然环境更适应的极端微生物
如嗜冷菌或地区优势菌作为基因工程的宿主菌, 使
降解菌在环境中成为优势, 更有利于环境污染的降
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
解和治理。如果两种微生物在共同存在时才能降解
某种农药,单独存在时不能降解该农药,使可采用原
生质体融合技术融合两种微生物, 融合子具备两个
亲本的基因与优点,能够降解某种农药,这也是目前
污染治理工程菌制备一个主要途径。研究表明,农
药残留降解酶由降解质粒或染色体基因编码。目前
已经分离得到一些农药降解质粒,如呋喃丹质粒、六
六六质粒、2, 4D质粒、阿特拉津质粒、西维因质粒
等。降解质粒和染色体基因可能分别编码某一农药
不同降解途径的不同酶,两者相互补充。因此,可以
利用降解质粒的相容性,将降解不同农药的高效、专
一的质粒组合到一个菌株, 可使该菌株能同时降解
多种不同农药。此法存在的问题是原生质体融合技
术在构建工程菌过程中将不必要或对降解能力不利
的基因整合到菌株中,使得其降解能力有所下降。
22 DNA改组技术的应用
1994年,美国科学家 S temmer等 [ 16]介绍了在试
管内模拟达尔文进化的先进技术 DNA改组 ( DNA
shuffling)。这是基因分子水平的有性重组 ( sexual
recomb ination),与传统的突变技术如易错 PCR、定
点突变等相比, DNA改组技术不仅可加速积累有益
突变, 而且可使酶的两个或多个已优化性质合为一
体,是酶的体外定向进化的一种重要方法。DNA改
组无需知道酶的高级结构,便可提高酶的活性,在降
解菌研究中得到了广泛的应用。美国已经开始用该
技术去除农药污染物。加入强启动子可以提高降解
酶基因的表达, 有利于农药的降解。Ryu等 [ 17]在
Phanerochaete chry sosporium中获得木质素过氧化物
酶,此酶能够降解含芳香环农药,野生型的过氧化物
酶受 H2O2和高浓度的降解底物的抑制, 利用 DNA
改组技术获得此菌的突变体,提高了对 H 2O2的稳定
性,并且降解率提高了两倍。目前该技术在农药降
解菌研究方面的应用尚未见报道。
3 多菌株复合系的构建及应用
传统的农药降解微生物的研究局限于单一菌株
的培养,而农药的降解不是单个微生物完成的,并且
单个微生物不具备生物降解所需全部酶的遗传合成
信息,要彻底降解农药需要菌株群落。经过数种微
生物的协同作用,经过多步反应将农药完全降解,微
生物菌群对降解中产生的有毒物质有更好的抵抗作
用。将人工构建微生物的复合体系接种到农药污染
土壤中,能够改良已经被污染的土壤,在污染的土壤
环境中微生物更容易成为优势菌群。
从施用过农药的土壤环境中富集培养微生物,
得到土著微生物的复合系, 然后进行复合微生物体
系内部各个组分的特性研究, 再把各个有功能的组
分重新复合,组成一个新的复合体系,这一复合系不
仅具有强有力的功能,又更能适应土著环境。 Satsu
ma
[ 18]获得一降解阿特拉津高效复合菌群 AN4, 在
短时间内对阿特拉津有很好的降解效果,并且同时
能够降解西玛津和扑灭津;马放等 [ 19]将吉林化工厂
污水曝气池中的菌群驯化、筛选得到一组低温降解
苯胺高效菌群。该菌群对苯胺初始浓度不高于 800
mg /L驯化培养基中苯胺的降解率可以达到 100%。
构成的农药降解微生物对多种农药具有强烈的降解
能力, 但是其作用机理尚未清楚, 有待进一步的
研究。
4 微生物表面展示技术的应用
农药微生物降解随着基因工程的发展,在构建
高效工程菌方面取得了重大突破, 但是仍然存在着
障碍。大多数降解酶属于胞内酶, 胞内表达的降解
酶往往定位于细胞质或周质空间中, 这些降解酶分
子量较大而不能自由穿越细胞膜, 酶的降解活性不
能够充分发挥 [ 20 ]。利用细胞表面展示技术不仅可
以解决蛋白质跨膜转运问题, 并且可以随着细胞的
增殖而不断更新, 避免了细胞破碎和蛋白质的纯化
等繁琐步骤,也避免了在细胞破碎和蛋白纯化过程
中酶活性降低等弊端。
微生物细胞表面展示术是由 G eore在 20世纪
80年代中期开发的,是通过一段具有分泌转运功能
的蛋白质或多肽与外源蛋白融合表达,然后将外源
蛋白转运并镶嵌于细胞表面而实现外源蛋白的特定
功能。在农药微生物降解方面, 微生物表面技术主
要用来构建全细胞生物催化剂, 构建固定化的生物
反应器,筛选改良突变体,构建生物传感器用于环境
监测等。在构建全细胞生物催化剂方面, Sh imazu
等 [ 21]利用 KT2440菌株作为宿主菌,采用截短的冰
核蛋白 INPNC进行了表面展示 OPH,发现所展示的
OPH酶活性是用大肠杆菌体系的 10倍; 另外 Le i[ 22]
利用莫拉氏菌和恶臭假单胞菌 JS444菌株做为宿主
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2010年第 3期 杨柳等 :新技术在农药微生物降解中的应用
菌,采用截短的冰核蛋白 INPNC进行了表面展示
OPH, 发现不仅具有更高的表面展示效率, 同时可以
降解对硫磷水解生成的对硝基酚。在筛选改良突变
体方面, Cho等 [ 23]利用 DNA改组技术对 OPH基因进
行改造,将获得的 OPH基因突变体库利用细胞表面
展示技术展示到大肠杆菌 XL1B lue细胞表面进行筛
选 OPH对甲基对硫磷水解活性提高的突变体,经过
两轮 DNA改组和筛选,得到一个相对野生型而言对
甲基对硫磷水解活性提高 25倍的突变体 22A11。在
构建固定化的生物反应器方面, W ang等 [ 24]利用两种
不同的运载蛋白,在同一株大肠杆菌 XL1B lue表面
展示两种不同的功能蛋白质 OPH和 CBD, 获得的工
程菌株可以特异性牢固地吸附在纤维素上同时进行
有机磷化合物的降解。工程菌表面展示 OPH的活性
比单独表面展示 OPH时提高 5倍。在构建应用于环
境监测的生物传感器方面, 将表面展示有 OPH的莫
拉氏菌封装在两种水性的溶胶凝胶中,可进行光学检
测,封装的细胞也增加了酶活性的稳定性 [ 25]。
5 展望
不断涌现的各种新技术使农药微生物降解的研
究取得了可喜的成绩,但是应用生物技术,深入研究
农药微生物降解仍然有很长的路要走。随着现代生
物技术的不断发展, 农药微生物降解的研究也不断
深入, 特别是要应用现代生物技术,克隆与表达农药
降解酶基因,改造活性基因, 构建高效菌株, 加强环
境微生物种资资源和基因资源的收集与保护, 研究
多菌株复合体系降解机理,改造或构建新的菌种,提
高农药的降解速率,增强降解菌的环境适应性,加强
降解酶制剂及其固定化技术的开发与应用, 解决工
程菌实际应用的生态风险问题及安全问题等。随着
多学科先进技术的综合运用,将推动微生物在农药
降解方面的潜力得到更充分的体现。
参 考 文 献
[ 1] C how dhury A, Pradhan S, S ahaM, et al Impact of p est icid es on soil
m icrob iological param eters and possib le b iorem ed iat ion strateg ies. In
d ian Jou rnal ofM icrob iology, 2008, 48( 1 ) : 114127.
[ 2] 张丽青,姜红霞,闫艳春,等.工程菌及其固定化细胞对有机磷农
药的降解.环境科学与技术, 2008, 35( 5 ): 4548.
[ 3 ] Sath esh CP, Thath eyus A J. B iodegradat ion of acrylam id e em p loying
free and immob ilized cells ofP seud om onas a erug inosa. In ternational
B iodeteriorat ion and B iodegradation, 2007, 60( 2) : 6973.
[ 4] H a J, E ngler CR, W ild JR. B iodegradat ion of coumaphos, chlorferon
and d iethylth iophosphate us ing bacteria imm ob il ized in Caalginate
gel beads. B ioresou rce Techno logy, 2009, 100 ( 3) : 11381142.
[ 5] 谢明杰,李银霞,谢鲲鹏,等.氯苯高效降解菌固定化小球的制备
及其降解条件研究.辽宁师范大学学报, 2009, 32( 1) : 103105.
[ 6] 朱鲁生,辛承友,王倩,等.莠去津高效降解细菌 HB5的固定化
研究.农业环境科学学报, 2006, 25 ( 5) : 12711275.
[ 7] A lexanderM. Enzym atic d etox if icat ion ofw aste organophosphate pes
t icides. Agricu ltu ral and Food C hem istry, 1980, 28( 1 ) : 105114.
[ 8] M unn ecke DM. H yd rolys is of organophosphate insecticides by an im
m ob il ized enzym e sys tem. B iotechnology and B ioengineering, 1999,
21 ( 12) : 22472261.
[ 9] 高慧丽,康天放,王小庆,等. 溶胶 凝胶法固定乙酰胆碱酯酶生
物传感器测定有机磷农药.环境化学, 2005, 24( 6) : 707710.
[ 10] 林淦,韩萍,吴传兵.固定化农药降解酶对受污染水体的净化作
用.安徽农业科学, 2006, 34( 17) : 43714372.
[ 11 ] Mageong YC, Joseph FP. Sererospecific en zym at ic hydrolys is of
phosphorussu lfur bond in ch iral organoph osphate trim esters. B ioor
gan ic and Medicinal Chem is try Letters, 1994, 4( 2) : 14731478.
[ 12] K im T, Ahn JH, C hoiMK, et a.l C lon ing and expression of a para
th ion hydrolase gene from a soil bacterium B urkholderia sp JBA3.
Jou rnal of M icrob iology and B iotechnology, 2007, 17 ( 11 ):
18901893.
[ 13] 杜欣军,郭睿莉,张伟玮,等.有机磷降解酶的基因克隆与重组
表达.中国卫生检验杂志, 2009, 19( 5) : 995997.
[ 14] Chang H L, A lvarezCoh en L. B iodegradation of ind iv idual andm u l
tip le ch lorinated alph at ic hydrocarbons by m ethan eoxid izing cu l
tu res. A pp lied and Env ironm en tal M icrob io logy, 2002, 68 ( 7 ):
33713377.
[ 15] LanWS, Guet JD, Zhang JL, et a.l Coexp ress ion of tw o detox ifying
pest icided egrad ing en zym es in a gen et ica lly eng ineered bacterium.
International B iodeterioration and B iodegradat ion, 2006, 58
( 2) : 7076.
[ 16] Stemm erWP. Rap id evolu tion of p rotein in vitro by DNA shu ffl ing.
N ature, 1994, 370( 4) : 389391.
[ 17] K ang Ryu, Jung HK. Exp ress ion in yeast of secreted lign in p erox i
dasew ith im proved 2, 4d ich lorophenol degradab ility by DNA shu ff
ling. Jou rn al of B iotechnology, 2008, 135( 3) : 241246.
[ 18 ] K oji Satsum a. C omp lete b iodegradation of atraz ine by a m icrob ial
comm un ity isolated from a naturally d erived river ecosystem.
Chem osphere, 2009, 6( 35) : 15.
[ 19] 张红星,李茜茜,叶婷,等.细菌表面展示技术在有机磷农药降
解中的应用.生物技术, 2008, 18( 2) : 1915.
[ 20] Sh im azuM, NguyenA, Mu lchandan iA, et a.l C ell su rface d isp lay of
organ phosphorus hydrolys isP seudom onasputida using an ice nu cle
at ion protein an ch or. B iotechnology Progress, 2003, 19 ( 5 ):
79
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
16121614.
[ 21 ] Lei Y, M ulchandan i A, Ch enW. Im proved degradat ion of organo
ph osphoru s Nerve agent sandpn itroph enolby P seudom onasput ida
JS444 w ith su rface expressed organophosphorushydro lase. B iotech
nology Progress, 2005, 21( 3 ): 678681.
[ 22 ] Kang DG, LiL, H a JH, et a.l E fficien t cell su rface d isplay of organ
ophosphorous hydrolyse us ing Nterm inal dom ain of ice nucleat ion
protein in E scherich ia coli. Korean Jou rnal of C hem ical Engin eer
ing, 2008, 25 ( 4) : 804807.
[ 23 ] C ho CM, M ulchandan iA, Ch enW. Bacterial cell su rface d isp lay of
organophosphoru s hyd rolase for select ive screen ing of im proved hy
d rolysis of organophosph ate nerve agen ts. Applied and Environm en
ta lM icrob iology, 2002, 68( 4) : 20262030.
[ 24] Wang AA, ChenW, M u lchand an iA, et a.l Detoxif icat ion of organo
phosphate nerve agents by imm ob il ized dual fun ct ional b iocatalysts
in a cellu lose hollow f iber b ioreactor. B iotechnology and B ioengi
neering, 2005, 91( 3) : 379386.
[ 25] Yu D, Volpon i J, Chhab ra S, et a.l A qu eous so lgel en capsu lation of
genetically eng ineeredM oraxella spp. Cells for the detect ion of or
ganophosphates. B iosensors and B ioelectron ics, 2005, 20 ( 7 ):
14331437.
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