全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第1期
收稿日期:2007-07-10
基金项目:国家烟草专卖局烟草育种战略性课题“优质高香气烤烟新品种选育(110200601003)”资助
作者简介:任民(1979-),男,在读博士研究生,研究方向为烟草品质遗传育种
通讯作者:贾兴华,男,研究员,博导,长期从事烟草遗传育种研究,E-mail:xhjia@sohu.com
近年来分子标记技术得到了快速发展,新型分子标记不断出现。2001年 Li和 Qurios[1]报道了 SRAP
(Sequence-RelatedAmplifiedPolymorphism,序列相关扩增多态性)标记,该标记根据 ORF(OpenReading
Frames,开放阅读框)中外显子区域富含 GC而内含子区域富含 AT来设计 2个 18~20个核苷酸的引物,由
于内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大,从而扩增出基于内含子与外显子的
SRAP多态性。2003年 Hu和 Vick[2]报道了 TRAP(TargetRegionAmplifiedPolymorphism,靶位区域扩增多态
性)标记,它是一种在 SRAP基础之上发展起来的新型标记,该技术应用生物信息学手段和表达序列标签
(EST)数据库的信息,设计 2个 18核苷酸的引物,其中一个为固定引物,通过数据库中的目标 EST序列设
计;另一个为随机引物,是一段核心区富含 AT或 GC的随机序列,扩增在候选目标基因序列区域的多态
Bassam和Sanguineti银染方法在SRAP和TRAP
标记中的比较研究
任民 贾兴华 蒋彩虹 杨爱国 王日新
(中国农业科学院烟草研究所,青岛 266101)
摘 要: 银染作为一种重要的DNA染色方法,对分子标记检测有重要影响。SRAP标记和TRAP标记是两种较为
新型的分子标记,近年来得到了广泛应用,尤其在缺少遗传图谱的物种中应用价值更大。以普通烟草种(Nicotiana
tabacumL.)烤烟和香料烟品种作为供试材料,对 Basam和Sanguineti两种银染方法,在标记检测效率、成本及染色效果
等方面进行了研究,并对其在SRAP标记和TRAP标记中的应用进行了探讨。结果表明,Sanguineti银染法比Basam银染
更为简便、经济,染色照片的色阶图说明Sanguineti染色方法的背景与扩增带区分明显,能够清楚地读带;且该方法能够
扩增出很好的SRAP和TRAP标记谱带。因此,推荐在SRAP和TRAP标记检测中采用Sanguineti银染方法。
关键词: 银染 SRAP标记 TRAP标记
ComparisonStudyofBassam andSanguinetiSilverStainingin
theDetectingofSRAPandTRAP
RenMin JiaXinghua JiangCaihong YangAiguo WangRixin
(TobaccoResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Qingdao266101)
Abstract: ThesilverstainingasakindofDNAstainingmethodsisimportantformolecularmarkerdetecting.In
ordertoevaluatetheapplicationoftheBasam andtheSanguinetisilverstainingmethodsinthenovelmolecular
markersSRAPandTRAPwhichhavebeenwidelyappliedinmanyfieldsrecently,twokindsofsilverstainingwere
comparedinthedetectingeficiency,expendsandtheimagesofsilverstainingwithlevelsbyPhotoshopcomputer
software.TheapplicationinSRAPandTRAPwasalsostudied.TheresultsindicatedthattheSanguinetisilverstaining
methodwassimpler,moreeconomy,andeasiertodistinguishthebandsofPCR amplicationfrom backgroundthanthe
Basam method.ItalsoshowedthattheSanguinetisilverstainingmethodhadaverygoodefectonSRAPandTRAP
molecularmarkers.
Keywords: Silverstaining Sequence-Relatedamplifiedpolymorphism Targetregionamplifiedpolymorphism
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
性。由于这两种标记以生物信息学为基础,开发简便,成本较低,对于遗传图谱不完善的物种,有着重要的
应用价值。
烟草(NicotianatabacumL.)作为生物工程开拓性技术研究中的模式植物,由于基因组庞大,结构复杂,
重复序列较多,迄今,不仅缺少合适的分子标记和完善的遗传连锁图[3~5],同时在分子生物学和基因组学上
的研究也较为困难。SRAP和 TRAP标记由于具有简便、中等产量、产物稳定、在基因内扩增、易于分离及测
序等优点[6],在烟草分子生物学和基因组学研究中,得到越来越广泛的重视。
随着分子标记技术的创新,应用层面的扩展,其检测方法也在不断发展。由于银染技术简便、低污染,
因而在检测手段日益多样化的今天仍然得到广泛的应用,成为一种重要的 DNA染色法。银染的原理是利
用银离子可与核苷酸结合,在碱性环境下甲醛能使银离子还原从而使凝胶中的 DNA得以显现[7,8]。当前较
常用的是 Bassam[9]和 Sanguineti[10]两种银染法,已经有学者对这两种银染方法用直接观察等感观手段进行
了比较实验,且所检测的分子标记主要是 SSR[7,8],还未见到对 SRAP和 TRAP这两种新型分子标记进行深
入比较研究的报道。由于 SRAP和 TRAP与 SSR在扩增带的数量和范围上存在较大差异,比如,SRAP和
TRAP标记中,每次 PCR扩增产物能产生十几条甚至几十条扩增带,片段从 50bp到 1kb左右[1,2],其谱带范
围远远超过了 SSR标记。因此,选择简便、经济且效果良好的谱带染色方法非常重要。在对 Bassam和
Sanguineti两种银染方法进行比较研究的基础上,对其在 SRAP和 TRAP标记中的应用进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 供试材料
选择普通烟草烤烟品种大白筋 599、K326、NC89、中烟 90和香料烟品种巴斯玛、沙姆逊作为本研究的
供试材料。
1.2 DNA提取
将供试材的种子点播于培养皿内,然后放置在 27°C恒温培养箱中,10d后取少量幼苗,用稍加改进的
CTAB法提取基因组DNA[11],紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量。稀释至30~50ng/μl,-20°C
保存备用。
1.3 分子标记
本研究应用 SRAP和 TRAP标记扩增
产物进行银染技术对比研究。引物序列来
自公开发表的论文[1,12],由上海生工生物工
程技术服务有限公司合成,部分引物序列
(表 1)。
1.4 PCR扩增和电泳方法
PCR总反应体系为 15μl,其中 30~
50ng/μlDNA样品 3μl,10×reactionbufer(KCl)1.2μl,25mMMgCl20.8μl,25mMdNTPs1.2μl,10μmol/L正反
向引物各 1.2μl,TaqDNA聚合酶 1U。所用试剂购自 MBI。
PCR反应在 96孔 MJResearchPTC-100型基因扩增仪上按以下程序运行:首先 94°C预变性 5min;前 5
个循环程序为:94°C45s,35°C45s,72°C1min;随后的 35个循环为:94°C45s,50°C45s,72°C1min;最后
72°C延伸 7min,4°C保持[1,2]。
完成 PCR循环 48h内,向反应混合液中加入 LoadingBufer(10mMEDTA[0.5M,pH=8.0],98%甲酰胺,
0.025%溴芬兰,0.025%二甲苯青)3μl,然后 95°C变性 5min。取 5μlPCR产物在 6%聚丙烯酰胺凝胶上恒
电压 1500v电泳 90min。
1.5 Basam银染方法
表 1 部分 SRAP和 TRAP标记的引物序列
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固定液:10%冰醋酸溶液 1L;银染液:1gAgNO3,1.5ml37%甲醛,加去离子水定容到 1L;显影液:30g/L
Na2CO31L,冷却到 4°C,使用前加入 1.5ml37%甲醛、200μl10mg/ml硫代硫酸钠。
银染程序为:(1)加入 1L固定液脱色,轻摇至 LoadingBufer颜色褪去;(2)去离子水清洗 10min;(3)1L
银染液,银染 30min;(4)去离子水冲洗 5s;(5)1L显影液,轻摇至显带;(6)在固定液中定影 3~5min;(7)用
去离子水清洗胶面至清洁[7]。
1.6 Sanguineti银染方法
银染液:0.1%AgNO3溶液 1L;显影液:16gNaOH,8ml37%甲醛,加去离子水定容到 1L;终止液:0.75%
Na2CO3溶液 1L。
银染程序为:(1)去离子水冲洗 15s;(2)银染 8min;(3)去离子水冲洗 15s;(4)在显影液中轻摇至显带;
(5)放入终止液,终止显影[7]。
1.7 图像采集和分析方法
显影完成之后,将聚丙烯酰胺凝胶放置在阴凉通风处 3~4h,待完全干燥后,放在透射式看片机上,用
数码相机采集图像。照相时避免光线干扰,保持成像的真实度。
采用 AdobePhotoshop图像处理软件对电泳照片的色阶进行分析,操作步骤为:图像 (Image)→调整
(Adjust)→色阶(Levels)。色阶图的横轴表示由深至浅的各种颜色,纵轴表示某个颜色的丰度(htp:/www.
adobe.com/designcenter/photoshop/articles/phs8levels.html)。
2 结果与分析
2.1 两种银染方法的效率和成本比较
首先在银染步骤上,对 Sanguineti银染方法和 Bassam银染方法进行了比较,如图 1所示,由于
Sanguineti法不需要固定,且水洗和银染的时
间短。因此,Sanguineti法较 Bassam法简单,
全部过程 Sanguineti法能比 Bassam法大约节
省 56min;然后从试剂的种类和用量对两种银
染方法进行了比较,由表 2可知,两种银染方
法的大部分试剂相同,但 Sanguineti法不用固
定,所以无需冰醋酸。两种银染方法最大的区
别在于:Bassam法使用弱碱(Na2CO3)显影,而
Sanguineti法使用强碱(NaOH)显影。在试剂
用量上,除 37%甲醛一项以外,Sanguineti法的试剂量均少于 Bassam法。通过以上比较可知,Sanguineti法
比 Bassam法简便经济。
2.2 DNA标准分子量(Marker)的银染效果比较
DNA标准分子量(Marker)在这两种银染方法中均能取得良好的染色效果(图 2)。Sanguineti法的背景
色较 Bassam法深一些。在 Sanguineti法的色阶图
中,有 B、C两个主峰,其中 B为 Marker带形成的
峰,又由两个小峰组成,C为凝胶背景形成的峰。在
Bassam法的色阶图中只有一个主峰 A,在这个主
峰内包含着 Marker带的颜色和凝胶背景的颜色。
图 2表明,Sanguineti法的扩增带和背景差异十分
明显,而 Bassam法的凝胶颜色虽然较浅,但和扩增
带的颜色差异较小。
图 1 比较两种银染方法的步骤与用时(单位:min)
表 2 两种银染方法所用的试剂
图 2 分别用 Bassam法(左)和 Sanguineti法(右)银染
得到的 500~100bp标准分子量(Marker)照片和色阶图
任民等:Bassam和Sanguineti银染方法在SRAP和TRAP标记中的比较研究 115
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2.3 SRAP和 TRAP扩增产物的染色效果比较
从图 3可知,在本研究中 SRAP或 TRAP的扩增产物用 Bassam和 Sanguineti两种银染方法均能取得良
好的扩增带。Bassam法的背景色较浅,但在色阶图上只有一个主峰。虽然 Sanguineti法的背景色较深,但在
色阶图上有两个主峰,a峰为扩增带颜色,b峰为背景颜色。说明 Sanguineti法的扩增带颜色与凝胶的背景
色区别十分显著。
Bassam法的 PCR扩增带有自上而下逐渐变浅的趋势,从图 3可以看到,上部带颜色较深,而下部带颜
色较浅。从图 4中左边的色阶图上,可以更加明显的看到这一变化,上部色阶图的主峰较缓,说明扩增带的
颜色占有较大比例,但自上而下,主峰逐渐变陡,说明背景色的比例越来越大,在下部色阶图上,已经基本
只剩背景色;Sanguineti法的 PCR扩增带颜色较为均匀,图 4右边的色阶图中,上、中、下 3部分始终可分
出 2个主峰,说明扩增带与背景色能够别被良好的区别。
图 3 PCR扩增产物的染色照片色阶图 图 4 凝胶照片上、中、下 3部分的色阶图
3 讨论
3.1 SRAP和 TRAP标记对银染技术的要求较高
染色方法的优劣直接影响了扩增条带的判读,从而决定了实验结果的准确性。在甘蓝[1]、棉花[13]、稻瘟
病[14]、南瓜[15]、黄瓜[16]、西葫芦[17]、油菜[12]、菜豆[18]、小麦[19,20]、莴苣[21]、向日葵[22]等研究中发现,SRAP和 TRAP
在扩增谱带上与 SSR等标记有较大差异:一方面,SRAP和 TRAP标记的扩增带丰富,多态性较高,平均每
个引物组合能产生 10~20条以上的扩增带,多态性比例最高在 60%以上;另一方面,SRAP和 TRAP标记的
扩增片段分布在 50bp~1kb左右的范围内。因此,SRAP和 TRAP标记对银染技术提出了较高的要求:(1)染
色技术应尽可能经济简便,因为 SRAP和 TRAP标记正广泛的应用于一些需要大规模引物筛选和群体扩增
的研究中,例如,种质资源的鉴定评价[13,15,17]、遗传图谱构建[1,16]、重要性状基因定位[18~20]、指纹图谱分析[21]
等;(2)扩增带应该清晰易读,从而方便带型统计和查找多态性条带,(3)染色应该比较均匀且能反应出扩
增量的差异,颜色深浅不能因为位置的不同而改变。
3.2 Sanguineti法更适合 SRAP和 TRAP标记检测
研究发现 Sanguineti银染方法比 Bassam银染方法更适合 SRAP和 TRAP标记。首先,Sanguineti法的
步骤较少,时间短,全部染色显影过程比 Bassam法缩短了近 1h,从而节省了大量的时间;其次,Sanguineti
法较为经济,因为 Sanguineti法中各种试剂的用量普遍少于 Bassam法,同时 Sanguineti法的银染液、显影
液和终止液均可多次使用,重复 3~4次以后,染色效果基本不变,而 Bassam法的银染液,特别是显影液都
不宜重复使用[8];再次,Sanguineti法的染色效果较为均匀且清晰易读,上部带同下部带没有明显的颜色变
化,更有利于 SRAP和 TRAP标记染色,而 Bassam法染色不够均匀,明显存在下部带染色过浅的现象;最
后,Sanguineti法对变性或非变性胶均可染色,但是 Bassam法无法用于非变性胶(蒋彩虹,个人通讯)。综上
所述,建议 SRAP和 TRAP标记染色采用 Sanguineti法。
3.3 计算机软件使分析手段更加灵敏
在以往的研究中,染色效果的比较主要依靠直接观察,普遍认为 Sanguineti法的背景较深,是该银染
方法的缺点[7,8]。但是,在实际研究中较深的背景色并没有影响到 Sanguineti法的应用。为此,通过计算机软
(下转第121页)
左图采用 Bassam银染方法,右图采用 Sanguineti银染方法 左图采用的是 Bassam法,右图采用的是 Sanguineti法
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件分析了两种银染照片的色阶图,结果发现虽然 Sanguineti法的背景色较深,但在色阶图上出现背景色和
扩增带两个峰,而 Bassam法的背景和扩增带在色阶图上混为一个较大的峰。上述结果表明,Sanguineti法
的背景色和扩增带区别非常明显,从而应用 Sanguineti法更容易判读 PCR扩增带,这与以往通过感观判断
得出的结论有所不同,同时也说明,利用计算机技术等现代化检测分析手段,可以使我们的认识更加深入,
研究结果更加精确。
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张燕等:pGEM-8Hepc克隆载体的构建与序列分析 121