全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 4期
肝细胞永生化的研究与应用
薛梅 夏雪山
(昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明 650224 )
摘 要: 正常体外培养的细胞在体外有一定的寿命, 一般传代不超过 50代,被称为有限细胞系,但有些体外培养的细胞
可经过自发或外界因素的影响从凋亡危机中逃离出来,从而形成具有无限增殖能力的细胞系, 成为永生化细胞系。由于肝细
胞在体外增殖能力极弱,培养困难, 其应用受到较大限制, 而肝细胞经永生化后具有了无限增殖优势, 使其在肝细胞移植, 生
物人工肝以及药理、毒理学等研究方面有广阔的应用前景。就近年来肝细胞永生化方法及其应用作简要的综述。
关键词: 永生化 肝细胞 SV40 端粒酶 可恢复性永生化 肝细胞移植 生物人工肝
The Research and Application of Immortalized Hepatocytes
XueM e i X iaXueshan
(Faculty of L ife Sciences and T echno logy, Kunm ing University of Science and T echnology, Kunming 650224)
Abstrac:t Norma l cu ltured cells in vitro have lim ited life span in which its genera l passage is no m ore than 50 genera tions that
has been ca lled as fin ite ce ll lines H ow ever, som e cultured cells can escape from the pro liferation crisis spontaneously effected by sev
e ra l ex terna l factors to fo rm a lim itless pro lifera tion cell lines, w hich is ca lled as imm orta lized cell lines Because the proliferation of
hepatocytes in v itro is extreme lyw eak and d ifficult to be cu ltiva ted, thus applica tions have to be lim itedW ith the advantage o f un lim it
ed pro life ration, immo rtalized hepatocytes have been broad ly used in the hepatocytes transp lantation, b ioar tific ia l liver and pharm aco l
ogy as w e ll as tox ico logy stud ies In this paper, a br ie f ove rv iew on immortalized hepatocytes and its applica tions was g iven
Key words: Imm orta liza tion H epatocytes S im ian v irus 40 Te lom erase Reversib le immo rtalization H epatocytes transplan
tation B ioartificial liver
收稿日期: 20081214
基金项目:国家重大基础研究 973!课题 ( 2009CB522502) ,云南省科技平台项目 ( 2006PT04, 2006PT072)
作者简介:薛梅 ( 1984) ,女,陕西铜川市人,在读研究生,研究方向:树鼩原代肝细胞的培养与永生化
通讯作者:夏雪山,博士,副教授,硕士研究生导师; Ema i:l ol iverxia2000@ yahoo com cn
1 细胞永生化与永生化机制
细胞永生化 !一般是体外培养的细胞, 经过自
发或外界因素的影响从增殖衰老的危机中逃离出
来,形成具有无限增殖能力的细胞的过程 [ 1]。一般
而言, 体外培养的细胞经有限次分裂后,在肿瘤抑制
因子, 如 p53, pRb等作用下, 细胞进入衰老期 ( M 1
期 ) ,在此期细胞失去了对有丝分裂原的反应, 并且
已经产生抑制 DNA合成的蛋白质, 使 DNA合成停
止。细胞静止在 G1期,细胞开始衰老并最终死亡。
但有些病毒、原癌基因及抑癌基因突变体则可以使
细胞绕过 M1期继续生长 20~ 30代。此后, 细胞又
将会进入危机期 (M 2期 ), 细胞死亡率增加并且伴
随染色体异常,分裂的细胞会逐渐减少,绝大多数的
细胞发生调亡 [ 2]。只有极少数细胞在一些因素影
响下,可绕过 M2期获得永生化转化。
2 肝细胞永生化的方法
细胞永生化的方式主要有两种: ( 1)细胞自发
永生化指体外培养的细胞在无任何诱变剂存在的条
件下,自发出现的永生化的现象。但这种自发产生
的永生化时间长,发生率极低; ( 2)人工诱发永生化
指体外培养的细胞,在化学、物理和生物等各种致癌
因素的影响下发生的永生化。细胞人工永生化的操
作周期较短, 发生率高, 所使用的方法主要有以下
几种。
21 DNA致瘤病毒
DNA致瘤病毒如猴肾病毒 40( sim ian v irus 40,
2009年第 4期 薛梅等:肝细胞永生化的研究与应用
SV 40) T抗原、腺病毒的 E 1A和 E 1B基因、人乳头状
瘤病毒 ( human pap illomav irus, HPV )的 E 6和 E 7基
因, EB病毒 ( EpsteinBarr v irus, EBV )等, 这些 DNA
致瘤病毒均能使细胞绕过衰老期 (M 1期 ), 继续传
代至大约 20代 [ 3]。
SV 40由猴肾病毒的结构蛋白 VP1VP2及 VP3
和 2种抗原 ( LT和 st)组成 [ 4] , 是最常用的永生化病
毒癌基因,现已经被广泛用于人和动物 (主要是猪 )
中的各种细胞类型, 包括肝细胞的永生化 [ 5]。其中
LT抗原为细胞转化启动所必需的,对转化起决定作
用,而且转化细胞表型的维持需要 LT抗原的连续
表达。 st抗原非细胞转化所必需, 但可对细胞转化
起到加强作用, 与 LT共同维持细胞转化的表型。
SV 40介导的细胞永生化技术是用 SV 40基因表达型
的质粒转染细胞, 所表达 SV 40的 LT抗原可以和
p53、pRb蛋白结合并使之灭活, 使细胞度过 M1衰
老期, 达到有限代次增殖。 Fukaya等 [ 6 ] 用携带
SV 40T抗原的 pSV3neo质粒转染人胎肝细胞,获得
了能在体外多次传代且生长良好的 OUMS29永生
化细胞株,接种裸鼠体内未见形成肿瘤。但绝大多
数 SV40转化细胞的端粒不断缩短,经有限代次后,
细胞不再增殖, 只有极少细胞 ( 1 ∀ 107 )可以度过
M 2危机期重新开始增殖 [ 7] , 据推测可能是某些基
因突变的导致形成了永生化的细胞系。
22 端粒酶与端粒酶催化亚基
端粒是位于真核生物染色体末端的具有特殊功
能的 DNA重复片段,由富含 G的序列和相关蛋白组
成。正常二倍体细胞随着细胞分裂次数的增加,端粒
逐渐缩短,当缩短到一定程度时,端粒不能再维持染
色体稳定,细胞就会丧失增殖能力,开始凋亡,端粒的
长度与细胞永生化密切相关 [ 8]。端粒酶 ( telomerase)
为逆转录酶,由端粒酶 RNA( TR )、端粒酶相关蛋白和
端粒酶催化亚基 ( TERT ) 3部分组成, 端粒酶以自身
RNA为模板,催化合成端粒 DNA并加到染色体末端,
使端粒延长。人正常体细胞包括肝细胞,都没有端粒
酶活性 [ 9] ,若将对端粒酶的活性起着重要的调控作用
的端粒酶催化亚基 hTERT 基因,导入细胞诱导端粒
酶活性,即可延长细胞体外培养寿命,使细胞永生化。
W ege等 [ 10]报道 hTERT 基因转染人胎肝细胞
后,使细胞端粒延长,从而超越复制衰老期, 该细胞
在体外能传代 300多代,并且能维持肝脏特有的功
能, 如合成肝细胞生长因子及其受体、转录因子、白
蛋白、葡萄糖 6磷酸酶、合成肝糖原及尿素。该永
生化细胞没有显示出致瘤性, 并且没有检测到原癌
基因 cMyc的上调,细胞移植入免疫缺陷的小鼠体
内未能致癌。
目前,常用 SV40T抗原和 hTERT基因共同转染
细胞。SV 40T抗原用来延长细胞寿命, 使细胞绕过
M1衰老期, 而 hTERT 基因用来维持端粒的长度和
稳定,使细胞绕过 M2危机期,以此来获得更为稳定
的永生化细胞系。
23 可恢复永生化
永生化肝细胞因增殖优势,具有良好的应用前
景, 但由于永生化肝细胞所携带的肿瘤基因及其表
达产物可能会引起肿瘤发生, 不能完全保证其在临
床治疗中的安全性,可恢复永生化则为解决这一问
题提供了新的思路和方法。可恢复永生化是将永生
化基因导入原代细胞获得永生化细胞株后, 当其在
体外繁殖获得所需细胞数目时, 再利用特异性位点
重组技术切除永生化基因, 使细胞株恢复到永生化
以前的状态 [ 11]。目前所用的特异性基因位点重组
系统是 C re / loxP系统。C re是一种存在于 P1细菌
噬菌体中,但在哺乳动物细胞中也能有效发挥作用
的重组酶; loxP位于 P1细菌噬菌体染色体交叉部
位,由 2个反向重复序列和 1个 8 bp间隔区组成。
C re酶可特异性识别核酸序列 loxP位点, 使得 2个
loxP位点之间的 DNA序列发生重组, 从而切除 2个
loxP位点之间的 DNA序列。
日本 Kobayashi等 [ 12~ 14]将携带有 SV40T抗原、
单纯疱疹病毒胸苷激酶 ( herpes simplex virusthym i
d ine k inase, HSVTK )及潮酶素 (链霉菌产生的氨基
糖苷类抗生素 )抗性基因, 并且两侧连接 loxP位点
的重组 SSR69逆转录病毒导入原代成人肝细胞, 成
功地建立了可恢复的永生化肝细胞株 NKTK3, 能
稳定生长于含潮霉素的培养基中, 并且呈分化的肝
细胞形态。利用表达 C re重组酶的重组的腺病毒载
体转染肝细胞, SV40T基因能被有效的切除, NKTK
3细胞不再表达 SV40T, 肝细胞株恢复到永生化前
的状态,且分化程度更高。但 SV40T介导的细胞增
殖无法避免细胞的危机期,切除癌基因后,端粒的耗
33
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
损没有被阻止,从而限制了可得到的活细胞数,所以
尚无法获得足够数量的回复细胞以供临床应用;此
外,腺病毒介导的细胞毒作用对细胞损伤也相当大,
而且不能去除由腺病毒结构蛋白造成的延迟性污
染。Kobayash i等又用携带有人端粒酶逆转录酶催
化亚基 hTERT基因,其两侧为一对 loxP重组位点的
逆转录病毒载体转染人肝细胞,再以编码三苯氧胺
依赖的 C re重组酶的质粒转染永生化细胞,成功地
建立了 16T3可恢复永生化人肝细胞株。该细胞
株培养 24 h后, 在培养基质中添加浓度为 500 nM
的 4羟基三苯氧胺诱导 7 d,细胞可对永生化基因进
行自我切除重组, 恢复到正常状态。恢复的 16T3
的细胞与正常的人肝细胞进行比较, 白蛋白的生成
量和利多卡因的代谢率, 分别是正常细胞的 32%和
50%。将可恢复性的 16T3细胞移植到患有急性肝
功能衰竭的猪体内, 能有效地延长猪的存活时间。
该方法在永生化肝细胞的克隆中预先整合了能表达
三苯氧胺依赖的 Cre重组酶的 DNA结构,不需要重
组酶基因的再次转化 [ 15 ]。
3 肝细胞永生化的应用
由于永生化细胞在体外可多次传代, 且具有相
对稳定的增殖特性和功能状态,可作为细胞工程和
组织工程等研究领域的标准细胞。
目前,原位肝移植 ( ortho top ic liver transplan ta
t ion)是治疗晚期急性肝脏功能衰竭及代谢障碍的
最佳选择, 但供体器官有限 [ 1 6]限制了该治疗方法
的应用。近年来, 国内外很多学者致力于研究以
体外培养的肝细胞为主体, 构建的生物性人工肝
脏 ( b ioart ific ial liver, BAL)用于代替肝功能衰竭
或者代谢障碍的肝脏。正常的人肝细胞是最为理
想的肝细胞移植和生物人工肝脏的主要细胞 [ 17] ,
尽管异源性肝细胞如猪肝细胞, 大鼠肝细胞移植
虽然也取得了一些成果 [ 18] , 但动物源疾病以及异
种蛋白反应一直是未能解决的问题。由于肝细胞
体外繁殖极弱, 无法满足肝细胞移植或生物人工
肝都需要的细胞数目, 因此肿瘤源性肝细胞如
H epG2
[ 19]、C3A [ 20]细胞也成为肝细胞移植的一种
重要细胞来源, 但是肿瘤性肝细胞潜在的致瘤性
仍不容忽视。
永生化肝细胞作为理想的肝细胞移植或生物人
工肝主体细胞有着其独特的优势, 永生化细胞无限
的繁殖能力较好解决了体外肝细胞繁殖力弱的这一
难题,为肝细胞移植和 BAL提供了数目多且稳定的
细胞来源。但由于肝细胞永生化的同时涉及癌基因
的表达,因此治疗的安全性受到一定的质疑。K oba
yash i等 [ 21, 22] 所建立的可恢复的永生化肝细胞
MMNK1,当肝细胞数量繁殖到适合移植的数量时,
敲除 SV40T抗原基因或 hTERT基因,使肝细胞恢复
到永生化前的状态,大大降低了永生化肝细胞潜在
癌变的可能性,使永生化肝细胞应用于肝细胞移植
或 BAL更为安全可靠。永生化肝细胞株还可作为
细胞分化与细胞生物学、肿瘤发生学、药理学、毒理
学等研究领域的有效工具, 有助于体外实验的稳定
开展。
永生化肝细胞应用前景广阔,但永生化细胞不
同于正常的肝细胞,通常被认为是正常体细胞向癌
细胞过度的一种中间状态细胞, 与正常体细胞和癌
细胞都存在某些相似的地方 (表 1)。
表 1 永生化细胞与正常细胞、癌细胞比较
正常细胞 永生化细胞 癌细胞
致瘤性 无 无 有致瘤性
核型 二倍体核型 多为二倍体核型 异核型
增殖能力 增殖能力有限 增殖能力无限 增殖能力无限
接触抑制 有 无 无
端粒长度 随有丝分裂而缩短 相对稳定 相对稳定
由于细胞之间的接触抑制的丧失, 从而使细胞
形态发生了变化, 其核型也非正常的二倍体核型。
如何更好控制永生化肝细胞的致瘤性,稳定体外永
生化肝细胞的表型,以及提高肝细胞的分化功能等,
都将是今后永生化研究的热点。
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