全 文 ：生物杖术通报
· 研究报告 · 丑了口百万 乙口 年增刊
九孔鲍四倍体诱导的研究
严正凛
集美大学 水产学院 省高校水产科学技术与食品安全重点实验室 , 厦门 !
摘 要 采用二倍体鲍卵子 , 抑制其第一极体 、抑制其第一极体和第二极体诱导四倍体 , 用三倍体鲍卵子与
普通鲍精子受精并抑制其第一极体 , 以及用三倍体鲍的其它方法诱导四倍体 。 用倍体分析仪检测 相对含量
以 判别其倍性。 实验结果 , 先后共培育出存活的四倍体鲍 个 , 个体大小为 一 挑选性腺发育较好的四
倍体鲍包括雌雄 , 与普通鲍杂交繁育三倍体 , 先后共培育出 批次 , 培育出的苗量共计 万个。
关键词 九孔鲍 三倍体 四倍体 诱导 育种
月乞 价 吞
叮 二 群 叮 诚 ! ,
! , 俪 , 灭艺“
! 动 犯 叼 站 场 卯 ,
邵 , 卯 叮
娜 路 , !
! !
, 罗 一 ! ∀ ! # ∃ % & ∋ ( ) ∗ + ∗ ) % #, − . & − /
,
∃
)
0&
! ∃
∃
&# 1 ,
∗ )
#2
#,
( −
3
∗
(
,
%
) ∗
(
4 ! #,
# (
) 0 ! #,
5
∃
&
− −
.∗ ∃6
&) ∗
( 脚 ab alones, fi n al l y , 1 5 8 0 (X) t ri v l o i d s e e d s
w e
re P ro d
u e e
d fo
r
1 0
t
i m
e s
.
K e y w
o r d s
:
Ha
l 衍tis di 泥rs ieolor 啊ua tilis Triploid Te tr即loid Induetion Seed breeding
九孔鲍 (Ha liotis d俪rs ico lor a, u a t i l is ) 为我国福
建以南沿海重要的海水工厂化养殖种类 。 但其个体
小(一般为5.0 一 6 . oc m ) , 生长慢 , 养殖周期长 。 应
用多倍体育种技术 , 培育三倍体九孔鲍的优良品种 ,
将可提高其经济效益 。 目前三倍体的诱导技术都是
采用单一的物理或化学方法 , 这种技术由于每年都
需要诱导 , 且稳定性差 ,成活率也低 , 而且比较繁杂 ,
不容易为群众所掌握川 。 理论上讲 , 四倍体是可育
的;四倍体与二倍体杂交生产的三倍体倍化率可达
10 % ,并且存活率高 , 操作简单 。
在贝类四倍体的诱导研究中 , 主要是通过抑制
第一极体、抑制第一极体和第二极体 、 以及用三倍体
鲍卵子并抑制第一极体等的方法进行诱导 , 获得幼
体四倍体或成体四倍体。 早期幼体的四倍体一般都
能检测到 , 但很难存活到成体〔’一“] 。 单壳类四倍体
的研究较少 。 孙振兴等通过抑制极体释放的方法进
行皱纹盘鲍 (H. disc o han na i) 四倍体的研究 , 获得
了 21 .9% 的四倍体胚胎 , 但未见存活的四倍体成
体〔’〕。 迄今为止 , 有关贝类四倍体成功培育到成体
的例子只有地中海贻贝 (从夕￡il o ga “op 二inc ial is ) ,
菲律宾蛤仔 (7冲es 户il神ina ru m )和太平洋牡砺
(‘胡‘os trea g四)〔8 一 ”〕。
基金项目:集美大学科研基金资助及福建省科技计划重大项目(编号 Zo Z No 3) 资助
作者简介:严正凛(1955一 ) , 男 , 研究员 , 主要从事海水经济动物繁养殖及鲍多倍体育种技术研究 ;E 一 m ail : y anz l@ j m u
.
ed
u
.
cn
年增刊 严正凛:九孔鲍四倍体诱导的研究 3 37
我们自1993 年以来开始了九孔鲍三倍体的诱 的细胞数) * 10 % 。
导和培育技术的研究 。 在有关部门的大力支持下 , 如若是抑制第一极体和第二极体诱导四倍体
现已成功地培育出存活的四倍体九孔鲍 ,并用四倍 的 , 其表观四倍体率 二 无极体出现的细胞数/总细胞
体与二倍体杂交的生物方法 , 培育出 10 % 的三倍 数 * 10 % 。
体。 关于九孔鲍多倍体的诱导和育种研究 , 迄今未 1.3 倍性检测方法
见其它报导[lz 一 ls] 。 取试验鲍足部边缘的触手一小撮于小型塑料试管
1 材料与方法 中 , 一个试验鲍为一个样品 , 并加人 PH 缓冲液(6.1.1 实验材料 81) , 冷藏带回实验室待测 。 检测时 , 先用镊子将样品
实验用亲鲍为人工养成和优化培育促熟的成熟 镊碎后 ,用 Vo rtex 震荡器震荡 , 使其有较多的游离细
亲鲍 , 三倍体雌鲍和四倍体雌雄鲍系经多倍体分析 胞;然后过滤 ,弃去样品粗块 ,细胞悬液加人测试管中;
仪测定其 DN A 相对含量后确定的 (三倍体雄鲍性 最后加入 DAPI 试剂(荧光染料试剂)
, 用德国Part ec公
腺为暗土霉素色 , 肉眼可以鉴别)。 实验用的精卵 司出产的 PA ~n倍体分析仪测定样品 D NA 相对含量。
是亲鲍在温和条件下用常规方法催产获得的。 本项目自开展研究以来 ,共检测 42 批次。
细胞松弛素 B 即 Cytoeh以asin B (简称 e B ) , 为 2 结果
美国 Si gm a公司产品。 分子式: C2 9H 37 No5 , 药品 2.1 抑制二倍体鲍卵子第一极体诱导四倍体
纯度高于 98 % 。 采用不同的处理起始时间、不同浓度和不同的
1.2 实验方法 处理持续时间进行抑制九孔鲍二倍体鲍卵子第一极
在 CB 处理溶液中 , 用 D M SO 作为溶剂 , 其浓度 体的释放诱导四倍体的实验 , 结果是 , 处理起始时间
为溶液的 1/l 00 (V /V );每次诱导处理完毕 , 用含 为 巧‘左右的 , 其四倍体率较高;处理起始时间为为
有 D M SO I/l 0 0 (V/V )浓度的海水清洗 2 次 , 每次 20”以及超过的 , 其四倍体率较低;处理持续时间大
巧m in ;每次计算实验卵量 , 并镜检观察受精卵的极 于 4 ’0 即的 , 其畸形率很高;在本实验的处理浓度
体释放情况和第一次卵裂情况 , 及时修正诱导中的 0.25 一 0 . 40 m g · L 一 ’范围内 , 对四倍体的诱导是有
三个诱导参数 。 效的 。 当然 , 卵量在 1L 水体中为 巧 万 一 30 万个是
极体释放情况 , 如若是抑制第一极体诱导四倍 适当的 。 从表 1可以看出 , 处理起始时间为 15 “ , 处
体的 , 其表观四倍体率 = 第 1 个极体无出现的细胞 理浓度为0.40 m g · L 一’ , 处理持续时间为 2 ’30 ”的
数/(第 1个极体无出现的细胞数 +第 1个极体出现 三个诱导参数的组合 ,其四倍体诱导率最高 。
表 l 抑制二倍体鲍卵子第一极体诱导四倍体的实验结果
水澎℃ 处理起始时间 处理持续时间 卵量/ * 104 处理浓度/m g · L 一 ’ 四倍体匆%27.6 1’3 0 即 6 ‘3 0 , , 1 5 0 . 2 5 1 5
20
.
9 1 5
“
7
’
4 5
’‘
3 0 0
.
2 5 8 0
2 0
.
0 1 5
“
7
‘
4 5
’‘
2 0 0
.
2 5 7 0
2 7
.
0 1 4
”
4
’
1 s
n
8 0
.
3 0 7 0
2 8
.
0 1 5
”
4
’
(X)
即
3 0 0
.
3 0 7 0
2 6
.
2 1 5
”
3
’
3 0
"
3 0 0
.
3 5 7 0
2 8
.
3 1 5
,‘
3
’
2 1
,
3 0 0
.
3 0 6 5
2 8
.
3 1 5
’‘
3
’
(X)
"
3 0 0
.
3 5 7 0
2 3
.
5 1 5
’‘
2
’
1 5
沁
3 0 0
.
4 0 6 5
2 3
.
5 2 0
,‘
2
’
3 0
即
3 0 0
.
3 8 3 0
24
.
0 1 5
,’ 2 ’3 0 即 3 0 0
.
4 0 7 5
2 6
.
0 1 5
”
2
’
3 0
"
7 0 0
.
4 7 6 5
生物技术通稚 B勿te ch no lo 盯 2008 年增刊
2 .2 抑制二倍体鲍卵子第一极体和第二极体诱导
四倍体
采用通过抑制二倍体鲍卵子第一极体和第二极
体的方法诱导四倍体 , 由于要抑制住两个极体 , 故处
理持续时间很长 , 造成了畸形率极高 , 存活率很低;
另外从表 2 可以看出 , 由于处理起始时间都是大于
巧 ” , 在镜检中也发现 , 很多卵子有 1个极体或 2 个
极体 。 这至少表明这种方法和这种做法来诱导四倍
体是不可取的。
表 2
水温/℃ 处理起始时间
抑制二倍体鲍卵子第一极体和第二极体诱导四倍体的实验结果
处理持续时间 卵量/ * 1少 处理浓度/mg · L 一 ’ 四倍体率/%
2 ’3 0 ”
2
‘
3 0
"
l 5
巧
n01伟、,,1J.1内l9 ’3 0 即
1 0
’
2 0
n
2
’
3 0
即
2 ‘〕)n
11 ‘(X) , ,
1 3
’
3 2
“
0
.
1 5
0
.
1 5
l 5
l 5
气曰0哎、一2-1勺一内乙,‘,内、2 ‘o
即
1 3
’
(X)
“
,
3 0
“
,3 0
"
13
’
o
“
1 3
’
0 0
即
0
.
1 5
0
.
2 0
1 3
‘
(X)
巧
l0
0.15
0.20
0 .25
0 .25
1574062 ‘o " 1 3 ‘(X) 即
,
3 0
"
,
3 0
, ,
1 1
‘
0(}
I
1 1
’
o
"
7
’
3 0
即
9
’
0
1
"、0内、,‘
2 7
.
0 1 7 " 1 5 ‘0()
”
3 0 0
.
1 5 1 5
2
.
3 抑制三倍体鲍卵子的第一极体诱导四倍体
用三倍体鲍卵子并抑制其第一极体来诱导四倍
体的方法 , 与用二倍体鲍卵子并抑制其第一极体来
诱导四倍体的方法相同。 处理起始时间为 15 ”左右
的 ,其四倍体率较高;处理起始时间为为 20”以及超
过的 , 其四倍体率较低;处理持续超过 3 ’0 1 的 , 其畸
形率很高。 由于三倍体鲍卵子的卵径和体积明显比
二倍体鲍卵子大 , 因此在诱导处理时 , 卵量或浓度当
然有所不同。 处理起始时间应锁定在 巧 “附近较
佳。 任何推迟或提前都不利于抑制第一极体及胚胎
发育 。 当然精子浓度可适当地增加些 , 以利于受精 。
从表 3 可以看出 , 处理起始时间为 15 ” , 处理浓度为
0 .40 mg · L 一 ’ , 处理持续时间为 2 ‘30 ”的三个诱导
参数的组合 , 其四倍体诱导率最高。
2
.
4 用三倍体鲍的其它方法诱导四倍体
除了用三倍体鲍卵子抑制其第一极体来诱导四
倍体的方法外 , 还用三倍体鲍的其它方法诱导四倍
体的实验 ,并取得了较为满意的结果 。 因实验资料
不多 ,在此免述 。
2
.
5 四倍体鲍的培育和养成
截至 2以万年4 月抖 日, 在多批大小为 2.5 一 4 . 0
c m 的实验鲍苗中, 检测获得了2抖 个四倍体。 自此以
后 , 至 2(X 万 年 12 月 16 日之前 , 又检测获得了 巧 个。
即总共培育出存活的四倍体鲍23 9 个 , 大小为2.5 -
6.0 cm 。 因为是要用四倍体作为父本(或母本) , 与二
倍体杂交繁育三倍体的 , 因此经过多次的实验后四倍
体亲本难免损失很大。 2 (X) 5 年 4 月抖 日专家现场验
收了四倍体40 个 , 个体为 7.5 一 9 . 2 c m , 多数在 8.6 -
8.7 cm ;双刃5 年 12 月 16 日专家现场验收了四倍体 刀
个 , 平均体长 7.7 cm , 平均体重 69 .32 9。
年增刊 严正凛:九孔鲍四倍体诱导的研究 3 39
表 3 抑制三倍体鲍卵子的第一极体诱导四倍体的实验结果
水温/℃ 处理起始时间 处理持续时间 卵量/ * 104 处理浓度/m g · L 一 ’ 四倍体率/%
25301巧4j10月峥1工f内、件, 3 0 即
6
, ,
6
’
3 0
n
8
’
0
即
7
‘
4 5
即
5 ‘o
"
0
.
2 5
0
.
3 5
3
‘
3 0
即
3
’
3 0
1
l 0
l 0
0
.
3 3
0
.
3 3
3
’
o
”
3
’
1 0
”
l 0
1 2
0
.
3 0
0
.
3 0
1256()0SD703
’
(X)
, ‘
3
’
2 3
即
0
.
3 0
0
.
3 0
2
’
5 5
“
2
’
o
”
‘
3 0
即
,
3 5
,‘
2
’
1 0
”
2
’
o
”
2
’
3 0
, ,
睽理15’洲30军衅l2拟尸
2‘2 0 ”
3 讨论
3.1 抑制第一极体诱导四倍体
第一极体的抑制导致第二次减数分裂过程中染
色体分离复杂化 , 结果产生大量的非整倍体 , 影响胚
胎的孵化率和幼虫的存活率。 利用 CB 抑制了太平
洋牡砺第一极体的排出 , 发现除了产生一定比例的
三倍体(15 .6% ) 、 四倍体(19.4 % )以及少量的二倍
体(4.5% )胚胎外 , 还产生 了高 比例 的非整倍体
(57.6% ) , 其染色体数 目主要分布在 23 一 25 和 35
一 3 7 两个区域内[’6 J 。
利用抑制第一极体诱导四倍体的方法已在多种
贝类中做过尝试 。 自St an ley 等(1981) 第一次报导
利用 C B 抑制美洲牡砺受精卵第一极体释放产生了
四倍体后 , S t e p h e n 和 Downing ( 19 58 )利用 e B 处理
受精卵受精后 巧 一 30 m in 的太平洋牡砺卵 , 24 h 后
检测倍性发现大部分(91 % )是四倍体 。 G u 。 等利用
抑制极体释放的途径诱导太平洋牡砺四倍体 , 尽管
在诱导后的胚胎中通过染色体计数检测到了四倍
体 ,但这些四倍体不能成活到 D 型幼虫〔’‘] 。 Di t er
和 D听(19 90) 诱导的菲律宾蛤仔四倍体胚胎尽管
比率很高(65 % ) , 但却未成活到附着期 。 另外在紫
贻贝和皱纹盘鲍的三倍体诱导工作中同样也发现了
抑制第一极体同时产生 了三倍体和四倍体的现
象川 。 在近江牡砺和栉孔扇贝中也诱导出四倍体
胚胎 ,但以上研究均没有培育为成体[”〕。
3
.
2 抑制第一极体和第二极体诱导四倍体
同时抑制第一极体和第二极体的释放也可能产
生四倍体。 当两个极体都被抑制之后 , 受精卵中存
在五套染色体 , 精卵原核融合时有可能产生五倍体 ,
但有时由于两个原核融合不彻底也有可能产生 四倍
体或是其它倍性的胚胎 。 通过同时抑制第一极体和
第二极体释放这一途径 , 在地中海贻贝中得到了少
数存活至成体的四倍体仁”“。
3
.
3 利用三倍体贝类诱导四倍体
生物杖术通报 Bto te ch n ole gy 20 08 年增刊
这种方法利用三倍体贝类产生的卵子与正常精
子受精 , 然后抑制第一极体 , 可产生存活的四倍
体〔‘“] 。 利用二倍体直接诱导四倍体难度很大 。 通
过二倍体直接诱导产生的四倍体太平洋牡砺胚胎不
能成活的原因是由于较大的四倍体核在正常体积的
卵中卵裂造成细胞数目不足引起的。 在大多数贝
类 , 其发育属于嵌合型 , 即发育分化主要取决于形态
发生因子的分配分离和细胞分裂的次数 , 细胞数目
不足会使形态发生因子停留在一个细胞或胚胎缺乏
足够的细胞进行分化而终止发育。 这与四倍体鱼类
及两栖类是不同的 , 四倍体鱼类及两栖类的发育属
调整型 , 不受细胞数 目不足的影响 , 分裂球可相互作
用并调整其发育以补偿细胞数目不足 。
一般情况下 , 正常二倍体产生的卵子 ,其大小变
异不大 , 但三倍体产生的卵子却明显大于二倍体产
生的卵子 , 可能有利于产生生活力的四倍体。 平均
来看 , 三倍体牡砺产生的卵子直径 (5 .2林m ) 比二
倍体产生的卵子(47.8林m )大 15% , 体积增加 54%
。 基于这种可能性 , G uo 和 Al len 尝试了一种崭新的
思路和方法 , 即利用三倍体太平洋牡砺的卵与正常
精子受精后 , 以 C B 处理抑制其第一极体的排放 , 首
次成功地获得了可存活的四倍体太平洋牡砺[z0 ]。
对受精卵的细胞学研究表明 , 四倍体的产生是
抑制第一极体后的受精卵在第二次减数分裂过程中
发生了联合二极分离的结果[川 。 这种方法诱导产
生的四倍体可以成活并可以达到性成熟 , 与正常的
二倍体杂交可以产生 10 % 三倍体[’〕, 在生产实践
上具有较高的应用价值 。
3
.
4 成体的倍性检测
本试验养成鲍的倍隆采用多倍体分析仪检测 。 多
倍体分析仪倍性检测法是用对 D NA 一RN A 具有特异性
的荧光染料对细胞核进行染色。 细胞解离制成悬液
后 , 用激光激发 , 然后通过细胞荧光分析仪的光敏区 ,
其荧光强度就会被显示出来 。 荧光强度与细胞的 D NA
含量成正比 , 可以反映出被测细胞群体的 DNA 相对含
量〔川 。 图 1、图 2和图3 分别表示二倍体、三倍体和四
倍体九孔鲍的 D NA 相对含量。 图中的 M ean 值 , 表示
的是 DNA 相对含量 。 图 1 的 Me an 值为87 .卯 , 为ZN ,
而图2 的Me an 值为12 .75 , 图3 的Me an 值为 173 .02
则分别接近于 3N 和4N 。 由于多倍体分析仪不能准确
检测出 DN A 含量的细微变化 ,检测出的整倍体个体有
可能包括非整倍体[” ] 。
下, . . 卜‘母的 d 以峨 卜, 咚. 们鑫鑫韶兮 召乳韶 :若羚 丢兴。
图 1 二倍体九孔鲍的 DN A 相对含t
Fig.1 R elative eontentof D NA Of diPloid ab al one
年增刊 严正凛:九孔鲍四倍体诱导的研究 34 1
户. 已卜 电n d . )毛1 了 n O O2 2 礴日日 绪下。 它. ! C 。 切 r、t , 3 石 , 1 2 2 7 6 撇 人 r. 吸%5 0 闷e 6 . 3 2
1 0 0
图2
沪, 内卜~
~ r ~ 户人~ ~钾.广铸扫确一r一 一 , . , ~ , 一一价 , ~2 吕 0 3 0 0 3 石0 4 0 0 闷 S O F 飞门 1 弓幻 O
.
;
J!
;
j于不车。
弘
三倍体九孔鲍的 D N A 相对含t
Fig.2 Relative eontentof D NA of tri ploid ab alone
门r o 峨妇. (二。。 n 七 1 1 2 6 2
「、臼O 卜 rn d . 火
, , 0 0 0
r 门 0 心口J , 人 ro . ^ r. 。, 星
j ? 3 0 份 0 , 7 0 夕了 8 7
1 0 0
石O
0 臼O , 0 0 生石0 2 Q O 2 佑0 3 0 0 4 5 0 俨1 侣0 0
图3 四倍体九孔鲍的 D N A 相对含量
Fig.3 Relative eontentof D NA of tetra Ploid ab al one
经检测 , 四倍体鲍与二倍体杂交 , 不论是正交还
是反交 , 繁育出的子一代都是 10 % 三倍体。
参 考 文 献
1 杨蕙萍 , 郭希明.青岛海洋大学学报 , 1 9 97 , 2 7 ( 2 ) : 1 6 一 17 2.
2 何毛贤 , 沈琪 , 等.水产学报 , 2 仪刃 , 24 ( 1 ) : 2 一 27 .
3 姜卫国 , 林岳光.热带海洋 , 1 9 9 8 , 1 7 ( 2 ) : 4 5 一 5 1 .
4 胭华勇 , 张国范 , 等.海洋与湖沼 , 2 0 3 , 3 4 ( 6 ) : 6 5 6 ~ 6 62 .
5 G
u o
X
,
D
e
B
ros
se G
, e t al
.
A q
u a e
ul t
u
re
,
1 9 9 6
,
1 4 2
:
1 4 9
一 1 6 1
.
6 王昭萍 ,李慷均 , 等.中国海洋大学学报 , 2 (X) 4 , 3 4 ( 2 ) : 1 95 一 20 2 .
7 孙振兴 , 王在卿.青岛海洋大学学报 , 1 9 98 , 1 : 63 一 69 .
8 吴宝铃 ,等.贝类繁殖附着变态生物学【M 〕.济南:山东科技出版
社 , 1 9 9 9 .
9 曾呈奎 , 等.海洋生物技术仁M 〕.济南:山东科技出版社 , 19 98 .
1 0 A l l
e n
S K
,
J
r
Sh
p i罗I M , e t al . A q u a e u l t u re , 1 9 9 4 , 1 2 8 ( l 一 2 ) : 1 3
l l
l 2
1 3
l 4
1 5
l 6
l 7
1 8
~ 1 9
.
田传远 , 赵厚均.黄渤海海洋 , 1 9 9 , 1 7 ( 2 ) : 75 一 82 .
严正凛 , 江宏 , 等.海洋通报 , 1 9 9 7 , 1 6 ( 6 ) : 2 0 一 2 6 .
严正凛 , 江宏 , 等.台湾海峡 , 1 9 9 9 , 1 8 ( 3 ) : 3 3 7 一 3 4 1 .
严正凛 , 陈建华 , 等.台湾海峡 , 2 0 1 , 2 0( 1 ) : 巧 ~ 19.
严正凛 , 陈建华.水产学报 , 2 0 2 , 2 6 ( 1 ) : 54 一 60 ·
X G
u o ,
K C o p
e r , e t al
.
B i
o
l
.
B
ul
,
1 9 9 2
,
1 8 3
:
3 8 1
一 3 8 6
.
郭希明等.海洋生物技术新进展【M 〕.北京: 海洋出版社 , 1 9 9 .
S
e 呷aJ, K T W ad a . e t al . B u l l J 叩 Soc Seien断e Fisheries , 1 9 9 3 ,
5 9
(
1 2
)
:
2 0 1 7
一 2 02 3
.
G U O X , 5 K A L L E N J R
.
M
o
l M ar B i
o
B i
o t e e h
,
1 9
94
,
3
(
1
)
:
4 2
-
5 0
.
Q
u e
H
.
G
u o
X
, e t al
.
B i
o
l B
u
l
,
1
9
7
,
1 9 3
:
1 4
一 1 9
.
巩宁 , 张国范.海洋科学 , 2 以洲) , 2 4 ( 9 ) : 17 一 18 .
0
山‘i
2,