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技术与方法

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
变性梯度凝胶电泳在微生物生态学中的应用
李德斌  杨洪一  卢磊
(东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040)
  摘  要:  变性梯度凝胶电泳 ( dena tur ing g rad ient ge l e lectropho resis, DGGE)是目前在微生物生态学上应用比较广泛的技
术之一, 具有简便、准确可靠和重复性好等优点。对 DGGE的原理、流程、各项技术要点和在微生物生态学上的应用等方面进
行了详细地论述, 同时归纳和总结了 DGGE的优缺点和局限性。
关键词:  DGGE 微生物生态学  PCR
Application of Denaturing GradientGel E lectrophoresis
inM icrobial Ecology
L iDebin YangH ongy i Lu Lei
(College of L ife Sciences, N ortheast Forestry University, H arbin 150040)
  Abstrac:t  Denaturing gradient g el electropho res is ( DGGE ) is w ide ly used in m icrob ia l eco logy. It is proved to be a sim ple, pre

cise and re liab le techniquew ith good repeatab ility. Th is study rev iew ed the princ ip le, process and m ain technica l po ints of DGGE as
w e ll as its applications in m ic robia l eco logy. Them a in advantages and lim its of DGGE w ere a lso discussed.
Key words:  DGGE M icrob ia l eco logy PCR
收稿日期: 2010
06
01
基金项目:东北林业大学校基金 ( 07050 )
作者简介:李德斌,男,工程师,研究方向:微生物应用; E
m a i:l lideb in8096@ 163. com
微生物生态学 ( m icrob ial ecology )是研究微生
物与其周围生物和非生物环境之间相互关系的一门
科学。微生物作为自然环境的重要组成部分之一,
发挥着重要的作用, 是微生物微生态研究的主体。
但人们对环境中的微生物了解却很少, 主要是因为
传统的方法是利用微生物形态、培养特性、生理生化
特性、生态特性和遗传特性等作为依据对微生物进
行鉴定和分类。其工作繁复、分析速度慢,制约因素
多。然而,在自然环境中能够纯培养的微生物菌株
的数量还不到自然界微生物总数的 1% - 15% [ 1 ] ,
这极大地限制了微生物微生态学的发展。
近年来, 一些分子生物学方法逐渐被应用在微
生物学的各个领域中, 其中变性梯度凝胶电泳 ( de

naturing grad ien t gel electrophoresis, DGGE )
[ 2]由于其
可靠性强、重现性好和方便简洁等优点而逐渐显露
出来。DGGE技术是 DNA指纹技术, 是多态性分析
技术的一种,该技术是 1979年由 F ischer等 [ 3]最先
提出的用于检测 DNA突变的一种电泳技术。 1993
年 Muyzer[ 2]等首次将 DGGE用于微生物生态学研
究, 更加完整和准确地描述了微生物种群多样性、数
量比例和系统进化等。
1 PCR
DGGE的基本原理 [ 4]
DNA分子双螺旋结构受温度、有机溶剂和 pH
等因素的影响,可以使氢键受到破坏,导致双链变性
为单链。PCR
DGGE是利用尿素及甲酰胺两种变性
物质制成一种由低至高浓度的变性梯度电泳胶, 在
进行电泳时, 双股 DNA序列会部分变性,形成部分
单链 ( part ia l sing lest rand)。由于每一个 DNA样品
核酸序列的不同,变性解离的程度也不相同,其在电
泳胶中的移动速度也就不同, 使得部分变性的 DNA
会在相同时间内, 在胶体上跑出不同的距离。序列
不同的 DNA片段就会在各自相应变性剂浓度下变
性, 发生空间构型的变化, 导致电泳速度的急剧下
降, 停留在与其相应的不同变性剂梯度位置,染色后
2010年第 12期        李德斌等:变性梯度凝胶电泳在微生物生态学中的应用
在凝胶上呈现分开的条带。因此, 利用 DGGE可以
将大小相同、序列组成不同的 DNA鉴别开来。然后
可以从凝胶中切下谱带, 通过测序分析揭示群落成
员系统发育的从属关系, 进一步可以用类群特异探
针同群落图谱杂交, 检测出特异细菌种群的存在。
2 PCR
DGGE流程及其关键技术
PCR
DGGE的基本流程是, 首先从环境中取得
样本, 如土壤、地下水、活性污泥、生物膜等, 提取其
微生物总 DNA;然后通过聚合酶连锁反应 ( PCR)将
提取的总 DNA中的特定序列进行扩增,其扩增产物
利用 DGGE进行分离; 最后, 对 DGGE带进行测序
并鉴定分析或者被印渍在尼龙膜上与标记的寡核苷
酸专一性探针进行杂交, 鉴定群落成员。在 PCR

DGGE分子生物技术中,样品总 DNA的提取和纯化
是前提,引物设计及其 PCR方式是关键。
21 微生物总 DNA的提取
微生物的细胞壁组成结构复杂, 应针对不同的
细胞壁采用适宜的破坏细胞壁的方法, 达到最佳的
细胞壁破坏率和 DNA产出率。细胞是否充分裂解
和核酸降解等因素,都会影响 DNA的提取效果。目
前细胞裂解的方法包括机械法 (如玻璃珠、超声波
和冻融等 )、化学法 (如 SDS、苯酚等 )和酶法 (如溶
菌酶、蛋白酶 K等 )。选择适宜的核酸提取方法不
仅可以提高产率,更重要的是可以更准确的反应微
生物的实际群落构成状况。目前,常用的 DNA的提
取方法有 [ 6- 8]以下几种。
211 液氮冻融法  取沉淀 100mg用无菌水洗 3
次,弃上清加入适量液氮, 研成粉末, 加入 567
L的
TE缓冲液重悬, 加 30
L质量浓度为 10% 的 SDS
和 6
L 10 mg /mL的蛋白酶 K,混匀, 于 37 温育 1
h。加入 100
L 5mo l/L NaC l和 80
L CTAB /N aC l
溶液, 充分混匀, 65 温育 10 m in。
212 玻璃珠法  样品中加 1 g,直径为 150
m的
玻璃珠,加抽提液, 放置珠磨仪上破碎, 然后置于冰
上 10 s, 此步骤重复 2次,然后离心取上清。
213 超声波法  样品中加入 300
L磷酸盐缓冲
液 ( 100 mmo l/L NaH 2 PO4, pH80) , 300
L裂解液
( 100 mmo l/L N aC ,l 500 mmo l/L Tris
HC ,l 5% SDS,
pH80) ,加氯仿 300- 600
L, 超声处理 ( 20W, 30
s) , 60 温育 10 m in, 离心取上清。在使用超声波时
需要考虑剪切作用对 DNA的破坏。
214 基于 SDS细胞裂解法  样品中加入 270
L
DNA提取液 ( 100mmol /L Tris
HC ,l 100 mmo l/L Na2
EDTA, 100 mmo l/L N aH 2 PO 4, 115 mol /L NaC,l 1%
CTAB, pH 80和 5
L蛋白酶 K 10mg /mL),于 37
下 225 r /m in摇 30 m in。加入 30
L的 20% SDS,
65 水浴 2 h,每间隔 15- 20m in轻轻摇动一次;于室
温 6 000 r/m in离心 10m in ,取上清液;沉淀中加入
90
L DNA提取液、10
L 20% SDS, 漩涡振荡 10 s,
65 水浴 10 m in,离心 10m in,取上清液,重复以上步
骤 3次;将 3次上清均匀混合。
215 酶解法  先在样品中加 450
L溶液 A( 150
mmo l/L NaC ,l 100 mmo l/L EDTA pH80, 15 mg /mL
溶菌酶 ), 37 水浴放置 2 h进行前处理。
目前,这几种细胞裂解方法很少被单独使用,通
常适当的组合可以获得更好的效果。
22 PCR扩增
PCR扩增是 PCR
DGGE技术中至关重要的步
骤。在 PCR(或 RT
PCR ) 扩增中, 引物的选择、扩
增程序和 PCR产物的质量都会造成群落结构的分
析偏差。在考虑扩增特异性时,也要保证扩增效率,
应使所有模板以均等的几率被扩增, 并且避免异源
双链和单链 DNA等人工产物的形成。对于复杂的
环境样品采用降落 PCR能够获得良好的特异条带。
通常采用 16S rDNA中的保守区作为引物进行 PCR
反应。在分析微生物群落时,目前被广泛使用的细菌
16S rDNA通用引物是 341fP534r(V3区 )、341fP926r
( V3- V5区 )和 968fP1401r(V6- V8区 )。
在利用 16S rDNA通用引物进行复杂样品扩增
过程中,经常会产生大量的 PCR人工产物 (如嵌合
体、突变体、异源双链和单链 DNA分子等 ) , 这些
DNA分子会导致过高的评估生物多样性, 对后续分
析造成重大的影响。 PCR人工产物产生的频率随
着循环数和模板浓度增加而增大, 随着延伸时间增
加而减小。通常嵌合体产生的频率比突变体低, 但
是高于异源双链的产生。异源双链 DNA分子产生
的频率随着种群多样性增加而增大 [ 8]。利用酶处
理、修补 PCR和丙烯酰胺凝胶电泳纯化等方可去除
单链 DNA分子。此外, 不同的 DNA聚合酶对扩增
效果也有影响, 建议使用具有校对功能 ( proo f read

89
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
ing )和高保真 ( high fide lity)的聚合酶以防止引入人
为突变 [ 8]。
23 变性剂梯度的选择
变性剂的选择是取决于样品的 Tm值, 复杂样
品 Tm差异较大,要分辨较多样品, 变性剂梯度范围
则较宽。为使仅有 1个碱基之差的不同 DNA片段
取得最佳的分离效果, 可以用垂直变性梯度试验选
择所要研究的 DNA片段的解链性质、变性剂浓度梯
度。DNA片段从不同浓度的变性剂进胶, 从而与变
性剂发生作用, 因此会停留在胶板的不同位置。电
泳后经染色处理, DNA片段经凝胶成像系统呈现出
一条清晰的 ! s∀型曲线。变性剂梯度范围应选在垂
直试验曲线斜率较大的部分,这时多数分子处于部
分变性状态,此时的位置相当于它所代表的链区域
的 T(解链温度 )值。
24 电泳温度及时间的确定
DGGE系统要求在聚丙烯酰胺凝胶中对待测
DNA片段进行电泳, 电泳的温度要低于待测解链区
域 Tm值。对绝大多数天然的 DNA片段 50 - 65
是比较适合的。平行 DGGE技术适用于多个样品
的比较分析。样品分析之前,首先要将待测样品以
恒定的时间间隔在同一块胶版上点样,跑胶。根据
DNA片段的分辨情况确定电泳时间。电泳的时间
长短与系统的电压密切相关,一般采用低电压,则电
泳时间要长一点,采用高电压则相反。 DNA片段为
200 bp左右, 通常在电压为 150 V时, 电泳 4 h可以
达到良好的分离效果。电泳时间往往受样品的片段
大小、凝胶浓度、变性剂梯度、电泳时的电压等因素
的影响。因此如果改变了这些参数, 电泳时间必须
重新优化和调整, 有时即使参数不变, 但是样品不
同,也需要进行优化。
25 ! GC夹板∀技术
由于 DNA分子中的 G、C碱基对要比 A、T碱基
对结合得牢固,因此 G、C含量高的区域具有较高的
解链温度。基于这一原理 ! GC夹板 ∀ ( GC clamp)
技术是将一段长度为 30- 50 bp富含 G、C的 DNA
碱基片段附加到双链的一端以形成一个人工高温解
链区。这样, DNA片段的原有部分就处在低温解链
区从而可以实现更好的分离。常规的 DGGE或
TGGE电泳技术对于长度超过 500 bp的 DNA片段
的序列变化情况, 只能有 50%的检出率。应用 ! GC
夹板 ∀技术可使检出率提高到 100% [ 9]。
26 染色和测序
核酸电泳后需要进行染色才能呈现出带型和指
纹图谱,最常用的是溴化乙锭染色法和银染法。由
于聚丙烯酰胺对溴化乙锭 ( eth id ium brom ide, EB )具
有熄灭作用,因此导致灵敏度大为降低,人为缩小了
微生物多态性,造成分析误差。银染法是通过银离
子 (A g+ )可与核酸形成稳定的复合物,再使用还原
剂如甲醛使银离子 ( Ag+ )还原成银颗粒,可把核酸
电泳带染成黑褐色,其灵敏度比 EB高 200倍, 是目
前最灵敏的方法。但银染法, 不易回收 DNA, 无法
进行后续的杂交分析。
近年来,相继出现了 SYBR Gold、SYBR Green#和
SYBR G reen∃等新一代荧光核酸凝胶染料,这类染料
的背景极低,可以更好地观察微量的条带。致突变性
远低于 EB数倍甚至数十倍, 几乎具有银染的超高灵
敏度。由于该染料渗透入凝胶的速度极快,无须脱
色,因此使染色过程更加简便,节省时间。虽然这种
染料价格比较昂贵,但还是一类具有良好应用前景的
荧光染料。显色后,凝胶上的条带可以在回收后用于
测序,也可直接进行凝胶的杂交分析。
27 DGGE图谱的分析
在获得 DGGE图谱后, 需要对图谱中条带的核
酸序列进行分析,并对图谱进行统计学分析,阐述不
同样品间的关系,从而合理的解释复杂的指纹图谱。
目前很多凝胶分析软件都可以对 DGGE图谱中的
条带位置和强度进行简单分析, 如 Gel2Pro A na ly

zer、Quantity One和 Im ageToo l等软件。
3 DGGE在微生物生态学中的应用
DGGE技术由于可以体现未被培养的微生物信
息, 从而解决了传统方法的片面性,在分析环境微生
物群落多样性和动态性方面迅速得到了应用。
DGGE技术已经被广泛用于活性污泥、生物膜、土
壤、底泥等环境样品中的微生物多样性检测、微生物
鉴定、微生物变异以及种群演替等方面的研究。
31 研究微生物类群的多样性
从环境样品直接提取总 DNA,经 PCR扩增后,
得到含有某一高变区的目的 DNA序列产物,通过
DGGE得到带谱。因为每个条带很可能就代表一
90
2010年第 12期        李德斌等:变性梯度凝胶电泳在微生物生态学中的应用
个不同的微生物物种, 所以 DGGE带谱中条带的
数量,即反映出该环境微生物群落中优势类群的
数量。但为了得到更详实的信息, 往往采用种或
类群专一性探针与得到的条带进行杂交或将条带
切下,重新扩增后测序, 进而得到部分系统发育
信息。
32 用于环境中微生物变化的动态监测
DGGE技术的一个显著特性就是可以同时对多
份样品进行分析,因此适合于监测环境中微生物在
时间或空间上的动态变化。
33 有助于发现新的微生物
目前, 自然界中可获得纯培养的微生物仅占
1% - 15%,这些微生物只易于在人工的营养条件及
培养条件下形成克隆,并不一定是天然的优势菌群,
而分子生物技术又通常只能检测到优势菌的存在,
因此自然界中还有很大一部分微生物尚未被发现。
应用 DGGE与富集培养相结合有助于发现这一部
分微生物。
34 用于不同 DNA提取方法效果的比较
在分子微生物生态学的研究中, 从环境样品中
提取得到总 DNA是关键的一步。一般采用直接提
取和间接提取 2种方法, 直接提取法即对样品直接
进行处理使其中的微生物细胞裂解从而释放出
DNA, 而间接提取法则是先将样品中的细胞与环境
中其它物质如土壤颗粒等分离,然后再对其进行裂
解、提取等处理。总 DNA的提取期望尽可能多的提
出环境中微生物的 DNA。通过对不同提取方法得
到的 DGGE带谱进行比较可以评价提取效果的
好坏。
35 对功能基因多样性的研究
微生物多样性及其生理代谢活动在生态系统
的物质循环和能量循环中起着重要的作用, 是微
生物生态研究的主要内容之一。对环境样品总
DNA的直接检测能够从基因水平上反映出该环境
中微生物的多样性状况, 这其中包括了代谢旺盛
的、休眠或无代谢活性的微生物,不能单独反映该
环境中有代谢活力的微生物的状况。代谢旺盛的
细胞中具有较多的核糖体,因此可以通过对 mRNA
的研究来反映环境中处于不同生理代谢活动期的
微生物。
4 DGGE技术应用的优点及局限性
41 DGGE技术的优点
411 DGGE技术不需要微生物的分离和纯培养,
可以直接从所研究的生物处理系统样品中抽提总
DNA, 对 16S rDNA的可变区进行 PCR扩增, 扩增产
物通过 DGGE进行分离并进一步分析,所以能克服
传统方法的不足,打破微生物可培养性的局限,检测
到难以纯培养或不能纯培养的微生物。
412 这种方法能检测出数量仅占总群落数 1%
的微生物。在贫营养或含有毒物的生物处理系统中
的微生物,不可能形成很复杂微生物群落结构和丰
富的细菌数量,有些种类可能只有少量存在,但这种
不在数量上占优势的菌群也可能在系统中起着重要
的作用,检测极限低这一特点能在这种情况下发挥
最大优势。
413 PCR
DGGE技术检测结果准确可靠。 PCR

DGGE通常用指纹图谱中条带数目的多少来反映微
生物种群的多样性,还可以半定量地测定样品 DNA
浓度的大小,反映微生物群落组成的变化,用条带的
染色强度反映不同细菌种群的丰度, 使原始样品中
的不同细菌群落保持相对比例。
414 PCR
DGGE技术可同时检测多个样品,并且
具有可重复性,特别适合分析优势种类和调查种群
的时空变化,对生物处理系统微生物群落结构演替
规律的研究有重要意义。
42 DGGE技术的局限性
DGGE作为一种分子生物技术, 除了多数分子
技术所固有的缺点,如在 PCR过程中产生的偏差等
之外,其本身还有一些很难克服的缺点。
421 DGGE体现的信息量不足,因其最多能分离
1 kb的 DNA片段,理想效果选用的片段只有 200 -
500个碱基, 而这些序列不足以反映出该物种的所
有信息, 因此这些序列只能提供有限的系统发育
信息。
422 该技术低估了微生物总量。理论上, 只要选
择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够
精细, DGGE技术对于 DNA片段的分辨率可以达到
一个碱基差异水平。但如果选用的条件不是特别适
宜, 并不能完全保证可以将有一定序列差异的 DNA
片段完全分开,从而会出现序列不同的 DNA迁移到
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
胶的同一位置。不同的 DGGE试验条件很可能导
致不同的带型谱图。这无疑对序列信息的探针设计
和系统发育分析都有一定的影响。另外, DGGE只
能检测到一定数量的微生物的存在, 通常只能检测
到环境中优势菌群的存在。
423 有些细菌具有多操纵子, DGGE能将其在
PCR时形成的不同序列分离开,这样就可能导致过
高的估计环境中的微生物多样性。
424 在总 DNA提取过程中, 如何评价细胞裂解
和 DNA的回收效率、提取的 DNA能否代表微生物
菌群中的优势菌群等都是研究的难点。待测样品的
预处理过程是 DGGE技术能否发挥效能的关键步
骤。这一步骤也是试验误差的主要来源。很多因素
都会影响样品 DNA的提取过程, 比如, 待测细胞是
否充分裂解;一些抑制 DNA降解的物质是否完全去
除等。
425 在 PCR扩增过程中,如何避免优先扩增,使
所有模板以均等的几率被扩增,基因组的大小、引物
的设计以及扩增程序的选择均对扩增后 DNA片段
的质量和数量有很大的影响, 这些都将间接影响
DGGE的分析结果。
426 DGGE技术不能提供有关微生物活性的
信息。
43 减少试验偏差的解决办法
对于以上存在的缺限,首先可以从优化电泳及
PCR条件着手改善; 其次,在进行 DGGE之前, 可以
通过软件来分析检测 PCR过程中形成的嵌合体,以
减少误差;再者, 与其它技术方法结合使用, 如纯培
养、直接形态观察、克隆、核酸探针检测技术及原位
杂交等,这样不仅可以更客观的从不同方面反映环
境中微生物多样性信息, 还可以与其它方法相互补
充,从而不断提高分子微生物生态学的研究水平。
5 DGGE的前景展望
微生物是地球生物圈中一个重要的组成部分,
在生物 % 地球 % 化学循环中起着极为重要的作用,
对它们的认识有助于人类更好地利用微生物资源以
及改善人类的生存环境。尽管近十几年来, 由于分
子生物技术的应用,人们对微生物生态学的认识和
研究有了很大的进展, 但还远远不够。随着自然环
境恶化,污染加剧, 许多有用的微生物资源正在消
失, 这更增强了人们希望客观真实的认识微生物生
态的迫切性。DGGE技术的应用及其与传统方法或
其它分子生物技术的结合, 无疑促进了人们对微生
物生态的认识,随着分子生物技术的快速发展,该技
术将会得到不断的完善或补充, 在微生物生态研究
中发挥更大的作用。
参 考 文 献
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