全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
Rea l2time PCR技术的应用研究进展
李珊珊　王加启　李旦　董晓丽　赵圣国　卜登攀
(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 动物营养学国家重点实验室 ,北京 100193)
　　摘 　要 : 　Real2time PCR (RT2PCR)是基于 PCR,利用不同的荧光检测定量核酸的技术 ,广泛应用于基因分型 ,单核苷酸多
态性 ,等位基因突变检测等方面。综述了 RT2PCR作为一种检测技术 ,在医学、食品、环境微生物等不同领域的应用进展。
关键词 : 　Real2time PCR　基因诊断 　基因检测 　基因表达
Research Progress in the Application of Real2time PCR
L i Shanshan　W ang J iaqi　L i Dan　Dong Xiaoli　Zhao Shengguo　Bu Dengpan
( S ta te Key Laboratory of Anim al N utrition, Institute of Anim al Science, Chinese Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100193)
　　Abs trac t: 　The detection and exp ression analysis of gene ( s) in real2time has extended to its tremendous app lication in quantita2
tive genotyp ing, genetic variation of inter and intra organism s, early diagnosis of disease, forensic1 Various aspects of real2time PCR,
including technological refinement and app lication in all scientific fields ranging from medical to environmental issues, food, were re2
viewed1
Key wo rds: 　Real2time PCR　Gene diagnosis　Gene detection　Gene exp ression
收稿日期 : 2009202227
基金项目 :“十一五”国家奶业科技支撑计划 (2006BAD04A08209)
作者简介 :李珊珊 (19852) ,女 ,黑龙江人 ,硕士研究生 ,研究方向 :牛奶质量改良 ; E2mail: leeshanshanshan@1631com
通讯作者 :王加启 (19672) ,男 ,博士生导师 ,从事反刍动物营养和牛奶质量改良研究 ; E2mail: wang2jia2qi@gmail1com
　　聚合酶链式反应 ( PCR)是体外选择性扩增特定
基因片断技术 ,被广泛应用于获取目的基因或基因片
段 ,以及临床基因诊断等领域。但常规 PCR无法对
扩增反应进行实时检测 ,通过借助电泳等手段对扩增
终产物进行分析 ,不仅费时、费事、易污染 ,且无法对
起始模板准确定量。20世纪 90年代中期出现的 Re2
al2time PCR技术 (RT2PCR )使上述问题得到较好解
决 ,即在反应体系中加入荧光分子 ,通过荧光信号的
按比例增加来反映 DNA量的增加 ,实现了 PCR产物
的实时检测 ,并为核酸定量带来了革命性的飞跃。
通常 ,实验室用巢式 PCR来检测环境微生物。
但是为了满足更多需求 ,多种 PCR方法得到发展 ,并
用于商业途径来检测和定量各种生物体的 mRNA。
Klee等 [ 1 ]运用 RT2PCR法检测出了伯纳氏立克次
氏体。
1　RT2PCR在医学中的应用
目前 ,实时定量技术已经成为快速临床诊断的
重要方法。有害药物反应 (ADR )是发病率与死亡
率的主要原因 , RT2PCR与其它分子技术相结合 ,使
得治疗干涉、对药物的反应诊断成为可能。但是 ,即
使达到建立因人用药的目的 ,也不可能排除所有的
不确定因素 ,这就需要分子技术在临床诊断上带动
其它领域的研究。
111　癌症的检测
癌症是遗传基因多态性的聚积、变异或者是部
分机体的基因多态性变异造成的 ,如 DNA修复、信
号基因的增长 [ 2 ]。尽管成像诊断技术、外科手术以
及药物治疗不断发展 ,但是癌症死亡率仍旧很高。
由于变异细胞与正常细胞很难区分 ,使得早期癌症
的诊断很难 ,而用 RT2PCR技术可以在低数量样品
中定量检测出特异 DNA [ 3 ]。采用探针对标志基因
的表达进行检测时 ,单个标志基因的灵敏度偏低 ,因
此不适于临床检测。而对于多重基因所表达所引发
的常规恶性疾病 ,如膀胱癌、乳癌、直肠癌等可以做
到在早期进行精确诊断 [ 4 ]。目前 ,许多临床诊断试
剂盒已经上市 ,而且这将促进实时定量技术在其它
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2009年第 8期 李珊珊等 : Real2time PCR技术的应用研究进展
疾病诊断领域的发展。
112　病毒微生物的检测
实时定量技术可以用来检测或定量感染人类的
病毒微生物。在医学临床上已用 TaqMan技术诊断
各种病原体 ,如流感病毒、结核分支杆菌、大肠杆菌、
性病病原体和猪伪狂犬病病毒等 [ 5～7 ]。HSV1 与
HSV2的检测也可以用 TaqMan探针检测 [ 8 ]。最近 ,
针对 HSV DNA的聚合酶基因设计引物与探针 ,对
HSV1与 HSV2表型进行检测 ,并能对这两种表型进
行定量 [ 9 ]。在检测疱疹病方面也显示了定量的灵
敏性 [ 10 ]。RT2PCR可以较为精确地检测病毒与宿主
之间的相互作用 ,并提供了一种可靠的方法研究抗
病毒复合物的功效 [ 11 ]。
113　细菌的检测
常规的 PCR可以验证细菌病原体的高变异性 ,
而 RT2PCR可以达到更好的效果。荧光杂交探针可
以快速检测较低数量的细菌 DNA。在测定临床样
本中的细菌和难以培养或生长缓慢的细菌时 , RT2
PCR优于其他方法 ,如免疫测定法和培养法等。并
且 , RT2PCR可以用于定量检测肠球菌、大肠埃希菌
和 O139群霍乱弧菌等 [ 12, 13 ]。
早期鉴别分枝杆菌感染的常规方法缺乏特异性
和灵敏度。测定从培养或临床样本中获得的耐药性
的突变体基因 (异烟肼、利福平、乙胺丁醇 ) ,采用
RT2PCR法代替了原来的肉汤培养基稀释法 [ 14 ]。一
些 RT2PCR测定方法已经用于快速测定芽孢杆菌属
引起的炭疽 [ 15 ]。然而 ,临床研究需要进一步研究能
够快速检测人体病原体的方法。
114　真菌的检测
感染人类的真菌主要是曲霉类 ,念珠菌属和金
罗维氏肺孢子虫。传统方法检测真菌是采用培养 ,
组织切片或表型、生化检测、显微镜方法、传统
PCR、核酸探针以及稀释涂板等。这些方法的时效
性不高 ,实时定量方法可以快速检测多种临床真菌 ,
如球孢子菌属、耳霉属、隐球菌属、组织胞浆菌属、肺
囊虫属、副球孢子菌属和葡萄状穗霉属等 [ 16 ]。
115　原虫的检测
随着 RT2PCR和其他技术的发展 ,使得人们能
更为容易的精确定量原虫数量以及进行临床诊断。
临床上 , RT2PCR用于检测阿米巴性的痢疾 [ 17 ]和孕
妇羊水内的住血原虫病 [ 18 ]等。此外 ,随着基因组测
序的发展 ,需要寄生虫学家进一步研究那些已经进
行了小片段基因组测序的生物体 ,并进行必要的基
因注释。
2　RT2PCR在食品安全方面的应用
食物传播性病毒感染已经成为人类广泛传播的
疾病之一。霉菌毒素是主要的食品污染物 ,引起能引
起多种疾病而备受关注。为了解决这个问题 ,人们从
食物链中寻找快速、低成本、食品传播病原体的自动
诊断方法。欧洲标准协会建立了食物传播病原体的
PCR测定方法。由于 RT2PCR在一个封闭的管里进
行 ,能在种属水平上高通量测定梭霉菌数 [ 19 ]。
实时 SYBR Green L ightCycler PCR (LC2PCR )可
以测定 17种食物或水传播的病原菌 [ 20 ]。进行测定
的病原菌主要有 :大肠杆菌 ,肠毒性的大肠杆菌 ,肠
聚集性大肠杆菌 ,沙门氏菌 ,志贺氏菌属 ,小肠结肠
炎耶尔森氏菌 ,假结核耶尔森氏菌 ,空肠弯曲杆菌 ,
霍乱弧菌 ,气单胞菌属 ,金黄色葡萄球菌和产气荚膜
梭状芽孢杆菌。在用 RT2PCR监测时 ,既可以用纯
化的 DNA ,也可以用直接从临床病人体内或者培养
基培养中粗提产物 [ 21 ]。轮状病毒和胃肠炎病毒是
重要的食物传播性病毒 [ 22 ] ,可以用 RT2PCR法对其
进行定量。现在有 20亿人被乙肝病毒感染 , 315千
万人为病毒携带者。如何运用 RT2PCR法有效的从
血清和血浆中检测出乙肝病毒 ,需要进一步的研究。
3　RT2PCR在环境方面的应用
RT2PCR能够检测遗传物质的多变性。环境污
染使我们亟待找到一种清除污染物质的方法。偶氮
还原酶可以分解难降解的偶氮染料。 Suzuki等 [ 23 ]
从芽孢杆菌属 OY122中提取出偶氮还原酶基因 ,进
而使降解白色污染的胞外酶成为遗传工程的目的
菌种。
植物氧化酶可以提高微生物降解污染物质的能
力 ,因为植物可以提供适于微生物群居的环境 ,使微
生物可以有效的降解污染物。例如 ,从杂色革盖菌
中提取出过氧化物酶基因 ,在烟草中表达 ,该基因可
以控制净化环境相关酶的表达 [ 24 ]。自然界中的复
杂微生物也可以完成生物降解。在这些复杂微生物
之间 ,每个单独的生物体通过代谢产物的内部特异
性转移而相互作用。次级代谢产物可以相互补充 ,
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
从而进行生物降解 , 甚至使得外源化学物质
矿化 [ 25 ]。
4　展望
实时定量 PCR技术具有定量、特异、灵敏和快
速等特点 ,是目前检测目的核酸拷贝数的可靠方法。
随着科技的发展 ,功能更强大、操作更方便的实时定
量 PCR仪不断推出 ,更特异、更灵敏的荧光标记材
料的不断出现 ,数据分析软件也将得到不断地改进
更新 ,使得实时定量 PCR技术将成为生物定量分析
的强有力手段 ,其应用前景更加广阔。生物信息学
的快速发展 ,使得基因组是如何产生不同细胞类型 ,
在这些细胞中如何行使特异的功能 ,以及细胞与环
境间相互作用的方式等问题突显出来 , RT2PCR技
术有可能成为解决这些问题的有效方法。
参 考 文 献
1　 Klee SR, Tyczka J, Ellerbrok, et al1 BMC M icrobiol, 2006, 6: 21
2　 Kirk BW , Feinsod M, Favis R, et al1 Nucleic Acids Res, 2002,
30: 3295～33111
3　 L iefers GJ, Tollenaar RA1 Eur J Cancer , 2002, 38: 872～8791
4　 Ep sy MJ, Uhl JR, Sloan LM, et al1 Clin M icrobiol Rev, 2006, 19:
165～2561
5　杨元 , 丁显平 , 等 1中华检验医学杂志 , 2002, 25 (2) : 1191
6　陈效友 , 王洪平 , 等 1中华结核和呼吸杂志 , 2000, 23 ( 5) : 7
～101
7　张雪寒 ,何孔旺 ,等 1江苏农业学报 , 2008, 24 (4) : 440～4431
8　 W eidmann M, Meyer2KÊnig U, Hufert FT1 J Clin M icrobiol, 2003,
41: 1565～15681
9　 Legoff J, Bouhlal H, Gresenguet G, et al1 J Clin M icrobiol, 2006,
44: 423～4321
10　Espy MJ, Teo R, Ross TK, et al1 J Clin M icrobiol, 2000b, 38:
3187～31891
11　Kimura H, Morita M, Yabuta Y, et al1 J Clin M icrobiol, 1999, 37:
132～1361
12　任月 ,袁杰利 ,等 1中国微生态学杂志 , 2007, 19 (5) : 413～4161
13　张政 ,金大智 ,等 1 中国卫生检验杂志 , 2008, 18 ( 8 ) : 1477
～14791
14　Garcia de V iedma D, del Sol D iaz Infantes M, Lasala F, et al1 J
Clin M icrobiol, 2002, 40: 988～9951
15　Bell CA, Uhl JR, Hadfield TL, et al1 J Clin M icrobiol, 2002, 40:
2897～29021
16　Costa JM, Ernault P, Gautier E, et al1 Prenatal D iagnosis, 2000,
21: 85～881
17　B lessmann J, Buss H, Nu PA, et al1 J Clin M icrobiol, 2002, 40:
4413～44171
18　Chabbert E, Lachaud L, Crobu L, et al1 J Clin M icrobiol, 2004,
42: 1719～17221
19　Schnerr H1, N iessen L, Vogel RF1 J Food M icrobiol, 2001, 71: 53
～611
20　Fukushima H, Tsunomori Y, Seki R1 J Clin M icrobiol, 2003, 41:
5134～51461
21　Akbulut D, Grant KA, McLauchlin J1 Foodborne Pathog D is, 2004,
1: 247～2571
22　Pang XL, Lee B , Boroumand N, et al1 J Med V irol, 2004, 72: 496
～5011
23　Suzuki Y, Yoda T, Ruhul A, et al1 J B iol Chem, 2001, 276: 9059
～90651
24　R ieger PG, Meier HM, Gerle M, et al1 J B iotechnol, 2002, 94:
101～1231
25　覃文 ,曹际娟 ,等 1生物技术通报 , 2003, 6: 46～501
26
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