全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2009年第 1期
收稿日期：2008-07-07
基金项目：国家高新技术“863”项目（2006AA10A203），国家支撑计划项目（2007BAD40B03）
作者简介：冯海燕（1983-），女，山东潍坊人，硕士生；E-mail：fenghaiyan2002@163.com
通讯作者：景志忠，博士，研究员，主要从事病原与宿主的分子生物学与免疫学研究；E-mail：zhizhongj@yahoo.com.cn
1 双向电泳的基本原理及操作程序
1.1 基本原理
1975 年，意大利生化学家 OFarrell 发明了双向
电泳技术 [1]。 它是利用蛋白质的带电性和分子量大
小的差异，通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质组的
技术。 第一向电泳依据蛋白质的等电点不同，通过
等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。在此
基础上， 依据蛋白质分子量的不同进行第二向的
SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，将其分离。 双向电泳技
术包括蛋白样品制备、等电聚焦、在平衡液中平衡
胶条和 SDS-PAGE 电泳等步骤。
1.2 蛋白质样品的制备
样品制备是双向电泳的第一步，其成功与否是
决定双向电泳成败的关键。由于双向电泳所分析样
品的多样性，没有一种通用的制备方法适用于各种
样品。但有几条共同的原则需要遵循：（1）尽可能溶
解全部蛋白质， 打断蛋白质之间的非共价键结合，
使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在；（2）
避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用；（3）
避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用；（4）蛋白质
样品与第一向电泳的相容性。
对于组织细胞 ，首先需将其破碎 ，尽可能地将
蛋白质组分溶解在缓冲液中，以便在适当的电泳条
件下分离。组织细胞破碎的方法包括低渗、匀浆、超
声、反复冻融等。而对于体液成分，如血清、腹水、尿
液等，仅需经过稀释、加热变性、溶解于适当缓冲液
便可用于双向电泳。植物组织（特别是绿色叶片）中
含有色素、酚及其它多种次生代谢产物，会干扰电
泳及分辨效果。 因此，在植物蛋白质制备过程中常
先采用冷丙酮及三氯乙酸沉淀蛋白质，不仅有效抑
制了蛋白酶对蛋白质的水解作用 ， 而且除去了色
素、酚等干扰双向电泳的物质。
在制备蛋白质样品的过程中， 最好使用 Dnase
和 RnaseA 来降解核酸。 如果蛋白质样品中含有较
多的核酸，会增加样品的粘性并造成非斑点处的背
景拖迹，甚至还可能封闭凝胶孔。 在蛋白样品裂解
时，应以溶解尽可能多的蛋白质和保持在整个双向
电泳过程中蛋白质的溶解性为主要目标。对于水溶
双向凝胶电泳技术及其应用
冯海燕 景志忠 房永祥 莫斯科
（中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 甘肃省动物寄生虫病重点实验室，兰州 730046）
摘 要： 介绍了双向电泳的基本原理、操作过程及其在动植物和医学中的应用。 同时对当前双向电泳技术面临的
挑战和发展前景进行了介绍。
关键词： 双向电泳 操作程序 应用
Two-dimensional Electrophoresis and Its Application
Feng Haiyan Jing Zhizhong Fang Yongxiang Mo Sike
（Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province，State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology，
Lanzhou Veterinary Research Institute，CAAS，Lanzhou 730046）
Abstract： This article introduced the technical principle，process of two-dimensional electrophoresis and research
application involved in animal，botany and medicine industry.
Key words： Two-dimensional electrophoresis Operation procedure Application
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
性蛋白 ，PBS 和 Tris 缓冲液即可将其完全溶解 ，然
而细胞中还有大量的疏水性蛋白（如膜蛋白），很难
溶于常规的缓冲液，因此增加疏水性蛋白的溶解度
一直是很多学者奋斗的目标。目前增加蛋白质溶解
性的方法主要是使用变性剂，如尿素、硫脲，可以打
破蛋白质的高级结构，打断非共价连接。据报道，硫
脲不仅对蛋白质有增溶效果，还有抑制蛋白酶活性
的作用。 去污剂，如阴离子去污剂 SDS、非离子去污
剂 NP-40、TritonX-100、 两性离子去污剂 CHAPS、SB3-10，
可以打断蛋白质分子或亚基间的疏水作用，增加蛋
白质溶解性，其中只有非离子型和两性离子型适于
双向电泳。带有 12～16 个碳原子烷基侧链的氨基硫
代内铵盐，如 SB-10、C8覫、ABS14、ABS16 等，与尿素
和硫脲同时使用， 对膜蛋白的增溶作用更为突出。
最近的研究显示，非离子去垢剂十二烷基麦芽苷和
十六烷基乙二醇（decaethyleneglycol mono hexadecyl）
对疏水性蛋白的增溶效果也非常明显。 还原剂可
以打开二硫键，并在随后的操作中保持蛋白质处于
还原状态 ， 如二巯基苏糖醇 （DTT）、 磷酸三丁酯
（TBP）、羟乙基二硫化物（HED）。TBP为非离子型还原
剂，在较低浓度下（3～5 mmol/L）即可提高蛋白质溶解
性，而且不会在电场中迁移，等电聚焦过程中可始
终维持蛋白质的还原状态，同时简化了两向转移间
的平衡操作。 但由于 TBP 溶解度有限且在溶液中
不稳定， 在溶胀和聚焦过程中补充适量 DTT 是有
帮助的 （常用浓度为 2 mmol/L TBP 和 65 mmol/L
DTT）。 用 0.5 mol/L DTDE 或 100 mmol/L HED 替代
DTT 也会提高碱性蛋白质溶解性获得很高的分辨
率，同时简化了平衡操作。虽然含有变性剂、去污剂
和还原剂的裂解液在很大程度上增加了蛋白质溶
解性，但在聚焦时仍有一些蛋白在其等电点附近发
生沉积。 研究表明，一些蛋白质溶解需要一定的盐
浓度， 可是高浓度的盐离子不仅限制电压升高，延
长了聚焦时间，所形成的高电流会引起凝胶过热甚
至烧坏 ， 所以样品缓冲液中盐浓度不能超过 40
mmol/L。而两性电解质在一定程度可以缓解盐离子
浓度低的问题，且具有在聚焦过程中不改变 pH 梯
度前提下提供稳定电导的能力。
二次样品制备的目的是去除干扰双向电泳的
非蛋白物质（如盐、酚类物质、脂类、多糖和核酸等）
和阻止在双向电泳谱中导致假点的多肽或蛋白修
饰。
1.3 等点聚焦
等点聚焦是 20 世纪 60 年代建立的蛋白质分
离技术，基本原理是利用蛋白质或其它两性分子等
电点的不同 ，在一个稳定的 、连续的 pH 梯度中进
行分离和分析。 IEF 具有分辨率高（0.01pH 单位）、
抵消扩散作用、可使浓度较低的样品达到高度浓缩
等优点，不仅可以用来分离两性大分子 ，还可以通
过测定等电点来鉴定蛋白质。 根据建立 pH 梯度的
原理不同，可以分为载体两性电解质 pH 梯度（Carrier
ampholytes pH gradients）和固相 pH 梯度（Immobilized
pH gradients）。 前者是在电场中通过两性缓冲离子
建立 pH 梯度，后者是将缓冲基团作为凝胶介质的
一部分，分辨率比前者提高一个数量级。 根据电泳
方式的不同，IEF 可分为管状、薄层、垂直和水平等
电聚焦 。 目前广泛应用的是 IPG 水平等点聚焦 ，
Amersham Biosciences 公司的 MultiphorII 和 IPGphor
系统，Bio-Rad 公司的 PROTEAN IEF Cell 都为水平
等点聚焦提供了良好的平台，是目前双向电泳首选
仪器。
IEF 运行程序和参数的设置须根据 pH 范围和
IPG 胶条长度而定。 另外，由于样品蛋白质组成存
在差异，IEF 运行条件应因样品而定。 聚焦完成后，
胶条既可以在中间电压 500~1 000 V 下短时间保
持，便于随时进行第二向的平衡，也可以置于-80℃
冰箱中进行长期保存。
1.4 IPG 胶条平衡
在第二向 SDS-PAGE 分离前， 必须要平衡 IEF
胶。主要目的是用含有 SDS 的第二向介质置换含有
尿素的第一向介质，使分离蛋白质与 SDS 能完全结
合，保持蛋白质的巯基呈还原状态，避免发生重氧
化，确保在 SDS-PAGE 过程中正常迁移。 聚焦后的
蛋白质在 IEF 胶内处于其等电点处， 净电荷为零，
若未进行平衡过程而直接进入第二向的 SDS-PAGE
分离，蛋白质仍滞留在 IEF 胶中不能在第二向凝胶
中正常迁移。 胶条平衡包括两个简短的步骤，每步
10~15 min。 第一步是将 IEF 胶在 375 mmol/L Tris-
HCl pH8.8 缓冲液（含 2％SDS、1％DTT 或 TBP、6 mol/L
尿素和 30％甘油）中浸泡 10~15 min，尿素和甘油是
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用于减缓电渗效应，提高蛋白质从第一向到第二向
的转移率 。 第二步是用 5％碘乙酰胺替代还原剂
DTT 的 375 mmol/L Tris-HCI pH8.8 缓冲液 ，其他组
分及相应浓度不变。碘乙酰胺用来烷基化巯基变成
羟乙酰半胱氨酸残基，以便巯基不能重组形成二硫
键。 此外，碘乙酰胺还可以烷基化 IEF 胶内的自由
DTT， 否则自由 DTT 在第二向 SDS-PAGE 胶迁移，
会产生点条纹的假象。 为减少酰氨基组的烷基化，
最好在 pH8~9 之间进行还原和烷基化。
1.5 SDS-PAGE
第二向 SDS-PAGE 有垂直和水平两种方式。 垂
直方式的特点是可以同时走多张胶，且可以是较厚
的凝胶，有利于提高上样量，电泳后可有足够的蛋
白量进行进一步分析； 缺点是需要大量的缓冲液，
电泳时间长，分辨率低，不便于保存。水平电泳的特
点是分辨率高、速度快 、灵敏度高，凝胶大小、厚度
可任选，可用半干技术；由于有支持膜，更便于长期
保存 。 平衡后的 IPG 胶可以被水平或垂直放在
SDS-PAGE 胶上，用 0.8％低熔点琼脂糖封胶 ，固定
IPG 胶，以防电泳时滑动或漂移。
1.6 染色
常用蛋白质点的染色方法有考马斯亮兰 、银
染、荧光染料等。其中银染法灵敏度高，可以在电泳
图中找到含量较低的蛋白，所需的上样量较少 （每
点仅需 0.1 ng），可以检测到小于 1 ng 的蛋白点，但
线性范围小于 2 个最高数量级。所有银染方法都是
温度依赖的，而且需要精确控时的操作，决定何时
终止染色全凭个人的经验，因此，银染是 3 种染色
法中重现性最差的。考马斯亮兰是 3 种染色法中灵
敏度最低的，检测限度约为每点 10 ng 蛋白。 但可
以染色多种蛋白质，并能与蛋白量呈两个最高数量
级的线性关系。 用考马斯亮兰染色的蛋白点成蓝
色，可以用可见光扫描仪捕获胶图。荧光染色法，是
一种终点染色方法， 可以检测到大约 1 ng 的蛋白
点。荧光染色法与蛋白量呈 3 个最高数量级的线性
关系。需用荧光扫描仪显示用荧光染色法染色的蛋
白点。
1.7 分离蛋白质的检测与匹配分析
目前常用的图像分析软件有 PDQUEST （Bio-
Rad）、MELANIE II（SIB，GenBio）、Irnagemaster（APB）、
Advanced 2-D Software （Phoretix）和 I-IT Ivestigator
（GSI）。 图像分析软件能提供综合管理各种分离和
分析过程所必须的控制和分析的功能 。 2-D PAGE
分析软件确定并定量双向凝胶上蛋白点，去除背景
方式，匹配相关胶图，比较相关胶图上相应蛋白点
强度，准备显示报告的凝胶数据以及输出胶图信息
到数据库。图像分析软件也能指导手工或点自动切
割机械手进行胶上蛋白点的切割，以作进一步的分
析。
1.8 蛋白质质谱分析
质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比
的测定来进行分析的一种分析方法。被分析的样品
首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的
运动行为的不同，把离子按质荷比 （m/z）分开而得
到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样
品的定性定量结果。 因此，对通过双向电泳得到的
差异蛋白进行质谱分析，结合相关数据库，分析鉴
定差异表达的蛋白。
2 双向电泳的应用
双向电泳的分辨率较高，自第一次应用该技术
以来， 其分辨率已从 15 个蛋白质点发展到 10 000
多个蛋白质点。 一般的双向电泳也能分辨 1 000～3
000 个蛋白质点。 因此，近年来，双向电泳被广泛应
用于农业、医学等研究领域。
2.1 在动物科学中的应用
在动物科学研究方面，双向电泳被广泛应用于
小鼠血清蛋白、卵巢蛋白、兔晶状体蛋白质、昆虫离
体细胞膜蛋白、户尘螨蛋白、家蚕雌性附腺及其 Ng
突变体蛋白质、大腹园蛛毒素蛋白质、家蚕蛋白质、
牛精液蛋白、猪巨噬细胞蛋白等方面的研究。 如钟
小兰等 [2]利用双向电泳技术分析肝郁症模型大鼠血
清蛋白质组的差异表达，从蛋白质组学角度探讨肝
郁症的实质。 王治东等 [3]采用蛋白质组学的双向电
泳和蛋白质氨基酸序列分析技术研究了 8Gy γ 射
线照射后 24 h 小鼠血清蛋白质的变化， 鉴定有差
异的蛋白质 ，并用蛋白质印迹 （Western blotting）方
法进行验证。为探索急性放射损伤的发病机理提供
了新的方法。 马翔等 [4]通过双向电泳和质谱技术分
析性成熟小鼠卵巢蛋白质组，并对其中的一种蛋白
质进行免疫组化研究，初步建立了性成熟小鼠卵巢
冯海燕等：双向凝胶电泳技术及其应用 61
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
蛋白质图谱，并对其中的蛋白质进行研究，对研究
卵巢病理与生理、发育过程有着重要的意义。 刘奕
志等 [5]通过双向电泳和质谱鉴定有效分离和分析兔
晶状体蛋白质组的特性，为分析白内障形成过程中
蛋白质的表达改变提供新的方法和途径，为白内障
的防治带来新的前景。 柳亦松等 [6]以大腹园蛛粗毒
为材料利用双向电泳技术获得蛋白质组双向电泳
图谱，检测到 500 个左右的蛋白质点 ，并对其中部
分蛋白质点进行了质谱分析，目前初步获得 5 个组
分的鉴定结果。 靳远祥等 [7]采用双向凝胶电泳和计
算机辅助分析方法，分别对家蚕（Bombyx mori）限性
黄茧品种雌蚕（黄茧）和雄蚕（白茧）的中部丝腺组
织细胞蛋白质进行分离和比较分析 。 用银染的方
法， 两张图谱均可见到分离出 600 个以上的点，比
较分析发现，结黄茧的雌蚕中部丝腺组织细胞一些
蛋白质的表达水平明显高于结白茧的雄蚕，有两种
蛋白质只在雌蚕中表达，但表达量不高。 这些差异
蛋白质可能与有色茧丝的形成有关， 或是与 W 染
色体的易位片段上其它未知基因有关。 Jobim[8]利用
双向电泳研究与牛精子活力有关的低丰度蛋白，从
高活力精液和高活力精液中发现的 12 个点中 ，有
3 个点在两种精液中都存在，没有明显差异；4 个点
存在于高活力精液中，明显区别于低活力精液。 还
有一个点在低活力精液中量明显区别高活力精液。
Perez-Reinado[9]为了研究巨噬细胞与病原细胞相互
作用的生物学与动力学， 利用 pH5~8 的胶条得到
了猪巨噬细胞蛋白的双向电泳图谱，检测到了 800
多个点，其中对 pI5.2~7.4，分子量 19~106 kD 范围
的 106 个蛋白进行的质谱分析，发现这些蛋白与免
疫功能，信号转导，细胞凋亡有关。
2.2 在植物中的应用
在植物科学研究方面，双向电泳被广泛应用于
水稻蛋白质、小麦蛋白质、茶树蛋白质、杉树蛋白质
等方面的研究。 如易克等 [10]利用双向电泳技术对水
稻种子胚乳蛋白进行了分析，获得了较好的电泳图
谱，为探讨水稻灌浆期间与籽粒充实相关蛋白表达
的变化，建立了一套适于水稻种子胚乳蛋白双向电
泳分析技术。 Picard 等 [11]利用双向电泳分析了亲缘
关系较近的硬粒小麦不同株系的遗传多样性，发现
品系间的多态性很低，并且有 7 个蛋白可用于基因
型的鉴定。 Trisiriroj 等 [12]通过双向电泳分离出 6 个
可用于鉴定香稻与非香稻株系的糠蛋白。 Islam[13]在
研究小麦 1B 染色体特定位点基因缺失对种子蛋白
组分的影响时，通过双向电泳找到了与缺失位点相
对应的标记性蛋白，这一发现对小麦育种具有重要
的意义。 林金科等 [14]利用双向电泳技术分析了茶树
蛋白质组，探索出一种可获得重复性好，清晰度高
的蛋白质双向电泳图谱技术，并发现一种辨别茶树
蛋白质样品质量好坏的简便方法。 杨梅等 [15]建立了
适用于杉木 （Cunninghaimia lanceolata）叶片蛋白质
组研究的双向电泳技术，对杉木叶片蛋白质的溶解
方法、 上样量、IEF 及 SDS-PAGE 电泳等关键步骤
进行了优化。 另外，梁文裕等 [16]应用双向电泳技术
分析了龙眼胚胎分化发育过程中蛋白质组分的变
化。 秦新民等 [17~19]对沙田柚花粉、花粉管、花柱蛋白
等进行了双向电泳分析。 丁坤善等 [20]建立了油松雌
性不育系球果蛋白质双向电泳技术体系。 李慧玉等[21]
对樟子松突变丛生枝蛋白质进行了双向电泳分析。
2.3 在医学中的应用
目前许多研究者利用双向电泳对人体的各种
组织、器官、细胞进行了研究，为疾病的诊治及了解
发病机制提供了新的手段，例如，在肿瘤的研究中，
寻找与肿瘤发生、发展和抗药性有关的蛋白，Wu 等 [22]
利用表面加强激光解吸电离（surface-enhanced laser
desorption ／ ionization，SELDI） 蛋白芯片技术进行双
向电泳和质谱分析 （MS），鉴定了来自同一患者的
两个头颈部鳞状细胞癌细胞系 UMSCCIOA 和 UMS
CCIOB 中差异表达的蛋白。 Melle 等 [23]利用蛋白芯
片技术对显微切割的正常咽上皮和肿瘤组织之间
蛋白表达的差异进行了研究。 他们对 57 例头颈部
肿瘤及邻近粘膜（44 例）的冰冻切片进行了激光显
微切割 ， 通过双向电泳和 MS 分析发现膜联蛋白
（annexin）在肿瘤中的表达明显升高（P=0.000 29）。 之
后又通过免疫组化进一步证实了膜联蛋白在肿瘤
中的表达。 Srisomsap 等 [24]利用双向电泳研究了甲状
腺组织（包括正常甲状腺、多结节性甲状腺肿、弥散
性增生、滤泡性腺瘤、滤泡性癌和乳头状癌）的蛋白
表达模式。 对特定蛋白通过 ESI-MS 和蛋白测序进
行鉴定。 结果发现了一个最显著的蛋白-组织蛋白
酶 B（CB），它在不同的甲状腺疾病中的表达不同。
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与非肿瘤性甲状腺疾病相比，这些组织蛋白酶 B 的
蛋白点中 CB2 和 CB3 在甲状腺肿瘤中明显上调 。
孙庆、杨小玉等 [25]对骨肉瘤组织和正常组织进行了
双向电泳分析，得到较好的电泳图谱，建立和优化
人骨肉瘤蛋白质组双向电泳图像分析方法。 苏坚 [26]
采用二维电泳、图像分析、质谱技术等方法在相同
条件下 ，对二烯丙基二硫 （DADS）处理前后 SW480
细胞两种样品的总蛋白质进行双向电泳，其中 167
个匹配的蛋白质点存在表达量上的差异。与对照组
相比，处理组蛋白质表达量下调的有 69 个，利用基
质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术 （MALDI-
TOF-MS） 对其中 8 个表达明显下调的蛋白质斑点
进行分析鉴定 ， 获得相应的肽质量指纹图谱
（PMF），通过数据库搜索，确定了这 8 个蛋白，这些
差异蛋白质涉及细胞周期调控、细胞分化 、细胞凋
亡及细胞分裂增殖等众多事件 。 从而说明 ，DADS
可能具有抑制结肠癌细胞生长， 阻滞细胞周期，诱
导细胞分化及凋亡的作用。
利用双向电泳技术建立和优化了人血清蛋白
质图谱，为进一步开展疾病的血清蛋白质组学研究
奠定基础。 刘希成等 [27]对人未做处理的血清以及去
除白蛋白和免疫球蛋白 G（IgG）的蛋白质组学方法
进行比较和优化， 质谱分析了 9 个差异蛋白点，鉴
定为 8 种蛋白质，其中 7 种为功能蛋白质。 胡成效
等 [28]通过双向电泳分析系统性红斑狼疮（SLE）患者
外周血单个核细胞蛋白质表达谱的变化 ， 发现有
11 个蛋白点在 SLE 患者组表达上调 ，9 个表达下
调，SLE 患者外周血单个核细胞蛋白质表达发生了
明显改变，为从淋巴细胞蛋白质谱变化的整体角度
上阐明 SLE 发生的分子机制及免疫调控通路奠定
了基础。 赵慧辉 [29]采用双向凝胶电泳和基质辅助激
光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对 8 例
心绞痛血瘀症患者血瘀症程度变化前后的血浆进
行比较蛋白质组学研究，寻找心绞痛血瘀症相关蛋
白 。 结果初步发现了凝聚素 （Clusterin）、载脂蛋白
A-Ⅰ（ApoA-Ⅰ）在血瘀症程度变轻后表达增加，而
纤维蛋白原 β 链（Fibrinogen β chain）、维生素 D 结
合蛋白 （Vitamin D-Binding Protein）、结合珠蛋白 β
链 （Haptoglobin β chain）等在血瘀症程度变轻后表
达降低。 以上这些物质均可能与心绞痛血瘀症相
关，但结果有待运用其它生物学的方法进行具体的
验证并探索其机制。另外双向电泳还应用在临床诊
断、病理研究、药物筛选、新药开发、食品检测、甚至
物种鉴定等方面。
3 展望
双向凝胶电泳虽然以高分辨率 、简单 、快速等
优点成为目前蛋白质组学研究的核心手段，但是样
品制备、电泳和蛋白质的定量、蛋白质检测的可重
复性依然是制约双向电泳应用的瓶颈。虽然在膜蛋
白样品溶解性、低丰度蛋白质检测、极酸极碱蛋白
质及低分子量和高分子量蛋白质分离等方面取得
了很大进步，但问题仍未彻底解决，还有赖于今后
不同领域科学工作者继续努力。随着相关学科的发
展和技术的进一步完善以及新仪器的开发，限制双
向电泳的羁绊不断被突破，双向电泳将在今后的研
究中以其独到的优势继续发挥不可替代的作用。
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